细胞工程

细胞工程


染色体工程
动物细胞的染色体工程
植物细胞的染色体工程

染色体的消除

染色体的添加

染色体的替代
染色体组工程
染色体组工程的方法

多倍体的诱发

单倍体的诱发
染色体组工程的应用
细胞质工程
细胞质工程的方法

去核和核移植

细胞重组
细胞质工程的应用

动物方面

植物方面
细胞融合工程
细胞融合的方法

动物细胞杂交或细胞融合

植物体细胞杂交
细胞融合工程的应用

基因定位

单克隆抗体

作物品种改良━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
应用细胞生物学和分子生物学方法，在细胞水平进行的遗传操作。广义的细胞工程包括利用离体培养细胞的特性，生产有价值的生物品，或快速繁殖珍贵的植株。
对细胞的遗传操作可以在细胞结构的不同层次上进行。将体外重组的基因导入细胞，实际上是与基因工程交叉的领域（见重组DNA技术）。除此以外,按遗传操作对象的结构层次,细胞工程可分为4个方面：染色体工程、染色体组工程、细胞质工程、细胞融合工程。

染色体工程
将一种生物的特定染色体，按照人们的意图予以消除、添加、或同别的生物的染色体置换、或改造的技术。目前基因工程的操作技术多限于单个或少数基因在大肠杆菌等微生物中的表达。为了改变真核细胞的遗传性和控制高等生物的生命活动，还必须研究和开发染色体工程，建立一种新的技术体系，把所需的基因或染色体片段整合到染色体的任意位置，并能将有关遗传信息在细胞分裂中一代又一代的传递下去。目前这方面的工作还处于起步阶段。
动物细胞的染色体工程　又称为染色体转导，或染色体介导的基因的转移。染色体转导术,目前有两类,其一，称为微细胞转移术。应用低浓度秋水仙素长时间处理可使细胞微核化，经去核处理后，可得到只含相当于几个乃至一个染色体的微细胞。微细胞被导入完整细胞以后仍显示RNA合成,因而微核编码的基因信息可望在微细胞异核体内表达出来。如小鼠的微细胞可被导入至另一品系的小鼠或仓鼠乃至人的HeLa细胞内。电泳检测显示存在着小鼠基因型的大分子物质,如脂酶D、嘌呤核苷磷酸化酶和肽酶B。已知前两种酶的结构基因定位于小鼠的第14号染色体上。提示小鼠的该号染色体已进入宿主细胞内并行使其功能。
另一种方法

是先诱发细胞同步分裂，继用秋水仙素阻抑细胞分裂于中期，再破碎细胞，通过离心收集大量的中期染色体。有人把此法得到的人或仓鼠的中期染色体转移到小鼠细胞内，并探查到有特异的供体基因的功能产物，如胸苷激酶(TK)与次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)。并推测整合到宿主小鼠内携带TK基因的染色体片段约大于17000个碱基。有人证明通过染色体介导的基因转移，不仅在宿主细胞的分裂过程中能稳定地传给子代，而且还能进行连续转移，如人染色体基因可以转移到小鼠细胞内，然后再使用同样的技术从小鼠细胞转移到中国仓鼠细胞内。这些实验是在染色体水平上进行基因转移的良好开端。
植物细胞的染色体工程　在高等植物方面的染色体工程，目前还仅在六倍体普通小麦与其他种、属之间做过。六倍体普通小麦的染色体组型是由野生一粒小麦AA、小斯卑特山羊草BB和汇山羊草DD三种类型的染色体组融合而成，是一种能正常繁殖的种间杂种(AABBDD)，因此，很容易容纳其他种、属染色体添加或替代。这个领域的研究目的在于改良作物品种和探究物种起源。
染色体的消除　①单体植物，起初是利用自然发生的单倍体普通小麦制作。现在则用人工诱导花粉或未受精的子房产生的单倍体植株为材料进行。这是因为普通小麦的单倍体植株只有21条染色体，都不是成对的，因此在成熟分裂（见减数分裂）时没有联会的对象，故仍为单价染色体。这21个单价染色体能排列在赤道板上纵裂为二，在后期Ⅰ被平均分配到细胞的两极。但在第二次分裂时，这21个染色体不再纵裂，随机分开，结果产生了染色体数从0～21个的21种类型的配子。这些配子只有具19条或20条染色体的有受精能力。因此，如果用正常植株的花粉( n＝21)给单倍体植株授粉， n＝20的卵细胞以一定的比例受精，结果得到2 n＝41的植株。其染色体组型中有20条染色体因有同源(对应)染色体故可以配对形成二价染色体。而只有一条染色体没有配对，成为单价染色体，因此称这种类型的植物叫单体植物。例如，美国米苏里大学的E.R.西尔斯于1937～1954年共用了十七年的时间，用中国春小麦中发现的两个单倍体植物与正常花粉授粉，得到的后代中找到了5种单体植物。其后用同样方法制作一套21种单体植物。除普通小麦外，烟草和硬粒小麦也制成了一套单体植物。②缺对植物，单体植物的体细胞染色体数为2 n＝41。在成熟分裂后，将形成两种配子，即n＝21， n＝20，这两种雌雄配子都有受精能力，而且自花授粉后也容易结实。不过两者受精率的高低有差别。因此，受精时，两种配子按一定比例进

行结合。结果见表1。如果缺失型的花粉与缺失型的卵细胞结合为受精卵,由此发育成的植物,将比通常的普通小麦少一对染色体，所以叫缺对植物。E.R.西尔斯用此方法也培育出了一套普通小麦缺对植物。
染色体的添加　①同种染色体的添加，所添加的染色体来自同种个体，添加一个的叫三体植物(2 n+1)；添加一对的叫四体植物(2 n+2)。三体植物和单体植物一样，可得自单倍体三倍体或缺体。它的来源很多。如普通小麦单体植物在成熟分裂时，有时会出现不分离现象（即单价染色体的二个姊妹染色单体在后期Ⅰ被同时拉到同一极，而不是各自分配到两极）。结果所形成的四分孢子，其中三个的染色体数是n＝20，一个是n＝22。如果多一个染色体的配子与正常花粉或卵细胞( n＝21)受精后,就成为三体植物(2 n＝43),比原来正常普通小麦多了一个染色体。三体植物自花授粉的后代中就有四体植物出现。因为三体植物在成熟分裂时形成两种配子( n＝21, n＝22)。如果让三体植物自花授粉，就会出现三种类型的子代,如表2所示。其中就有新型的四体植物，比正常植物多两条染色体。②异种染色体的添加，所添加的染色体来自别种植物。以普通小麦(W)和黑麦(R)2 n＝14杂交为例。由于黑麦染色体不能和普通小麦配对，在成熟分裂染色体重组时，黑麦基因不能直接转移到小麦染色体上，而只能将黑麦整个染色体组加到小麦的染色体组中，所得子一代杂种为多倍单倍体(21′W7′R),仅28个染色体。经过秋水仙素处理加倍后,成为小黑麦八倍体(21″W7″R)共有56个染色体，再与小麦回交得到七倍体(21″W7′R),共49个染色体。然后与小麦再回交一次，就可得到外加的单体植物。单体植物自交后得二体植物(44个染色体21″W1″R)。另外,还有一个外加系是加入了黑麦第Ⅱ对染色体,成为44个染色体的二体植物。这种外加系能使小麦抗锈病（见染色体倍性）。
染色体的替代　用同种或异种染色体来替代某特定染色体的技术。其目的是要把已知道的具有抗病或其他有利特性的某一染色体来替代另一个具有其他性状的染色体，以改良作物品种。染色体替代有三种方法：①用普通小麦自身的染色体来替代。例如，普通小麦的一对1A染色体被一对1B染色体替代后，就能育成缺对1A、四体1B植物，即缺对-四体植物。这种类型的植物是由缺对1A与四体1B杂交后所得子一代再自花授粉后选育而成。②普通小麦的一个品种的染色体用别的品种的染色体来替代,叫做同种染色体替代。如果用正常普通小麦B品种的花粉,与缺对的A品种杂交,所得子一代自花授粉,则在子二代就能选育出A品种的缺对的二条染色

体被B品种染色体替代的植物。③用异种植物的染色体来替代,叫异种染色体替代。例如，普通小麦的2A染色体可用黑麦的2R染色体替代。为了达到这个目的，首先要育成基本材料缺对植物(2 n＝42-2A)和异种染色体外加系(2 n＝42+2R)。这样就可把普通小麦缺对2A与小麦2R染色体外加系（具有21对小麦染色体加上一对黑麦2R染色体）杂交，子一代杂种染色体2 n＝42，其中20对染色体是除2A外的全部普通小麦染色体，其余二个一价染色体是2A和2R，成熟分裂时可产生四种类型配子,即： n＝20+2A+2R, n＝20+0, n＝20+2A＝21， n＝20+2R＝21。这最后一种是具有除2A以外的20个普通小麦染色体一个黑麦的2R染色体。因此，子一代杂种自花授粉的后代中，就能得到所期望的异种染色体替代植物。即一对黑麦的2R替代了一对小麦的2A(20″W2″R)。
现在，应用染色体工程的方法，在许多添加和替代染色体工作中，已经获得了不少有遗传学和育种学价值的品系。例如，获得了添加单个冰草染色体的小麦品系中间，有的能抗粉露菌病、秆锈和叶锈。这种抗性均呈现显性单因子遗传。将黑麦第Ⅲ对染色体加到软粒小麦对粉露菌病有抗性。用冰草的一个染色体替代软粒小麦染色体3D，使软粒小麦对秆锈有抗性。这些在生产实践上都有实用价值。

染色体组工程
诱导增加或减少一个生物体内整套染色体组数的技术。增加同种染色体组数的叫同源多倍体；增加异种染色体组数的叫异源多倍体，异源多倍体必须经过杂交才能得到（见染色体倍性）。
染色体组工程的方法　多倍体的诱发　自1937年发现了用秋水仙素诱发多倍体的方法以来，一般常用药剂（秋水仙素、富民隆等），也可用高温处理来诱发多倍体。其法是把植物的种子或幼芽浸在0.05～0.2％的秋水仙素水溶液中，处理24～96小时即可得到很好的效果。例如四倍体西瓜、甜菜、玉米和百合等都是用此法获得的。
现在，由于原生质体分离技术的发展，也可从原生质体的融合得到多倍体。例如用聚乙二醇作诱导融合剂处理胡萝卜原生质体后，得到了频率相当高的四倍体和六倍体植株。这是来源于二个或三个原生质体融合的结果。
单倍体的诱发　60年代以来，子房、花药或花粉离体培养成功，很易从大孢子、卵细胞或小孢子等得到单倍体植株。其法是将一定时期的花药或子房移植到特定的培养基上培养。待生长愈伤组织或胚状体后，再移到分化培养基上，分化出苗和根，长成完整的小植株即可移到盛有土壤的盆中继续栽培到开花。单倍体植物一般不能结实或仅结少量种子。
此外,还可用远缘杂交,X

射线或紫外线照射,化学药品如马来酰肼、甲苯胺蓝、氯霉素等以及异源胞质等方法都能诱导单倍体产生。1970年有人又用大麦与球茎大麦杂交后染色体消除的方法，产生高频率的单倍体，有的可高达68.5％。在杂交后,球茎大麦的7个染色体就消除在胚中，留下的是大麦的7个染色体,成为单倍体的胚及小植株。经秋水仙素处理后，染色体加倍形成纯合二倍体。
染色体组工程的应用　诱导多倍体在植物育种上的应用是有限度的。由于作物类型不同，对多倍性诱变反应也不同。原来的倍性水平、染色体组的结构、繁殖方式、多年生性、植株实用部位，所有这些都关系到育种的成败。最适宜用染色体加倍方法改良的作物应该具有：①染色体数目较少，②以收获营养体为主，③异花授粉，④多年生和营养繁殖的习性等条件。这些都是多倍体育种获得成功的先决条件。

细胞质工程
研究真核细胞的核、质相互关系以及细胞器，胞质基因的转移等细胞拆合的技术，所以又叫细胞拆合工程。主要研究内容是细胞质的置换。过去在植物上置换的方法是进行连续回交。例如，为了研究柳叶菜属的细胞质遗传，曾连续回交了二十五代，结果还不能把全部母核替代出来。现在由于核移植和原生质体的分离方法的改进，推进了这项工程的进展。
细胞质工程的方法　去核和核移植　动物细胞核的移植一般都用显微操作器进行。50年代初期，美国生物学家R.布里格斯和T.金首先成功地把豹蛙囊胚期细胞的细胞核移植到去核的蛙卵，并能正常发育。后来，英国J.B.格登把爪蟾蝌蚪肠上皮细胞核移植到去核卵内，能发育到有生殖能力的成体。中国童第周等还成功地进行金鱼类异种、异属之间的核移植实验(见细胞分化)。70年代以来，体外培养的动物细胞的去核，是先用细胞松弛素B处理细胞,再高速离心使细胞核与细胞质分开。分离出来的核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”或“小型细胞”。核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。去核后的胞质部分,仍由膜所包围,即为“胞质体”或“去核细胞”。秋水仙素及其衍生物和长春新碱等也能诱发某些哺乳类细胞排核。目前制备胞质体和核体的方法目臻完善，纯度可达99％左右。胞质体约可存活18～36小时。
植物细胞核的移植，在低等植物如单细胞伞藻，可把新鲜材料的假根切下，放在玻片上用玻棒挤压，使细胞的内含物压出在一滴适合的培养液中，反复冲洗几次，然后在显微镜下观察，一直到核周围无细胞质为止。离心分离后待用。高等植物如矮牵牛、天仙子、烟草、番茄等原生质体

核的分离，可先在悬浮的原生质体中用蒸馏水将悬液冲淡一半，约30分钟后，原生质体破裂，放出细胞核与叶绿体,就可在0.6M蔗糖液中离心和收集核，然后存放在一定的培养液中待用。1978年以来又借用动物细胞去核的药剂细胞松弛素B来处理原生质体,加上高速离心，使原生质体分离成二部分，即：无核原生质体和小原生质体。开辟了去植物细胞核甚至去部分染色体的新途径。
细胞重组　已经分离的核体（小细胞）与胞质体在融合因子的介导下重新融合，构成“重组细胞”，这一技术即称为细胞重组，胞质体与另一完整细胞融合，即产生“胞质杂种”细胞。这两种细胞产生的效果是不同的，现在有方法把它们鉴别开。以大鼠二种成肌细胞为材料，一种是正常的具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶(HGPRT+)基因， 另一种是突变体缺少这种基因(HGPRT-)，因此,前者细胞中有转移酶能被氚-次黄嘌呤标记，而后者没有这种酶，便不能标记。在两者的细胞质中让HGPRT+摄取小乳胶颗粒，让HGPRT-摄取大乳胶颗粒，以颗粒的大小来作标记。当核体（小型细胞）与胞质体融合后,在重组细胞中可看到核被氚-次黄嘌呤所标记，在细胞质中有大量大乳胶颗粒和极少数小乳胶颗粒。当胞质体与另一个HGPRT+完整细胞融合后的胞质杂种细胞的细胞质中，则同时出现有大量的大、小乳胶颗粒。如图4所示。应用这种方法很容易把两类细胞鉴别出来。
在植物中，原生质体与核的融合以烟草、矮牵牛的核移植为例，其步骤是：①先使矮牵牛游离核与烟草原生质体各自悬浮并沉淀在0.25M硝酸钙溶液中,pH6；②去掉上清液，再把它们悬浮起来，以适当比例使核与原生质体在试管中混合、离心，随后加入45％聚乙二醇溶液1毫升使之聚合：③30分钟后,徐徐加入4毫升0.2M硝酸钙(被pH9的甘氨酸氢氧化钠所缓冲)以诱导融合摄取核；④15分钟后加0.2M硝酸钙(pH6);⑤再过20分钟,原生质体用培养液冲洗；⑥镜检后，将具有双核的（其中一个是矮牵牛的核）烟草原生质体进行培养。
细胞质工程的应用　动物方面　1974年有人用两种小鼠成纤维细胞,其一用L细胞的完整细胞，它的核内具有对5-溴脱氧尿苷抗性的核基因BUd(RR),但细胞质内没有抗氯霉素的胞质基因，用的另一个细胞的线粒体上带有抗氯霉素的胞质基因CA(PR)，而细胞核内带有硫代鸟嘌呤敏感核基因(TGS),把后者去核细胞与前者融合,则融合后的胞质杂种细胞既能抗5-溴脱氧尿苷（BUdR），又能抗氯霉素(CAP)。但如果把亲体细胞(BUdRR和TGS)同时培养在含有这两种药物的培养基上，则都将死去。因为这两种细胞一个对CAP敏感，另一个不抗BUdR,

而胞质杂种细胞则两者都能抗，不但能存活而且还能增殖。
植物方面　用等渗密度梯度高速离心后，也可得到两种亚原生质体，①在低密度范围内可得到胞质体（去核原生质体）；②在高密度中，可得到小原生质体（核质体）。现在已能自玉米、烟草和胡萝卜细胞得到这两种亚原生质体。生化实验证明：去核原生质体代谢作用很低，而小原生质体由于减少了表面积和体积（仅及原生质体的10～15％），因此，摄取物质快，合成蛋白质也快，培养时发育迅速，是一种研究核质关系的好材料。由于这项工作才开始，迄今尚无明显结果。

细胞融合工程
细胞融合是指用自然或人工的方法，使两个或几个不同的细胞融合成一个细胞的过程。细胞融合的结果，一个细胞中含有两个不同的细胞核，则称为异核体；随后的有丝分裂中，来自不同细胞核的染色体可能合并到一个结合核内。因此，又称为体细胞杂交。细胞融合的范围很广，从种内、种间、属间、科间一直到动、植物两界之间都进行了尝试。在植物方面，由于各类细胞具有全能性，在烟草、矮牵牛、胡萝卜等种间杂种，马铃薯和番茄、曼陀罗和颠茄、烟草和矮牵牛等属间杂种都已获得了再生植株。在动物方面人和鼠体细胞杂交，虽然不能长成一个新个体，但能作基因定位的材料。因此，这项新技术,在理论研究和工、农、医方面的应用,均有广阔的前景。细胞融合技术的发展，历史很短。自1960年在体外培养中发现杂种细胞以来，仅20多年。1965年冈田善雄等和H.哈里斯等各自用灭活的仙台病毒诱导产生了第一个种间异核体。1970年已应用人与鼠的细胞杂交系统地进行了人类染色体基因的定位工作。在植物方面，1960年E.C.科金首先使用纤维素酶分离番茄幼根的原生质体获得成功。1970年他们又成功地使种间原生质体融合在一起。1972年P.S.卡尔森等又从融合的原生质体获得了第一株种间细胞杂种。到1980年为止，种间融合的再生植株已有16种之多。
细胞融合的方法　动物细胞杂交或细胞融合　将两个不同种的亲本细胞A和B，以灭活的仙台病毒或聚乙二醇(PEG)为融合诱导剂,使A和B两细胞融合成为一个具两个遗传性不同核的异核体（如遗传性相同的核融合在一起叫同核体）。随后异核体经有丝分裂成为两个具有A和B两亲本的杂种融合核。AB杂种经多次分裂，B亲本的染色体会逐渐减少到一个或完全消失。
植物体细胞杂交　①原生质体的分离。植物细胞之间有果胶质粘连，每个细胞之外还有一层纤维素组成的壁，因此，在分离原生质体时，首先要在一定浓度的酶液(果胶酶与纤维

素酶)中保温，消去果胶质与纤维素后才能使原生质体分离出来。②原生质体的融合。不同种之间原生质体的融合,须选用一种融合诱导剂(聚乙二醇，或高钙CaCl2.2啹O,0.05M溶于甘露醇0.4M和pH10.5)诱导融合。它们的诱导率可达20～50％。③杂种细胞的选择与培养。细胞融合后要把杂种细胞选择出来。一般都利用各种生化指标和遗传标记来选择和鉴定。例如，使用天然的或人工诱变的突变体，如白化苗、营养缺陷型、抗药性突变体等，或根据不同材料对激素敏感性不同，生长差异等，来设计适合的选择系统。如果融合的原生质体一个是白化,另一个具叶绿体,就可用机械的方法，把融合的细胞在倒置显微镜下把它们挑选出来进行培养。这些细胞培养到各个发育阶段，如愈伤组织、分化苗和根，都需要更换培养基，才能使它们顺利地再生成植株。
细胞融合工程的应用　基因定位　利用体细胞杂交后基因的互补性和染色体丢失来确定基因的位置。例如，小鼠成纤维细胞缺少次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶的突变体(HGPRT-)作为一个标记体。当小鼠单独培养在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)的培养液中,因缺少HGPR基因，不能由次黄嘌呤合成核苷酸而死亡。但小鼠HGPRT-细胞和人的HGPRT+细胞融合的杂种细胞培养在HAT培养液中，就能存活,这就是两者起了互补的作用。而在杂种细胞中，人的染色体,除了一条活动的X染色体外，其余的全部丢失了，说明HGPRT基因是在X染色体上（见体细胞遗传学）。
单克隆抗体　见单克隆抗体。
作物品种改良　植物体细胞杂交对植物育种和作物改良有着美好的应用前景。例如，现在有人把拟南芥菜和油菜体细胞融合在一起，育成了一种带有两个亲本遗传特性的新植物，叫拟南芥油菜，这种杂种具有亲本之一的大部分遗传物质和另一亲本的少数染色体，它们的形态上较正常,这一结果表明在远缘体细胞杂交方面,有可能把某些带有优良性状的染色体或基因转移过来，为作物改良开辟了一条新的途径。