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EDU染色

荧光显微镜检测方法(以96孔板,A549贴壁细胞为例)

细胞培养

取对数生长期细胞,以每孔4×103~1×105细胞接种于96孔板中,培养至正常生长阶段。

药物处理

(可选)客户可以根据实验需要进行各种药物处理。

EdU标记

1.1 用细胞培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液(试剂A),制备适量50μM EdU 培养基;

注:1)如果需配置10μM EdU培养基,需调整为5000:1稀释比例;

2)配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质,如LB培养基4℃可稳定保存两周。

1.2 每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时,弃培养基;

注:1)EdU培养基用量以没过细胞为宜(表1);

2)最佳孵育时间与细胞周期相关(表2),大多数细胞系可采用2小时孵育时间;

3)EdU浓度与孵育时间相关,短时间孵育(<30min)宜采用高浓度(50 μM),长时间孵育(>24h)宜采用低浓度(1 μM),最佳孵育浓度需要优化。

1.3 PBS清洗细胞1~2次,每次5分钟。

注:清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱,清洗方式依据不同的细胞类型而定,贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。

细胞固定化

2.1 每孔加入100μL 细胞固定液(即含4% 多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟;

注:1)低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持,当需要抗体染色时,需采用Triton X-100透化细胞以利于抗体染料进入细胞内。

2)可采用其他方式进行细胞固定。

2.2 每孔加入2 mg/mL 甘氨酸,脱色摇床孵育5分钟后,弃甘氨酸溶液;

注:作用是中和多聚甲醛,当采用其他方式进行细胞固定时可省略此步骤;

2.3 每孔加入100 μL PBS,脱色摇床清洗5分钟,弃PBS;

2.4 (加强)每孔加入100μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟;PBS 清洗1次,5分钟。

注:当实验需要进行其他抗体染色,或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高,可能需要增强细胞膜通透性。

Apollo染色

3.1 每孔加入100 μL的1X Apollo®染色反应液(表3),避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后,弃染色反应液;

注:染色液用量与细胞培养体积相关,以覆盖细胞为宜(表1)。

3.2 加入100 μL渗透剂(0.5% TritonX-100的PBS) 脱色摇床清洗2~3次,每次10分钟,弃渗透剂;

3.3 (加强)每孔每次加入100 μL 甲醇清洗1~2次,每次5分钟;PBS清洗1次,每次5分钟。

注:由于某些细胞对染料的吸附性较高,需采用加强方式洗脱以降低染料背景。

DNA染色

4.1 用去离子水按100:1的比例稀释试剂F,制备适量1X Hoechst33342反应液,避光保存;

EDU染色

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