cDNA芯片技术筛选斑马鱼皮肤免疫相关差异表达基因_吕爱军

免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：

病毒性病害防治药剂大汇总

病毒性病害防治药剂大汇总 病毒性病害是农作物病害中一类特殊的病害，具有病情复杂、难以防治的特点，号称“植物癌症”，其主要症状类型有花叶、变色、条纹、枯斑或环斑、坏死、畸形等。常见的病毒性病害有烟草花叶病毒病、番茄花叶病毒病、辣椒花叶病毒病、小麦花叶病毒病、水稻黑条矮缩病、番茄病毒病、烟草病毒病等。这类病害危害大、分布广、无特效农药，近年来，围绕着香菇多糖、葡聚烯糖、寡聚酸碘、氨基寡糖素、盐酸吗啉胍、宁南霉素等成分开发防治病毒性病害的制剂成为开发的热点。 表 1 常见的防治病毒性病害的已登记的农药产品 香菇多糖主要是从伞菌科真菌香菇的子实体中提取纯化得到的β-1,3-葡聚糖，为香菇的重要药用成分，于1968年首次提纯获得。 1.1 理化性质

棕色液体，无可见悬浮物和沉淀；密度(20℃)1.13g/mL；不可燃；对包装材料无腐蚀性；无热爆炸性；闪点＞150℃；pH：4.0～6.0，稀释稳定性(稀释20倍)合格，低温稳定性和热贮稳定性合格，常温2年贮存稳定，不能与碱性物质混用。 研究表明，香菇多糖的主链和侧链的有序构象是单一螺旋构象，胶体结构的结合区域会形成多螺旋构象，其立体结构为右手心三度螺旋，晶格为六角形。香菇多糖的一级结构具有β-(1→3)连接的吡喃葡聚糖主链，在主链中葡萄糖的C6位上含有支点(每5个葡萄糖有2个支点)，其侧链是由β-(1→6)键和β-(1→3)键相连的葡萄糖聚合体组成，在侧链上也含有少数内部β-(1→6)键的葡聚糖。 1.2 毒性 10%香菇多糖母药和1%香菇多糖水剂大鼠经口LD50雌雄性动物均＞4 640 mg/kg；大鼠经皮LD50雌雄性动物均＞2 000 mg/kg；对家兔皮肤、眼均无刺激性；豚鼠皮肤变态反应(致敏性)试验未出现红斑、水肿及其他皮肤过敏症状，按照我国农药致敏率强度分级标准评定为弱致敏物。1%香菇多糖水剂属低毒杀菌剂。环境生物安全性评价：10%香菇多糖母药对蜜蜂急性触杀毒性LD50＞80.00 μg/蜂，为“低毒级”；对蜜蜂经口毒性LC50(4 8h)＞2.00×103 mg/L，为“低毒级”；对斑马鱼急性毒性LC50(96 h)＞100 mg/L，为“低毒级”；对家蚕急性毒性LC50(96 h)＞2.00×103 mg/L，为“低毒级”；对

量子点免疫层析检测技术

量子点免疫层析检测技术方兴未艾 免疫层析技术是一种快速、简便、灵敏、直观、价格低廉、可真正实现现场检测的检测方法。具有很多气相色谱、高效液相色谱、气质联用色谱、液质联用色谱、毛细管电泳等仪器检测方法以及其他传统方法无法企及的优点。在检测领域中处于特殊重要的地位，同时也是传统检测和仪器检测的良好补充。尤其在经济高速发展，生活水平提高的今天，人类重大疾病，环境污染，食品安全等问题日益受到极大的关注，让免疫层析检测技术更具有巨大的潜力和蓬勃的生命力。 目前，免疫层析产品主要为胶体金免疫层析试纸条，其最早应用于医学检验，在早孕检测中的应用取得了极大的成功，随后在各个领域迅速渗透漫延，其在毒品检测、环境检测、以及食品安全检测领域得到了迅速的发展，但是又出现新的问题，在很多方面，尤其是食品安全检测领域，有些农兽药残留限度极度苛刻，甚至要求0.1 ng/ml的检测限度，同时食品类物质如肉类、禽类、果蔬、谷物等成分复杂，前处理难度也很大，造成胶体金免疫层析检测灵敏度无法胜任。除了进一步提高前处理方法以外，寻求高灵敏度的免疫层析方法也显得尤为重要。 量子点是近20 年来发展起来的半导体纳米晶材料，因为它的优良特性，受到了很大的关注，并且已经显示出一定的潜力，近几年来从细胞标记等应用已逐渐开始向多个领域的检测与诊断方向渗透。 一、量子点特性 量子点(简称QDs,又称半导体纳米粒子)是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～V族元素组成的，半径小于或接近于激光玻尔半径，能够接受激发光产生荧光的一类半导体纳米颗粒，其中研究较多的主要是CdX(x=S、Se、Te)，直径约为2nm-6nm。量子点由于存在显著的量子尺寸效应和表面效应，从而使它具有常规材料所不具备的光吸收特性，使其应用领域越来越广泛，特别是其在免疫生物学和临床检验学等研究中的潜在的应用价值，已引起了广大科学工作者的极大关注，发光量子点作为荧光试剂探针标记生物大分子，正是近年来迅速发展的纳米材料在生物分析领域的重要应用之一。与普通的荧光染料相比较，量子点具有以下特点： (1) 有机染料荧光分子激光谱带较窄，每一种荧光分子必须用合适能量的光来激发，而且产生的荧光峰较宽，不对称，有些拖尾。这给区分不同的探针分子带来困难，很难利用有机染料分子同时检测多种组分。量子点由于量子限域效应使其激发波长的范围很宽，可以被波长短于发射光的光(一般短10nm以上)激发，并产生窄(半波宽约13nm)而对称的发射光谱，从而避免了相邻探测通道的串扰。 (2) 量子点具有“调色”功能，不同粒径大小的量子点具有不同的颜色，激发量子点的激发波长范围很宽，且连续分布，所以可以用同一波长的光激发不同大小的量子点而获得多种颜色标记，是一类理想的荧光探针。 (3)量子点的荧光强度强，稳定性好，抗漂白能力强，Chan和Nie通过实验证明ZnS包覆的CdSe比罗丹明6G分子要亮20倍和稳定100-200倍，可以经受多次激发，且标记后对生物大分子的生理活性影响很小，因此为研究生物大分子之间的长期作用提供了可能。

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织得采集、固定与保存: 采取组织后, 方法一:4％多聚甲醛(4％ＰＦＡ)4?Ｃ固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜 方法二:采用boｕｉn’s固定ＲT 2h(6—8dｔeｓis)or RＴ过夜(成年tesiｓ) PBS缓冲液洗三次,每次5ｍin,4?C保存于7０%乙醇中。 ２、组织得包埋、切片、展片及保存:: 固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,５2－54?C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—１０μm,贴于处理过得干净载玻片上,37?C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。 石蜡包埋: 保存于４?Ｃ70％乙醇中得组织样品 ↓ 80％乙醇1５ｍin ↓ 95%乙醇15 miｎ ↓ 1０0%乙醇15mｉｎ? 2 ↓ 1/2乙醇１／２二甲苯15 ｍin ↓ 二甲苯透明5-１0 min ↓ 1／２二甲苯１/2石蜡３0 min

↓ 石蜡(1) 1。5hｒ ↓ 石蜡(2) 1.5－２.5hr ↓ 石蜡(3) 包埋 ↓ RT保存 3、石蜡组织切片得免疫组化方法: 密封保存于RT得组织切片 ↓ 二甲苯(1) 20 min ↓ 二甲苯(2)20ｍin ↓ 100％乙醇20ｍin ↓ 95％乙醇10 min ↓ 8０％乙醇10miｎ ↓ 通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈 ↓ 切片在ＰBS中浸泡 5 ｍin＊2 ↓ 0.4%Tritonx RＴ10 mｉn ↓ 切片在PＢS中浸泡 5 min＊3 ３％H２O2 RT １０ｍin

切片在PBS中浸泡５ｍｉn*3 0、25％胰酶RT １0min 切片在PBS中浸泡 5 min*３ Blocking bｕｆfｅr(3%BSA+5%NGS＋０、2%Ｔritｏnx—１０0 in PBS) ＲT 60mｉn 倾去blｏｃking buffｅｒ,勿洗 一抗4 C overnighｔｉn blｏckinｇbuffeｒ 取出切片复温1h,切片在PBＳ中浸泡 5 mｉn*３ 二抗iｎblocking ｂufｆer GＡR1:２00 (GＡM1:100),R Ｔ 1h 切片在PBS中浸泡５min*3 DAB显色５—１0min(５0微升A＋５0微升B＋９0０微升ＰBS+5微升3％H2Ｏ2) 如果就是增强型DＡB只要1ｍｉn即可。 切片浸入PBS终止显色,ＨE衬染1s, 玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15mｉn,肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。 若颜色太深,可用0、１-０、5％盐酸乙醇分色1～2秒钟(或更久)

内参基因βActin简介

内参基因βA c t i n简介标准化管理部编码-[99968T-6889628-J68568-1689N]

内参基因β-Actin简介 日期：2012-05-03来源：未知作者：周慕云点击：次 β-Actin 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的PCR内参有GAPDH 、β- actin 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等。 β-Actin简介 Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin; 其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。不同的actin之间同源性大于90%，但在N-terminal同源性仅50%-60%，因此N-terminal常被用作actin的抗原。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。 β-Actin用途 β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数。内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的蛋白质内参有细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin和GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)等。因此β-Actin

文献综述-斑马鱼及其应用

斑马鱼及其研究应用 作者：杜颖指导老师：张源淑 摘要：斑马鱼作为一种新兴的重要模式动物之一，体外受精、胚胎透明，因此可在显微镜下直接观察发育过程及检测药物引起的内脏组织变化，在生命科学领域中应用前景十分广阔。斑马鱼体型小,适合高通量研究,还具有生长繁殖周期短及其与人类高度相似的基因组等优点，已经广泛用于人类疾病模型的建立、新药研发和药物的筛选，此外，斑马鱼还被应用于毒理学、发育生物学和遗传学等的研究。因为斑马鱼对污染物反应灵敏，现已用于监测环境污染物及污水检测。本文主要从几个方面对斑马鱼的研究进展进行了整理和归纳。 关键字：斑马鱼模式动物科学研究发育感染药物 Zebrafish and Its Application Abstract:Zebrafish as an important model animal emerging, its in vitro fertilization, transparent embryo, internal organs can be directly observed during the development and testing organ change caused by drugs under the microscope, has very broad application prospects in the field of life sciences. zebrafish also has a live, high-throughput, growth and short reproduction cycles and highly similar to the human genome, etc., it is widely used in modeling human diseases, drug screening, and secondly, zebrafish also is applied in toxicology research, developmental biology and genetics, etc.. Because of its sensitivity, it has been used to monitor environmental pollutants and water testing.This paper mainly from several aspects of zebrafish research progress has been collated and summarized Key words:zebrafish Animal models Scientific research Development Infection Drug 斑马鱼(Danio rerio)又名蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼、印度斑马鱼,产于孟加拉、印度东部、巴基斯坦、缅甸、尼泊尔等地,是一种常见的热带淡水硬骨鱼。属辐鳍鱼纲( Actinopterygii)鲤科( Cyprinidae)。斑马鱼身体细长,呈纺锤形，成鱼体长约4-6cm,因全身布满深蓝色条纹似斑马样而得名。斑马鱼雌雄鉴别容易,雄鱼体型细长，颜色偏黄，条纹较为显著，纵纹为柠檬色；雌鱼身体肥胖，颜色较淡，纵纹呈蓝色加银灰色，在性成熟后腹部肥大。雌鱼每次可产卵300多枚，鱼卵易收集，其胚胎透明,繁殖能力强且生长发育速度快，对饲养要求低，可高密度饲养，与其他实验动物相比有很大优势，是一种非常受欢迎的实验动物模型。近三十年来，已有约20个斑马鱼品系的基因数据库资料，全球已有超过1500个斑马鱼实验室，而我国也有超过250个实验室利用斑马鱼开展相关研究。英国桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）于2013年完成了斑马鱼的参考基因组，研究人员在此基础上比较了斑马鱼与人类基因组的异同，并进行了系统性的全基因组分析.在此综合近几十年的研究，在胚胎及遗传发育学、基因组学、药物筛选、疾病模型的建立等方向探讨斑马鱼的研究成果及进展。 1.胚胎及遗传生物学方向 斑马鱼的发育分为6个阶段：卵裂期，囊胚期，原肠胚期、分裂期、成形期

免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。

由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好

常见内参基因

β-A c t i n Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。同时Actin在细胞分泌、吞噬、 β-Actin 移动、胞质流动和胞质分离等过程中起重要作用。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletalmuscleactin，α-cardiacmuscleactin，α-smoothmuscleactin，和 γ-smoothmuscleactin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin(β-non-muscle)和 γ-non-muscleactin。不同的actin之间同源性大于90%，但在N-terminal同源性仅50%-60%，因此N-terminal常被用作actin的抗原。β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。 β-Actin用途 β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是WesternBlot很好的内参指数。内参即是内部参照（InternalControl），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的蛋白质内参有细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin和GAPDH （glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）等。因此β-Actin抗体、β-Tubulin抗体以及GAPDH抗体成为最常见的三个动物细胞内参抗体。β-Actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富。Beta-actin 由375个氨基酸组成，分子量大小为42-43kDa左右。 β-actin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微丝结构。在用作Western的参照时，Actin抗体和Tubulin抗体的主要不同之处在于两者所识别蛋白的分子量不同，这样可以选择合适的参照在同一块胶同一张膜上实现同时检测目标蛋白和参照蛋白。 GAPDH GAPDH或G3PDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）的英文缩写。该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。该酶基因为管家（housekeeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提totalRNA，poly(A)+RNA，Westernblot等实验操作的标准化的内参。 GAPDH结构图

最新生物学常见模式生物资料

模式生物 生物学家通过对选定的生物物种进行科学研究，用于揭示某种具有普遍规律的生命现象。此时，这种被选定的生物物种就是模式生物。比如：孟德尔在揭示生物界遗传规律时选用豌豆作为实验材料，而摩尔根选用果蝇作为实验材料，在他们的研究中，豌豆和果蝇就是研究生物体遗传规律的模式生物。由于进化的原因，许多生命活动的基本方式在地球上的各种生物物种中是保守的，这是模式生物研究策略能够成功的基本基础。选择什么样的生物作为模式生物首先依赖于研究者要解决什么科学问题，然后寻找能最有利于解决这个问题的物种。19世纪末20世纪初，人们就发现，如果把关注的焦点集中在相对简单的生物上则发育现象的难题可以得到部分解答。因为这些生物更容易被观察和实验操作，因此，除了在遗传学研究外，模式生物研究策略在发育生物学中获得了非常广泛的应用，一些物种被大家公认为优良的模式生物，如线虫、果蝇、非洲爪蟾、蝾螈、小鼠等。 随着人类基因组计划的完成和后基因组研究时代的到来，模式生物研究策略得到了更加的重视；基因的结构和功能可以在其它合适的生物中去研究，同样人类的生理和病理过程也可以选择合适的生物来模拟。 目前在人口与健康领域应用最广的模式生物包括，噬菌体、大肠杆菌、酿酒酵母、秀丽隐杆线虫、海胆、果蝇、斑马鱼、爪蟾和小鼠。在植物学研究中比较常用的有，拟南芥、水稻等。随着生命科学研究的发展，还会有新的物种被人们用来作为模式生物。但它们会有一些基本共同点： 1）有利于回答研究者关注的问题，能够代表生物界的某一大类群； 2）对人体和环境无害，容易获得并易于在实验室内饲养和繁殖； 3）世代短、子代多、遗传背景清楚； 4）容易进行实验操作，特别是具有遗传操作的手段和表型分析的方法。 背景 早在20世纪最初的20年中，甚至更早到19世纪，人们就发现，如果把关注的焦点集中在相对简单的生物上则发育的现象难题可以得到部分解答。因为这些生物的细胞数量更少，分布相对单一，变化也较好观察。由于进化的原因，细胞生命在发育的基本模式方面具有相当大的同一性，所以利用位于生物复杂性阶梯较低级位置上的物种来研究发育共通规律是可能的。尤其是当在有不同发育特点的生物中发现共同形态形成和变化特征时，发育的普

斑马鱼动物模型的应用介绍

斑马鱼动物模型的应用 斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。 斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。 一、斑马鱼的品系 经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。 二、斑马鱼突变品系的筛选 斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。插入诱变是以逆转录病毒为载体，用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼受精卵，整合到基因组中，干扰正常基因表达。射线照射产生的突变率是ENU 化学诱导的10倍，但由于突变涉及多个基因，突变的表型是受若干基因调控的结果，不利于基因功能的分析，因此，ENU化学诱导法是斑马鱼突变的主要方法。研究含有纯合致死

细胞免疫荧光步骤

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1 －2分钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿） 里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数 依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上 去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没 有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法 合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则 是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔 细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

免疫荧光方法

（2）实验方法 （1）用PBS浸洗准备好的细胞涂片3次，每次3min。 （2）0.1%的TritonX-100（用PBS配制）处理涂片5-10min。 （3）PBS洗净载玻片上的TritonX-100，加0.1%的牛血清白蛋白BSA溶液(用PBS 配制)孵育固定好的细胞30min。 （4）弃去BSA，滴加0.1%BSA稀释的一抗(1:200)，即软骨多糖诱导48hH22细胞免疫的小鼠血清，免疫湿盒中4℃过夜。同时用正常小鼠血清作对照。 （5）用PBS浸洗细胞涂片3次，每次3min，以确保一抗清洗彻底。 （6）避光条件下滴加BSA稀释的荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:200)，然后室温、暗室中孵育1.5-2h。 （7）PBS洗净荧光二抗，用荧光显微镜观察。 为了防止由于一抗未洗净带来的假阳性现象，实验中同时设置一组阴性对照，涂片染色操作步骤同上，把一抗换成PBS。 3.4.1.1免疫荧光染色法检测抗原、抗体结合情况将H22鼠肝癌细胞制成细胞涂片，分别以空白组小鼠血清、模型组小鼠血清和免疫组小鼠

血清为一抗，经荧光二抗染色后得到免疫荧光检测结果，并计算各组细胞的阳性表达率，结果如图3-1所示。 (a) (b) (c) (d)*P<0.01vs模型 组,#P<0.01 vs空白组图3-1免疫荧光染色法检测抗体生成 Fig.3-1 Theimmunofluorescent staining for antibody test图3-1中(a)、(b)、 (c)一抗分别为空白组小鼠血清、模型组小鼠血清、免疫成功小鼠血清， (d)为免疫荧光阳性表达率。从图3-1中可以看出，一抗为空白小鼠血清的荧光极弱，一抗为模型组小鼠血清的荧光仍然不强，而一抗为治

内参基因1

内参基因 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达 水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差， 保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样 半定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改 变的基因作内参。 在进行基因研究的过程中,实时反转录 PCR也和传统的mRNA定量方法如 Northern b lot技术等一样, 要求使用参照基因以校正转录效率和 cDNA用量, 弥补制备过程中样本 纯度和浓度的差别, 使不同样本之间目的基因的比较成为可能,以期获得真实可靠的结果。大多数分析方法中这些差别可通过与内参照比较处理消除。最普通的内参照是内 源性参照基因,也叫管家基因。 管家基因：又称持家基因(house-keeping genes)生物体各类细胞中都表达，其产物 是对维持细胞基本生命活动所必需的蛋白质编码的基因。如微管蛋白基因、糖酵解 酶系基因与核糖体蛋白基因等。是为维持细胞基本生命活动所需而时刻都在表达的 基因。 管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、 或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA 聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。管家基因高度保守并且在大多数 情况下持续表达，因此管家基因常被用于分子技术--多位点基因分析。 内参基因通常是各种看家基因，在细胞内组成稳定性表达，有助于保持细胞的 功能。理想的内参基因应该满足以下条件：1, 不存在假基因（Pseudogene），以 避免基因 DNA的扩增； 2,高度或中度表达，排除低表达； 3,稳定表达于不同类型 的细胞和组织（如正常细胞和癌细胞），而且其表达量是近似的，无显着性差别； 4,表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；5, 其稳定的表达水平与目标基因 相似；6, 不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响. 近年来的研究发现：这些常用内参基因均存在缺陷，在不同类型的细胞和组织 细胞增殖和器官发育的不同阶段体外培养各种实验条件等情况下它们的表达量通 常变异较大。正确的选择内参基因, 很大程度上依赖所研究的细胞或组织, 不同的试验 需要寻找适合各自试验体系的特异性稳定表达的内参基因。然而,合适内参基因的选择, 需要在各种类型的细胞或组织和各种试验条件下进行比较选择。理想的内参基因应在 各种试验条件下,各种类型的组织和细胞中均恒定表达,而且其表达量是近似的,无显着 性差别。另外要求不存在假基因以避免基因组的扩增。

斑马鱼常见疾病

斑马鱼常见疾病 烂鳍病/病尾病（嗜水气单胞菌） 多由饲水不良，水质长期浑浊，受新水刺激过多，或鱼儿互相撕咬导致细菌感染。感染的迹象: 最初，鳍的边缘出现轻微的不透明的外观。然后膜一片片地脱落，暴露出鳍刺，鳍刺开始依次裂开。当裂缝到达身体时，受侵害的鱼通常都会死亡。感染详述: 引起烂鳍病的细菌可能经常出现，特别是嗜水气单胞菌，荧光假单胞菌和鳗弧菌，它们只在恶劣的环境里侵害不健康的鱼。这些细菌能引起一系列的症状，如斑点、区域发炎和溃疡。细菌传染引起的损伤使受侵害的鱼容易受到来自其他病原体如真菌、病毒和寄生虫的侵害。 推荐的治疗方法: A，在100千克的水中放呋喃西林粉0.2克进行浸洗消毒，多次用药后可缓解病情。 B，在100千克水中放痢特灵3~5片，浸洗病鱼30分钟。 C，在100千克水中放土霉素5~8片浸洗消毒，可预防感染此病。 D，用低浓度的高锰酸钾溶液浸洗消毒。 E，用庆大霉素浸洗，在100厘米X50厘米X35厘米的水族箱中放2支。 对于如此多的疾病，除非环境条件很满意，任何化学药物治疗都不是完全有效的。有几种以苯氧基乙醇、聚-氯-苯氧基乙醇或呋喃那斯为基础的专用处理剂，假如治疗不被耽误的话，它们可能有效。杀菌的化学药物如氯化苯甲烃胺（新洁尔灭），也能使用。对于冷水鱼类的治疗，水温至少应该升高到16度。 对付烂尾如果一时找不到鱼药，可到药店去买泻痢停（肤腩睉酮），找一小缸药浴，40CM缸加8片（慢慢搓溶于水），同时充气。若是热带鱼将水温升到30摄氏度，隔天补加一半药片，效果极佳。一般一周内会康复。 烂鳃病 患烂鳃病多由寄生虫寄生或细菌感染引起，故有寄生虫烂鳃病和细菌性烂鳃病两种。 （1）寄生虫烂鳃病：其病原体是指环虫或车轮虫，它们交互感染，鳃部明显浮肿，鳃盖张开困难，严重时，鳃丝局部溃烂，以至鳃软骨外露，鱼体呼吸困难，最终死亡。防治方法：可选用晶体敌百虫0.5-0.8克，放在10千克水中，浸洗病鱼10-15分钟。也可选用晶体敌百虫0.2克、硫酸铜0.2克、亚硫酸铁0.2克，混合放入10千克水中，浸洗病鱼10-15分钟。或选用晶体敌百虫0.2--0.3克溶于水中，泼洒在1吨饲水中，每周用药1-2次，可有效杀死水中的寄生虫。（2）细菌性烂鳃：其病原体是水霉菌,病鱼鳃丝严重失血,鳃丝发白,严重时有絮状菌丝粘附,死亡率极高。防治方法：可选用食盐50克、小苏打50克，混合放在10千克水中，浸洗病鱼15-20分钟。也可选用0.7克孔雀石绿，放在100克水中，浸洗病鱼15-30分钟。 （3）粘孢子虫性烂鳃：其病原体是粘孢子虫，鳃丝会出现许多肉眼可见的灰白色点状或胞囊，由小变大破坏鱼鳃，当胞囊一旦破裂，无数个孢子虫进入饲水，重新侵入健康鱼的鳃部，鳃丝失血导致大批死亡。粘孢子虫引起的烂鳃病比较少

免疫荧光双标法

免疫荧光双标记在心肌石蜡切片中的应用 陈绪军肖明第吕志前卢成宝薛松袁忠祥徐根兴 作者单位：200080 上海市第一人民医院心血管外科 细胞性心肌塑型术（cellular cardiomyoplasty）用于缺血性心肌病的治疗受到人们越来越多的关注［1］，在证实移植的人干细胞在缺血/损伤的环境中分化为人心肌细胞方面，免疫荧光技术的运用逐渐增多，但多用的是新鲜冰冻切片，在石蜡心肌切片中应用较少，而且多是单一抗原的荧光标记［2］。有研究表明，酪胺信号放大( tyramide signal amplifications, TSA)技术可以提高反应的灵敏性［3］。为此，我们以人心肌石蜡切片标本为例，运用TSA－免疫荧光法与常规间接免疫荧光法分别对人心肌连接蛋白(connexin-43，Cx-43)蛋白及肌凝蛋白（myosin）进行标记，旨在为心肌石蜡切片建立一个免疫荧光双标记的方法。 一、材料与方法 1. 主要试剂：兔抗人肌凝蛋白（myosin）多克隆IgG抗体购自美国Chemicon 公司，标记异硫氰酸酯荧光素（FITC）的驴抗兔多克隆IgG抗体与标记有辣根过氧化物酶（HRP）的驴抗小鼠多克隆IgG抗体均购自美国Jackson Immunity 公司, 小鼠抗人Cx-43单克隆抗体、碘化丙啶(PI)与牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma 公司，酪胺 (tyramide)-coumrian 结合物试剂盒购自美国PerkinElmer公司。 2．标本的取材、固定、切片及抗原修复: 人心肌取自一例6岁先天性心脏病小孩右房耳，中性福尔马林固定，4°C过夜固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5 μm石蜡切片。石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精浸泡后行抗原修复：浸入0.01 mol/L的柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中，95℃，浸泡30 min, 室温冷却10 min。 3．Cx-43的免疫荧光标记：采用TSA-免疫荧光法［4］，按试剂盒说明书进行。磷酸盐缓冲液（PBS）室温洗涤2次，每次5 min。置入3% 过氧化氢/甲醇溶液中，室温，孵育10 min。再室温PBS洗涤3次，每次5 min。 3%的BSA室温孵育30 min。加入小鼠抗人Cx-43单克隆IgG抗体，4℃孵育过夜。TnT缓冲液（0.1 mol/L Tri-HCI, pH 7.5, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% 吐温-20）室温洗涤3次，每次5 min。加入标记有HRP的驴抗小鼠IgG抗体，室温孵育1 h。TnT液室温洗涤3次，每次5 min。配制酪胺-coumrian 工作液：将酪氨-coumrian 结合物加入放大缓冲液中配成酪胺-coumrian 工作液（1∶50），避光，室温孵育15 min。再次TnT液洗涤3次。 4． Myosin的免疫荧光标记：接上一步。采用间接免疫荧光法［5］。兔抗人肌凝蛋白多克隆IgG抗体（1∶20）， 37°C孵育1 h，PBS洗涤3次。加入标记FITC的驴抗兔多克隆IgG抗体(1∶100)，避光，室温孵育1 h。PBS室温洗涤3次，每次5 min。 5．PI染细胞核：加入碘化丙啶（PI/PBS，1 μg/ml），室温避光孵育3 min。PBS室温洗涤3次后甘油封片。 6．荧光显微镜观察：运用带有3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜镜检：绿通道中观察FITC信号；蓝通道中观察coumrian信号；红通道中观察PI信号。图像的编辑采用Advanced SPOT 软件。 二、结果 在3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜中红、绿、蓝通道中分别可以观察到PI、FITC 及coumrian的信号，再经Advanced SPOT 软件叠加得到图1~4，红色代表PI标记的人心肌细胞核，绿色代表FITC标记的人心肌肌凝蛋白蛋白，蓝色为coumrian标记的人心肌Cx-43蛋白。图1显示为未加myosin抗体而加Cx-43抗体的人心肌石蜡切片; 图2中均加myosin 抗体与Cx-43抗体; 图3中加myosin抗体而未加入Cx-43抗体；图4均未加入 myosin抗体与Cx-43抗体。 三、讨论 1.心肌石蜡切片的免疫荧光双标记：在本研究中，图1与图2相比，人心肌石蜡切片中，不加myosin抗体的心肌纤维不着色，而加了myosin抗体的心肌纤维呈绿色，这表明心肌纤维被成功地标记上抗人myosin抗体，而且特异性高。Cx-43蛋白位于心肌细胞的周围，在本研究中由图1、图2与图3可以观察到，加Cx-43抗体的人心肌Cx-43蛋白呈

内参基因

何为内参基因 1、我记得常用的就是[color=magenta]GAPDH[/color]（3-磷酸甘油醛脱氢酶）和actin，至于什么是内参，可以打个比方，比如我们要比较两个不一样大的西瓜的含糖量，不好直接比较，那就找他们都有的东西来比较，就拿西瓜子嘛，假设西瓜子是均匀分布的，而且随着西瓜的变大，糖分的增多，西瓜子也变多，那么这个西瓜子就可以作为内参了！ 不知比方准确否，请高手指教，共同进步！ 2、内参基因一般会选管家基因，是维持细胞基本代谢活动所必须的基因，在各组织和细胞中的表达相对恒定，如：GAPDH、Actin、18S rRNA等 3、内参基因,表达稳定，通常用的有GAPDH,beta-actin，18s rRNA等 内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。 借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。 一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。 4、半定量RT-PCR和qPCR都需要内参，简单的说内参就是在你的那个培养条件下恒定表达的某个基因。做内参就是以内参引物PCR扩增该内参基因，看在你选定的几个时间点是不是都恒定表达，如果恒定才能说明你做PCR选的RNA（一部发RT-PCR）或cDNA(两步法RT-PCR)的量是等量的，这样比较你的目的基因的丰度才有意义。 内参是相对的，不是绝对的，因为内参基因有时会受到影响。 量PCR问题--绝对定量与相对定量有什么区别？ 绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。举例来说，如果研究项目中包括处理过的和未经处理的对照样本，通常可以将未经处理的样本指定为基准，规定其目的基因浓度为100%，将经处理的样本的定量结果除以对照样品的定量结果，就可以计算各个处理样本的基因含量相对于未处理样品的百分比。 绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。 相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。 CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比，其计算公式是 绝对定量的数据易于理解，但是绝对标准品的制备和测定其DNA含量比较困难。有许多商业性的标准品试剂盒供选购，可以解决这种困难。相对定量的标准品容易在实验室里自己制备，但是数据处理比较麻烦，对实验数据的解释有一定难度。