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电镜练习题及参考答案

一、电镜练习题及答案

一、透射电镜标本取材的基本要求并简要说明。

答:取材的基本要求如下:

组织从生物活体取下以后,如果不立即进行及时固定处理,就有可能出现缺血缺氧后的细胞超微结构的改变,如细胞出现细胞器变性或溶解等现象,这些都可造成电镜观察中的人为假象,直接影响观察结果分析,甚至导致实验失败。此外,由于处理不当造成组织微生物污染,导致细胞的超微结构结构遭受破坏。

因此,为了使细胞结构尽可能保持生前状态,取材成败是关键,取材成功的关键在于操作者必须要注意把握“快、小、冷、准”四个取材要点。(1).快:就是指取材动作要迅速,组织从活体取下后应在最短时间 (争取在1~2分钟之内)投入前固定液。对于实验动物,最好在断血流、断气之前就进行取材,以免缺血缺氧后使细胞代谢发生改变而破坏细胞的超微结构。当然,最好是采用灌注固定法。为了使前固定的效果更佳,组织块要充分和固定液混合,应采用振荡固定10分钟以上,有条件的可采用微波固定法固定。

(2).小:由于常用的固定剂渗透能力较弱,组织块如果太大,块的内部将不能得到良好的固定。因此所取组织的体积要小,一般不超过1mm3。为便于定向包埋,可将组织修成大小约1mm×1mm×2m m长条形。

(3).冷:为了防止酶对自身细胞的酶解作用,取材操作最好在低温(5℃~15℃)环境下进行,这样可以降低酶的活性,防止细胞自溶。所采用的固定剂以及取材器械要预先在冰箱(5℃)中存放一段时间。

(4).准:就是取材部位要准确,这就要求取材者对所取的组织解剖部位要熟悉,必须取到与实验要求相关的部位,不同实验组别间要取相同部位,如需要定向包埋的标本,则要作好定向取材工作。

此外,还要求操作动作轻柔,熟练,尽量避免牵拉、挫伤与挤压对组织造成的人为损伤。

二、什么是瑞利准则?电镜与光镜在原理上有何相似和不同之

处?

答:1、光线通过二个比较靠近的小孔时,这二个小孔的衍射图会重叠在一起。

当一个衍射图的中央亮斑正好落在另一个衍射图的第一暗环中心时,这二个点刚可以分辩。这就是显微镜分辩本领的瑞利准则。

2、相似点:光学显微镜是利用玻璃制作的透镜对光进行折射,将一物点发

出不同角度的光线最终会聚成一个像点。电子显微镜是以电子束作为光源,利用电磁透镜产生的电场或磁场折射电子束,并通过电子束轰击荧光屏激发荧光而达到成像目的。

不同点:光镜的照明源是可见光,而电镜是用电子束照明。光镜的透镜用玻璃制成,而电镜的透镜是轴对称的电场或磁场。

三、简述透射电镜及扫描电镜样品制作流程

答:1、透射电镜样品制作流程为取材——漂洗(生理盐水)——前固定(2.5%戊二醛,4oC冰箱2小时以上)——漂洗(0.1M 磷酸缓冲液,3次,45分

钟)——后固定(1%锇酸1小时左右)——漂洗(0.1M 磷酸缓冲液,3次,45分钟)——块染(1%醋酸铀2小时)——梯度脱水(50%、70%、80%、90%丙酮各15分钟, 100%丙酮 2次,各10分钟)——浸透(丙酮:包埋液=1:1,37 oC烘箱2小时;丙酮:包埋液=1:4,37oC烘箱过夜;纯包埋液45oC 烘箱2小时)——包埋聚合(45oC烘箱3小时,65oC烘箱48小时)。

2、扫描电镜样品制作流程为取材(做好样品观察面的标志)——漂洗(生理盐

水或缓冲液)——固定(2.5%戊二醛2小时以上)——漂洗(0.1M磷酸缓冲液,3次,45分钟)——后固定(1%锇酸,2小时)——脱水( 50%、70%、80%、90%、95%各15分钟,换醋酸异戊酯15分钟或叔丁醇15分钟)——干燥(零界点干燥或冷冻干燥)——镀膜(真空镀膜仪或离子溅射仪)

四、常用的化学固定方法有哪些?

答;常用的化学固定方法有

1、浸泡固定法(也称组织块固定):就是将组织块直接浸泡入固定液当中进行

固定。

2、游离细胞固定法:

适用于培养细胞、周围血、骨髓、胸腹水或其他渗出液。如为贴壁生长的培养细胞,应先用橡皮刮子将细胞从培养管壁上轻轻刮下,或用酶消化,使细胞脱离管壁。

3、原位固定法:

就是在组织未取下之前,在组织器官原来的位置进行预固定的方法。原位固定可分为点滴固定法和注射固定法两种。

点滴固定法:就是将实验动物麻醉后暴露出所需的器官表面,小心地剥开包膜,将预冷的固定液直接滴在组织的表面上,并保持固定液适当浓度不使挥发干燥。

注射固定法:就是将实验动物麻醉后,将固定液用细注射针直接注射到所需固定的组织中或空腔脏器的内部。

4、灌注固定法

就是利用血液循环的途径将固定液灌注到所需固定的组织中,其特点是灌注快速、均匀,缺点是固定操作复杂、要求高。

灌注固定法可分为全身固定和局部固定两种。通常采用的固定剂为2%~4%戊二醛溶液或者4%多聚甲醛溶液。

五、普通透射电镜包括那些结构?请简要叙述。

答:透射式电子显微镜(简称透射电镜)由四部分组成,即电子光学系统(即镜筒)、真空排气系统、电源系统和水冷系统。

电子光学系统包括:照明系统、样品室、成像系统和观察记录系统。

真空排气系统包括:机械泵、油扩散泵、真空管道、阀门及检测系统组成。

电源系统包括:主要的电源供给包括高压电源、电子枪灯丝电源、控制极电源、透镜电源、真空系统电源等部分。

水冷系统主要靠冷却水循环装置来完成或者直接用自来水降温。

六、简述电镜在生命科学中的应用

答: 电镜在生命科学上的应用几乎包括所有的学科研究领域都已经用到或即将用到电镜技术。比如动物或植物细胞的超微结构(包括细胞核、细胞质及其细胞器等内容物、细胞间的连接等)的形态观察,通过对比观察,对动植物形态在超微结构水平上进行分类、分型,以探讨遗传、变异及病理病因的机理或机制,为生命科学的基础研究所不可或缺的研究手段。

利用常规电镜技术和特殊电镜技术如免疫电镜技术、电镜酶细胞化学技术、电镜原位杂交技术等可以进行细胞细胞超微结构及超微病理分析,以及细胞内抗原、酶等的定位、定性甚至定量研究等。

七、简述电镜的球差和畸变及其形成原因。

答:1、球差:由于电子束光源通过透镜受到偏转,通过样品,从物平面向下发射,形成物点孔径角。从物点发出的射线,到达下一级透镜又被聚集。

如果透镜有缺陷或孔径角太大,则靠近光轴的射线和远离光轴的射线,受到电磁场的作用就会不同,这些射线在光轴上会聚的位置不同,结果远离光轴的射线就会在像面上形成一个最小模糊圈。此时可有图象中央凸起感。球差是目前影响电镜分辨率的一个主要因素。

2、畸变:由于离轴较远处的径向磁场的作用力强,使放大倍数随物点离轴

的距离而变化,进而使图象发生改变而产生的。畸变常见的有枕形畸变、桶形畸变和S形畸变等。

八、简述电磁透镜及其聚焦原理

答:由于轴对称弯曲磁场对电子束有聚焦作用,因而可以得到电子光学像。

我们称这种具有轴对称弯曲磁场装置构成的电子透镜为电磁透镜(electron magnetic lenses)。由于电磁透镜磁场非均匀分布,物、像点在磁场之外,电子在磁场中既受到轴向分量的作用,又受到径向分量的作用,使平行于轴进入磁场的电子束可获得聚焦。

九、什么是反差?简述电镜荧光图像反差形成的原因。

答:1、人的眼睛在区分物体时,主要根据物体不同部位或物体之间的光强度与波长的差别,这些差别构成了物体的反衬度,又称为“反差”。电镜与光镜一样也存在反差现象。

2、由于电镜标本上的不同部位的物质结构不同,经过电子染色后,其疏密度

也不同,它们散射电子的能力也各不相同,散射电子能力强的地方,显现为暗像;相反,散射能力弱的地方,显现为亮像。因此,在荧光屏上所看到的是由暗像与亮像组成的具有一定反差的荧光图像。

十、游离细胞取材方法有哪些?并简述其处理方法。

答:血浆凝集法:将抗凝全血离心分层(2000转/每分钟,10—20分钟),用毛细吸管沿着管壁轻轻的将上清夜吸取(不要破坏白细胞层),接着用吸管吸取固定液,并沿着管壁将2.5%戊二醛固定液慢慢地加入进行固定,然后把它放在4℃冰箱内保存。

血浆(血清)混合法:如为细菌、病毒、脱落细胞、培养细胞则先将它们制成悬液放置于离心管内(最好是玻璃的),离心成团(1000~3000转/分钟,10分钟,下同),去上清液后加入2.5%戊二醛固定10分钟左右,离心,再弃去多余的固定液,然后和少量抗凝血浆或血清混合均匀,离心成团,去上清液(留少许),用吸管吸取2.5%戊二醛固定液沿着离心管壁缓慢滴入,尽量避免团块分散,静置于4℃冰箱内保存备用。

十一、简述超薄切片流程并简要说明。

答:超薄切片流程包括以下几个步骤:

1、切片前的准备:铜网清洗(用丙酮和乙醇浸洗)

2、支持膜制备:常用Formvar膜(用聚乙烯醇缩甲醛和氯仿配置,浓度为0.5%)

3、玻璃刀制备:专用制刀机制作。

4、半薄切片光镜定位(主要确定超薄切片的位置)。

5、修块(表面修成梯形或长方形)。

6、超薄切片:专用超薄切片机切片,厚度在 50—100 nm 之间较为合适。

7、捞片:将超薄切片捞在载网上。

8、染色:铅-铀双重染色法,如已有过块染,则只需铅染色30分钟即可。

十二、简述负染技术及其应用。

答:负染技术是利用重金属盐(常用磷钨酸盐或醋酸铀溶液)沉积到样品四周,样品四周散射电子的能力就较强,因而表现为暗区;样品本身散射电子的能力较弱,则表现为亮区,这样便能把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来。是观察微小颗粒状生物材料的外部形状常用的染色方法。主要应用于病毒、支原体、细菌等微生物外部形态的观察以及纳米级生物材料的形态观察。

十三、简述石蜡块做超薄切片的样品制作流程

答、石蜡块做超薄切片的样品制作流程如下:

1、取材:从石蜡块上相应部位切下约1mm3 的小块。

2、溶蜡:将取下的标本放在一张滤纸上,40℃烘箱内烘1小时,然后转放入二

甲苯溶液中40℃烘箱内继续浸泡8—12h。

3、水化:纯丙酮30分钟、90%、80%、70%丙酮各15分钟。

4、漂洗:用缓冲液漂洗(0.1M磷酸缓冲液PBS)3次,每次15分钟。

5、固定:2.5%戊二醛固定2小时,PBS漂洗3次,而后1%锇酸后固定1—2小时。

6、漂洗、块染、脱水、浸泡、包埋聚合同常规透射电镜标本制作方法。

二、选择题及答案

1、人眼的平均分辨率为(B)

A 0.4mm

B 0.2mm

C 0.3mm

D O.2μm

E 0.4μm

2、电子枪产生的电子是(A )

A 入射电子

B 透射电子

C 弹性散射电子

D 二次电子

E 俄歇电子

3、用来显示组织和细胞的内部超微结构像的电子为(B)

A 入射电子

B 透射电子

C 弹性散射电子

D 二次电子

E 反射电子

4、下面哪项不属于透射电镜样品制备技术( A )

A 镀膜

B 负染技术

C 电镜细胞化学技术

D 超薄切片技术

E 半薄切片技术

5、下面哪项不属于扫描电镜样品制备技术(B )

A 表面干燥法

B 浸透包埋

C 冷冻复型

D 冷冻割断法

E 组织导电法

6、下面哪种电镜可以在观察结构的同时,对组织细胞内的元素成分进行分析(C)

A 透射电镜

B 扫描电镜

C 分析电镜

D 超高压透射电镜

E 原子力显微镜

7、观察组织细胞内部超微结构应选用哪种电镜(B)

A 原子力显微镜

B 透射电镜

C 扫描电镜

D 磁力显微镜

E 侧向力显微镜

8、下面哪项不是超高压电子显微镜的优点(E )

A 可用于观察厚切片

B 可以提高分辨率

C 可提高图像质量

D 可观察复杂的结构

E 减少辐射损伤范围

9、下面对扫描电镜的描述错误的是(B)

A 利用反射电子和二次电子成像

B 用于观察组织细胞表面形貌

C 样品室大,可用于观察块状样品

D 景深长,立体感强

E 样品可被升降和倾斜

10、电子枪由(D)组成

A 阴极、阳极

B 阴极、栅极

C 阳极、栅极

D 阴极、阳极、栅极

E 正极、负极、栅极

11、二次电子监测系统不包括(E)

A 检测器

B 阴极射线管

C 闪烁器

D 光电倍增器

E 视频放大器

12、固定液中戊二醛的常用浓度为(C)

A 0.5%

B 2.0%

C 2.5%

D 4%

E 10%

13、下面对透射电镜描述不正确的是(D)

A 利用透射电子成像

B 观察细胞内部超微结构

C 可观察负染标本

D 景深长、立体感强

E 分辨率高,性能最完善

14、透射电镜的反差取决于样品对(B)的散射能力

A 二次电子

B 入射电子

C 透射电子

D 散射电子

E 反射电子

15、观察生物样品时,透射电镜的加速电压一般为(C)

A 20-50KV

B 50-80KV

C 80-100KV

D 100-120KV

E 120KV以上

16、超薄切片是指厚度小于( D)的切片

A 200nm

B 300nm

C 400nm

D 100nm

E 500nm

17、超薄切片技术的步骤为(B)

A 取材、固定、脱水、包埋、切片、染色

B 取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片、染色

C 取材、脱水、固定、包埋、切片、染色

D 取材、固定、脱水、浸透、包埋、切片

E 取材、脱水、固定、包埋、切片

18、不属于透射电镜标本取材要求的(C)

A 动作快

B 组织小 C切割狠 D部位准 E环境冷

19、下列试剂中属于强氧化剂以及对粘膜损伤最严重的是(C )

A 戊二醛

B 环氧树脂

C 锇酸

D 磷酸缓冲液

E MNA

20、负染技术中最常用的染色剂是(C)

A 锇酸

B 甲苯胺蓝

C 磷钨酸

D 柠檬酸铅

E 溴化银