SiRNA 与RNAi 实验技术手册
SiRNA与RNAi实验技术手册
RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架，但长久以来，RNA分子一直被认为是小角色。然而，一系列发现表明——这些小分子RNA事实上操纵着许多细胞功能。它可通过互补序列的结合反作用于DNA，从而关闭或调节基因的表达。甚至某些小分子RNA可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。RNA干涉（RNAi）是在线虫中发现的，在 1998年的一篇Nature论文中被公诸于众。 此后，科学家们还明白，RNAi还有其他形式，它既是一种了解基因功能的强大工具，又是很多生物的基因组所采用的一种在演化上来讲很古老的防卫方法。
一、什么是siRNA和RNAi？
双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA，这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了，双链RNA对基因表达的阻断作用就被称为RNA干预（RNA interference, RNAi ）。
二、RNAi的作用机制是什么？
目前RNAi的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染、转座子的转录产物、外源导入的基因。这些来源的双链RNA 诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除、转座子的表达被阻断、外源导入基因表达被阻断，同时与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。
通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。
A、在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。
B、在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子
RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA 和一个不同于Dicer的RNA酶。
另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默.
三、如何进行RNAi试验的设计？
RNAi研究的一般技术路线一般如下：
由上述的路线可以看出，获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步，而转染的效率则是非常关键的因素。
A、设计siRNA序列
1、 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选
https://www.wendangku.net/doc/7212014322.html,/techlib/misc/siRNA_finder.html
https://www.wendangku.net/doc/7212014322.html,/Stu/shilin/rnai.html
https://www.wendangku.net/doc/7212014322.html,/rnadesign/default.aspx?SID=45358710
2、RNAi目标序列的选取原则
(1)、从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。
Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
(2)、将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用https://www.wendangku.net/doc/7212014322.html,/BLAST/）。
(3)、选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
3、阴性对照
一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。
4、目前已证实的siRNA可以在下面的网页找到
https://www.wendangku.net/doc/7212014322.html,/catalog/category.aspx?key=49
https://www.wendangku.net/doc/7212014322.html,/techlib/tb/tb_502.html
https://www.wendangku.net/doc/7212014322.html,/mmcmanus/www/siRNADB.html
https://www.wendangku.net/doc/7212014322.html,/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Publ ished
B、siRNA的获得
目前为止较为常用的方法有通过化学合成、体外转录、长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)、体外制备siRNA，以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。
1、体外制备
a、化学合成法
许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3—4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究。
不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素。
b、体外转录
以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。
最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。 不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。
c、用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法——制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型。
不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治
疗。
2、体内表达
前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。
a、 siRNA表达载体
多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。
b、siRNA表达框架
siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中（晶赛公司的Protocol可以解决这
一问题）②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。 最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子。
不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）。
小结
运用RNAi来诱导基因表达的沉默是一种制备基因功能缺失表型的有效的新方法。下表总结了5中不同的制备siRNA的方法。
比较项目化学合成体外转录
RNase III降解
dsRNA
siRNA
表达载体
PCR
表达框
材料需求 21-mer RNA
oligos(一
对)
29-mer DNA
oligos(一对)
转录模版
(200-1000bp，
两侧带T7 启动
子)
55-60-mer
DNA
oligos(一
对)
~50-mer DNA
oligos(一对)
全部制备/合成
时间所需时间 4天—2周
24 小时 + DNA
oligo合成时间
1 天 + 转录模
版制备时间
5天以上
+ DNA
oligo合
成时间
~ 6 小时 + DNA
oligo合成时间
个人所需操作时间 几乎不需要
*
中等 中等 多 中等
是否需要验证
和寻找最有效
siRNA
需要 需要 不需要 需要 需要
能否标记siRNA
(例如用于荧光
显微镜分析
siRNA进入细胞
过程或者在细
能 能 能 不能 不能
C、siRNA的转染
将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：1、磷酸钙共沉淀
将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
2、电穿孔法
电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜
而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
3、DEAE-葡聚糖和polybrene
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4、机械法
转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
5、阳离子脂质体试剂
在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA 自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。
注：为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：
1、纯化siRNA
在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。
2、避免RNA酶污染
微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
3、健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性
通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。
4、避免使用抗生素
Ambion公司推荐从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。
5、选择合适的转染试剂
针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA 实验的成功至关重要。
6、通过合适的阳性对照优化转染和检测条件
对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。
7、通过标记siRNA来优化实验
荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA 胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。
D、RNAi的效果分析
RNAi分子水平的检测主要通过mRNA和蛋白两个方面进行检测。对于mRNA，可以采用 RT-PCR、荧光定量PCR或Northern杂交等，通过信号强弱判断目的基因的沉默效果。由于生命的执行者是蛋白，因此还需要对蛋白水平进行检测，可通过Western杂交，ELISA，免疫荧光等。当然RNAi最大以及最终的效果是细胞的代谢过程、生理生化系数等表型参数发生明显的变化。
四、siRNA实验成功的要点
1、对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列
为了找到潜在靶位点，扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析，去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能，siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。美国著名RNA产品公司Ambion提供网上在线设计工具，帮助您更快地完成这项工作。网址为：https://www.wendangku.net/doc/7212014322.html,/techlib/misc/siRNA_finder.html
2、选择低GC含量的siRNA
Ambion公司研究发现GC含量在40-55%的siRNA比55%以上的活性高。
3、纯化体外转录siRNA
在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱（Ambion siRNA体外合成试剂盒中已包括纯化柱保证siRNA纯度）或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。
4、避免RNA酶污染
微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品…因此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。Ambion公司在这方面有一整套的产品线，如除RNA酶的喷剂，拭纸及液剂，检测和去除RNA酶。
5、健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性
通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。
6、避免适用抗生素
Ambion公司推荐从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。QIAGEN推出的专门针对RNA转染的试剂。
7、选择好的转染试剂转染siRNA
针对靶细胞类型，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。siRNA 实验要求选择适合转小的RNA的转染试剂（目前大多数转染试剂都针对转染比较大的质粒DNA，而非小的RNA分子，宿主范围大小也不同）。Ambion公司的Silencer siRNA Transfection Kit，QIAGEN的Transmessenger Transfection Reagent都是专门针对转siRNA优化的转染试剂，是您的理想选择。
8、通过合适的阳性对照优化转染和检测条件
对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的
降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。Ambion公司提供多种靶基因的阳性siRNA。
9、通过阴性对照siRNA排除非特异性影响
合适的阴性对照可通过打乱活性siRNA的核苷酸顺序设计而得。必须注意它要进行同源比较确保相对所要研究的生物的基因组没有同源性。
10、通过标记siRNA来优化实验
荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA 胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。
五、RNA 操作时的注意事项与实验技巧
1、操作注意事项
由于RNA酶的广泛存在与难以灭活的顽固特性。使得RNA的提取纯化和后续工作变得非常困难。为了保证RNA的研究工作成功，请仔细阅读下列注意事项，相信它能帮助您解决常见的问题。
归根究底，RNA工作的主要问题是防止RNA酶的污染。RNA酶无处不在，在实验操作的任何一步，任何偶然的疏忽或不当操作都有可能造成RNA酶污染，从而导致整个实验失败。因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染是保证实验成功的关键，必须做到以下几点：
1）、如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA 操作区应保持清洁，并定期进行消毒。
2）、操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。尽量避免使用抛弃式塑料手套。塑料手套不贴身，常常造成操作不便，而且多出部分还容易在器具上遭RNA酶污染并向未污染处传递，扩大污染。
3）、尽量使用一次性枪头、离心管等塑料制品，尽量避免与其它实验共享器具，以防止交叉污染。推荐使用出厂前已经灭菌的枪头和离心管，大多国外厂商供应的无菌塑料制品很少有RNA酶污染，买来后可直接用于RNA操作。许多研究者用DEPC等处理的塑料制品，往往由于二次污染而带有RNA酶，从而导致实验失败。
4）、配制溶液用的酒精，异丙醇、Tris等应采用未开封的新品。溶液需用DEPC水配制（加0.01%(体积比)DEPC至重蒸水或Mili Q级水中，处理过夜，灭菌即成DEPC水）。
5）、所有玻璃制品都必须在240℃烘烤4小时。所有旧塑料制品都必须用0.5M的NaOH处理10分钟，并用DEPC-H2O彻底冲洗后灭菌，也可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。无法用DEPC处理的用具可以用氯仿擦拭若干次，这样通常可以消除RNA 酶的活性。
2、样本保存的注意事项
样本一旦从生物体中分离后，细胞内的RNA就变得非常不稳定，容易降解。因此取样后，如何保证取样前后基因的表达模式不变，就变得非常重要。传统方法是用液氮速冻，再放到超低温冰箱中保存。
目前有些厂家开发出专门的RNA保护剂，如Qiagen公司的RNAlater是具有抑制RNase 和稳定RNA作用的试剂，将采集的组织样本等直接放入到RNAlater中，即可起到稳定样本中RNA的作用。无需液氮或干冰，方便安全地在室温下保存一段时间，低温可长期保存。还有对细菌样本专用的RNAprotect Bacteria Reagent及对血液样本专用的PAXgene? Blood RNA System。
3、RNA的定量与纯度
RNA通常用分光光度计定量，测量在260 nm处的吸收值（A260）。通常分光光度计A260的读数要介于0.15-1.0之间才是可靠的，因此RNA提取结束后，要根据大概产量稀释（推荐用10 mM Tris.HCl, pH 7.0稀释）到适当浓度范围，再用分光光度计测量。A260为1相当于RNA的浓度为40 μg/ml。
为了检测RNA的纯度，可以测量A260与A280的比值，通常纯RNA的A260/A280为1.9-2.1。
常见细胞与组织的RNA含量：
样本来源 Total RNA(μg) mRNA(μg) 细胞培养物* – 30–500 0.3–25
NIH/3T3 120 3
HeLa 150 3
COS-7 350 5
107 cells ? Per organism ? 100 mg nd = not determined
六、问题与猜想
A、 问题
在siRNA与RNAi的研究中，仍有许多的问题：
蛋白是如何与siRNA组合在一起的，如何成为活性形式？对靶RNA的剪切作用，其相关的分子机制如何，是需要特异的蛋白来剪切靶RNA，还是引导的siRNA本身即有剪切作用等。哺乳动物与人的RNAi机制是否与简单的真核生物类似，RNAi的进化地位如何等。
B、 猜想
1、 疾病治疗：主要的问题还是转运系统的选择，如何找到一种高效而低毒的用于人体的转运载体是摆在所有RNAi应用面前的最大敌人。依靠免疫系统寻找转运载体可能成为途径之一，而免疫系统中本身可能也有RNAi参与。细胞中是否普遍存在RNAi或进行RNAi的潜力呢？细胞的凋亡机制可能也与RNAi有关。
病毒的蛋白质复制途径可能有多种，RNAi是否能像人们期待的那么有效？
2、 如果siRNA可以永久地关闭或者删除DNA片断，而不仅仅是短期的抑制它。那么动物细胞全能性受抑制的程度可能远远高于过去人们所想象的。干细胞的可塑性可能是由于可以产生特异的siRNA或其前体。干细胞通过细胞内的RNAi机制在发育过程中关闭或开放基因的表达，从而指导着细胞的定向分化。其中的siRNA有可能来自DNA的内含子。
3、 在研究基因时，可通过短期的抑制干细胞某个基因的表达来得知其功能。
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分子生物学实验室常用仪器及使用方法
实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用
事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。
TjpgDec技术手册
TjpgDec技术手册 -------R0.01b版 前言 相信大家对FATFS文件系统都不陌生了，2012年FATFS的作者推出了JPG/JPEG图片的解码函数库TJpgDec的R0.01b版，使用方法和FATFS文件系统的使用一样，仅仅调用2个简单的库函数就能完成对JPG/JPEG图片的解码，而且输出的数据格式为RGB888或RGB565。 本文档是根据ChaN的专用网页提供的英文版技术手册翻译而来，因个人水平有限以及时间仓促，错误之处在所难免。本文档原始版权归TJpgDec的作者所有，本人只是做了一下翻译的工作，把这篇文档献给所有嵌入式开发人员，希望能够帮到你们。 嵌入式奋勇前进 2013-10-20
一．前言： TJpgDec是一款为小型嵌入式系统服务的高效且完善的JPEG图片解码模块。它占用内存极少，因此可以移植入像AVR,8051，PIC,Z80，Cortex-M0等等小型单片机中。 二．特点： ?库函数是按照ANSI-C规范编写的，所以应用平台不受 约束。 ?易于使用的主模式操作方式。 ?完全可重入的架构。 ?非常小的内存占用： o RAM仅占用3KB，而不受图片大小的影响。 o ROM 占用3.5-8.5KB，主要用于存储代码和const 常量。 ?输出格式: o输出图片比例: 1/1, 1/2, 1/4 ，1/8 可选 o输出像素格式: RGB888/RGB565（可预设） 三．应用程序接口： 共有2个应用程序接口函数，用于分析和解码JPEG图片（译者注：移植TJpgDec时需要在主程序中调用这两个库函数） ?jd_prepare –为解码一个JPEG图片做准备 ?jd_decomp –解码JPEG图片 四．I/O接口函数： TJpgDec需要用户自定义2个I/O接口函数，用于输入JPEG数据和输出解码后得到的像素数据。 ?Input funciotn - 从输入的数据流中读取JPEG的数据 ?Output function –把解码后得到的像素数据发送到输出设备 五．备注说明： TJpgDec应用模块是一款可用于教育和研发的开源软件。你完全可以根据自己的项目需要或者商业产品的需要，自由更改本软件，而不用担负任何个人责任。 六．ChaN的个人网页：（即TjpgDec库函数下载地址）https://www.wendangku.net/doc/7212014322.html,/fsw/tjpg/00index.html 注：其他信息，如各版本信息，在此不作翻译了。
建筑试验员技术操作手册
目录 第一章、施工现场实验员工作管理 (1) 一、委托制度 (1) 二、标准养护室测试检查记录 (1) 三、工地实验管理 (1) 四、见证管理 (6) 第二章、水泥与钢筋材料试验 (10) 第一节、水泥 (10) 第二节、钢筋 (14) 第三章、其它原材料试验 (20) 第一节、砂子 (20) 第二节、石子 (24) 第四章、混凝土性能试验 (24) 第一节、普通砼 (27) 第二节、抗渗抗冻砼 (32) 第三节、泵送砼 (33) 第四节、大体积砼 (34) 第五章、建筑砂浆 (34) 一、砌筑砂浆 (35) 第六章、土工试验分析 (37)
第一节、土工试验概述 (37) 第二节、土工的工程分类 (37) 第三节、土的基本物理指标 (37) 第四节、含水率试验 (38) 第五节、密度试验 (39) 第六节、回填土试验 (43) 第七节、灰土 (44) 第八节、压实系数 (44) 第一章施工现场试验工作管理 、委托制度 1．凡送试各种原材料检验的单位，必须认真填写试验委托单。试验委托单要写明编号、试验名称、委托单位、取样地点、试件数量、产地、用于工程的部位、送样日期、需用日期和要求试验项目、需用试验报告份数及其他必须注明的内容。委托单必须有工地技术负责人和送试人签名或盖章。 2．各种配合比试验委托必须填写委托单。委托单要写明使用工程名称和部位、强度等级、各种原材料的产地、鉴定情况及掺合料、外加剂等。必须根据工程进度提前提出申请。 3．混凝土和砂浆试验报告、配合比申请单、工程部位等由委托单位填写。试验室负责填写收样日期、试验编号、试验结果，办理签字盖章手续 4．试样要和委托单对号无误 、标准养护室测试检查制度 1．标准养护室要设置混凝土养护架，砂浆和水泥试件养护箱。养护温度和湿度采用自动控制装置和喷淋式控制。 2?标准养护室的温度应保持在20 C 士2 C，相对湿度在90 %以上。记录温湿度分别用温度记录仪和湿度计。 3．进入标准养护室的试件应根据编号、龄期，并按顺序连续摆放进行养护。试件要摆放整齐，出入养护室要按编号、龄期有条不紊地进行。
微生物实验操作步骤
微生物试验操作步骤 1.前期准备工作（红色字体需要购买） 10ml离心管（80管）、培养皿（预实验36板，正式试验648板，共计684板）、EP管（预实验36管，正式试验108管，144管）、枪头（5ml、1ml、200ul）、生理盐水现配现用（0.85）2.，灭菌处理 将离心管、枪头、生理盐水、培养基放入高压灭菌锅中灭菌处理后待用。 3.制备不同梯度的样品溶液 预实验 a.梯度稀释试验前一天晚上取置于-80℃盲肠食糜样品于4℃冰箱融化，将需要用到的离心管和EP管分别编号待用。试验期间取盲肠食糜0.5~1g于灭菌后的10ml离心管中，按1：10比例加入生理盐水，制成10-1浓度的样品溶液。然后取0.5ml10-1浓度的样品溶液于下一离心管，按1：10比例加入生理盐水，制成10-2浓度的样品溶液。然后然后取0.1ml10-2浓度的样品溶液于EP管中，按1：1010-3比例加入生理盐水，制成10-3浓度的样品溶液。然后依次如上分别配制10-4、10-5、10-6、10-7、10-8样品溶液。每一次取样前离心管和EP管都要在微型振荡器上震荡混匀。 b.接种和培养：按照平板涂布法进行。分别取各稀释管溶液100μl接种到选择性培养基，大肠杆菌选择性培养基置普通培养箱，37℃培养24h。乳酸菌选择性培养基置5%CO2培养箱，37℃培养48h。双歧杆菌选择性培养基置厌氧发酵罐内，37℃培养48h。沙门氏菌选择性培养基置普通培养箱，37℃培养24h。 c. 微生物计数与鉴定：采用常规微生物平板菌落计数法，选择长有30-300个菌落的平板较为合适，用每克肠道内容物中细菌个数的对数表示( 1gCFU /g) 正式试验 按照预实验操作步骤及适宜梯度进行试验。 4.培养基 总需氧菌营养琼脂（NA）34567 乳酸菌MRS琼脂碱性厌氧234567 双歧杆菌BL琼脂厌氧234567产气袋 大肠杆菌麦康凯需氧234567 沙门氏菌XLD 需氧2345
常用化学仪器及使用方法、化学实验基本操作
常用化学仪器及使用方法、化学实验基本操作 知识分析： 包括的内容有1. 常用化学仪器及使用方法；2. 化学实验基本操作； 3. 物质的分离、提纯； 4. 常见气体的制备； 5. 物质的检验； 6. 常见试剂的保存； 7. 综合实验—实验方案的设计和评价。 在实验中复习对于基本实验要熟练掌握原理和基本操作，在此基础上，顺利地完成实验方案的设计。 常用化学仪器及使用方法 （一）1. 能直接加热的仪器 仪器图形与名称主要用途使用方法和注意事项 用于蒸发溶剂或浓缩溶液可直接加热，但不能骤冷。蒸发溶液时不可加得太满，液面应距边缘1厘米处。 常用作反应器，也可收集少量气体可直接加热，拿取试管时，用中指、食指、拇指拿住试管口占全长的1／3处，加热时管口不能对着人。放在试管内的液体不超过容积的1／2，加热的不超过1／3。加热时要用试管夹，并使试管跟桌面成45°的角度，先给液体全部加热，然后在液体底部加热，并不断摇动。给固体加热时，试管要横放，管口略向下倾。 用于灼烧固体，使其反应（如分解）可直接加热至高温。灼烧时应放于泥三角上，应用坩埚钳夹取。应避免聚冷。 燃烧少量固体物质可直接用于加热，遇能与Cu、Fe反应的物质时要在匙内铺细砂或垫石棉绒。 2. 能间接加热（需垫石棉网） 仪器图形和名称主要用途使用方法和注意事项 （分为50、100、250、500、1000ml等规格）用作配制、浓缩、稀释溶液。也可用 作反应器和给试管水浴加热等。 加热时应垫石棉网 根据液体体积选用不同规格烧杯 用作反应器（特别是不需加热的） 不能直接加热，加热时要垫石棉网。不 适于长时间加热，当瓶内液体过少时， 加热容易使之破裂。 用作在加热条件下进行的反应器 不能直接加热，应垫石棉网加热。所装 液体的量不应超过其容积1／2。 用于蒸馏与分馏，也可用作气体发生 器 加热时要垫石棉网。也可用其他热浴。 用作接受器 用作反应器，常用于滴定操作 一般放在石棉网上加热。在滴定操作中 液体不易溅出。 3. 不能加热的仪器 仪器图形与名称主要用途使用方法及注意事项 用于收集和贮存少量气体上口为平面磨砂，内侧不磨砂，玻璃片 要涂凡士林油，以免漏气，如果在其中 进行燃烧反应且有固体生成时，应在底 部加少量水或细砂。 分装各种试剂，需要避光保存时用 棕色瓶。广口瓶盛放固体，细口瓶 盛放液体。 瓶口内侧磨砂，且与瓶塞一一对应，切 不可盖错。玻璃塞不可盛放强碱，滴瓶 内不可久置强氧化剂等。 制取某些气体的反应器固体＋液 体 固体为块状，气体溶解性小反应无强热 放出，旋转导气管活塞控制反应进行或 停止。 （二）计量仪器 仪器图形与名称主要用途使用方法及注意事项
生物实验操作步骤
生物实验操作步骤 一、安装显微镜和对光： A 、操作步骤： 1.一手握住镜臂，一手托住镜座，把显微镜轻轻地放在实验台上，镜臂靠近身体略偏左，镜座距实验台边缘约5厘米。安装好目镜和物镜。 2.转动转换器，使低倍物镜对准通光孔。转动遮光器，使最大的光圈对准通光孔。 3、左眼注视目镜内，同时双手转动反光镜（光强用使用平面镜、光弱使用凹面镜），使光线反射到镜筒里，直到整个视野呈雪白色为止。 4.整理复位：把显微镜的外表擦拭干净。取下镜头放入镜盒内，并将镜筒缓缓下降到最低处。最后把显微镜放进镜箱里，放回原处。 B 、去年考卷： C 、评分标准： （1）安装好物镜和目镜（1分） （2）能将显微镜对好光观察（2分） 记录：雪白色或亮白色（1分） （3）整理器材（1分） 二、制作并观察洋葱鳞片叶临时玻片标本： A 、操作步骤： 1、用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦干净。 2、用滴管在载玻片中央滴一滴清水。 3、用刀片在洋葱内表面划一个“井”字，用镊子撕下表皮，然后把它放在载玻片中央的水滴中，用解剖针轻轻地将其展平； 4、用镊子夹起盖玻片，使其一边接触载玻片上面的液滴，然后缓缓地盖在液滴上，盖片时要防止装片上出现气泡； 5、在载玻片的一侧滴一滴碘液，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次，使染液浸润到整个标本； 6、安装显微镜和对光； 7、将制作的装片安放在显微镜的载物台上，然后将镜筒缓缓下降直到物镜接近玻片； 8、用左眼注视目镜，调节粗准焦螺旋使镜筒缓缓上升，直到在视野中看到细胞图像，然后旋转细准焦螺旋，使物像更清晰； 9、移动装片，在视野中找到一个完整的细胞进行仔细观察； 10、整理复位：取下玻片标本，平移方式（防止折断盖玻片）取下盖玻片并连同载玻片一起放回原处。取下镜头放入镜盒内，将镜筒下降到最低处，然后把显微镜放进镜箱里。把其他废弃物放入垃圾桶并把实验桌抹干净。 B 、去年考卷： C 、评分标准： （1）用纱布将载玻片、盖玻片擦拭干净（1分） （2）在载玻片中央滴一滴清水（1分） （3）用刀片切取一块洋葱鳞片叶，用镊子撕取鳞片叶的内表皮置于载玻片上清水中并用解剖针将表皮展平，盖上盖玻片（1分） （4）将一滴碘液滴在盖玻片的一侧，用吸水纸从对侧引流使碘液扩散到整个标本（1分） （5）将制作好的临时装片放在显微镜下观察（1分） 记录：气泡（1分） 细胞核（1分） 细准焦螺旋（1分） 左上方（1分） （6）整理器材（1分） 三、制作并观察口腔上皮细胞临时玻片标本： A 、操作步骤： 1、用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦干净； 2、用滴管在载玻片中央滴一滴生理盐水； 3、用清水漱口，清除口腔中食物碎屑，用消毒牙签粗的一端在口腔侧壁上轻轻刮几下； 4、将牙签上附着的碎屑放在载玻片的生理盐水中涂抹几下； 用镊子夹起盖玻片让一侧先接触生理盐水在轻轻放平，避免出现 。 你观察到的细胞内染色最深的结构是 如果想让物像更清晰，应转动 。如果物像在视野的左上方，应将玻片标本向 移动，才能使物像移到视野中间。
施工工艺(建筑工程技术指导手册)
建筑工程技术指导手册 1 总则 1.1农村危房改造重建要以保证困难农户重建房屋质量，保护困难农户生命财产安全，改善困难农户居住条件为基本原则，贯彻执行国家法律、法规及相关的标准规范。 1.2服从村庄、集镇、建制镇总体规划和建设规划，注重将农房改造重建与村庄整治、人居环境改善相结合。 1.3农村危房改造重建，要因地制宜采用合格的建筑材料，鼓励应用节能环保型的新技术、新材料、新工艺。 1.4本指导手册主要用于农村困难农户翻建新建二层（含二层）以下的自用住宅及附属用房。 2房屋选址 2.1新建房屋选址要符合规划要求。符合规划的建房户应尽量利用原宅基地恢复建设。有条件的地方，择址新建的房屋应与生态建设紧密结合，不占或少占耕地。 2.2房屋选址应选择稳定基岩，坚硬土，开阔平坦、密实、硬度均匀稳定的有利地段建房。避开活动断层和可能发生滑坡、山崩、地陷、非岩质的陡坡，突出的山嘴，孤立的山包地段，避开饱和砂层、软弱土层、软硬不均的土层和容易发生砂土液化的地段。 2.3选择向阳、通风良好的地段，避开风口和窝风地段。 2.4拟建房屋不能占压地下管线，应与各类电力线路保持安全距离（其中1千伏以下不小于4米，4千伏以下不小于6米），否则必须报告电力线路管理部门采取安全防护措施。 3房屋的建筑设计 3.1房屋建筑设计应围绕使用功能兼顾周围环境，鼓励建房人员采用本地区农房设计通用图集及新技术建设农房。 3.2房屋建筑设计体现以整体环境为中心的设计理念，兼顾农村地方特色，做好房屋外部环境的整体空间布局，处理好户外交往空间，要在保护、节约耕地
的前提下做到以实用为主，采取多种单元类型，系列化拼接，注意房屋建筑节能措施的实施和使用节能建材。 3.3房屋功能布局要做到生产功能与生活功能区分，实行人畜分离，采用科学合理的农村房屋家居功能模式。 3.4在建筑结构设计中要使用成熟的节能体系和节能环保建材；计算各结点承载力；确定窗墙比；提高门窗保温隔热性能和气密性；合理选择朝向；综合利用新能源、可再生能源。 3.5对主要持力层范围内存在软弱粘性土层的地基，应设置钢筋混凝土圈梁或进行地基加固处理。 3.6 在抗震设防地区，要充分考虑抗震设防要求；在雷区应考虑防雷设防要求。 4基础工程 4.1基础地基选择 4.1.1 基础持力层应落在中硬土以上地质均匀的老土层上，基础埋深不少于500毫米。 4.1.2 当基础地基出现软硬不均时，对软土部分进行处理，挖成台阶型，使地基持力层土质相对均匀一致。 4.1.3 当基础持力层落在斜面岩层上时，基槽应挖成台阶型并应有镶固，防止基础滑移。 4.1.4 在坡顶建房，基础应距边坡一定距离，具体视地质情况定。当边坡角大于45°、坡高h大于8米时，应请专业技术人员进行边坡稳定性验算，防止圆弧滑动。对于稳定的边坡，基础底面外边缘线至坡顶水平距离L不得小于2.5米。如所建房屋临近边坡底部，在确保边坡安全稳定的情况下，也应与边坡保持一定距离。 4.2毛石基础施工 4.2.1 砌筑毛石基础的第一皮石块时，基底应用高强度等级的砌筑砂浆找平坐浆，石块大面向下，并选择比较方正的石块砌在各转角处。 4.2.2 应根据石块自然形状交错位置，尽量使石块间缝隙最小，然后将砂浆填在空隙中，并且铁钎插捣密实。严禁采取先放小石块后灌浆的放法。 4.2.3 基础最上一皮石块，宜选用较大的毛石砌筑。基础的第一皮及转角处、交接处和洞口处，应选用较大平毛石砌筑。 4.2.4 毛石基础的转角及交接处应同时砌筑。如不能同时砌筑又必须留槎
细胞培养实验技术手册
实验记录 24/2/2014 一、细胞培养 一、培养基的配制 a. RPMI 1640 1×（with L-glutamine）类培养基组分：RPMI ，10%FBS（胎牛血清），双抗生素（penicillin，盘尼西林（青霉素），streptomycin，链霉素）； 配制方法：500 ml RPMI(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 b. DMEM 1×类培养基组分：DEMI，10% FBS，双抗生素； 配制方法：500 ml DMEM(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 二、培养细胞RNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液； 2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液指最高处打出）。重复以上操作一次。 3. 每孔中加1 ml Trizol ，吸出放-80℃冰箱冷冻。 三、培养细胞DNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液； 2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液至最高处打出）。重复以上操作一次。 3. 向培养板中加酶消化（时间较长，放进培养箱，看到有白色悬浮后取出），取出加DMEM类培养基； 4. 吸出至1.5 ml 离心管，3600 rpm，4 min离心； 5. 吸出上清（不要触及沉淀），加PBS 1ml清洗，3600 rpm，4 min离心； 四、常用细胞系（人） 名称细胞类型来源核型培养液 A431 上皮型表皮细胞肿瘤非整倍体（76，XX）DMEM+10%FBS HeLa 上皮样宫颈癌非整倍体（81-83，XX）MEM+NEAA 10%FBS Hep G2 上皮样肝细胞癌非整倍体（55，XY）MEM+NEAA 10%FBS MEM：极限必需培养液（Eagle）；NEAA：非必需氨基酸；DMEM：Dulbecco’s MEM改良培养液；RPMI：Roswell Park Memorial 研究所；BrdU：5-溴脱氧尿苷；APRI：腺苷磷酸核糖转移酶 实验室除snu系列与国产7721用1640培养基，其它用DMEM培养基。 五、原代培养----肝细胞 1.切除乳鼠肝脏组织放进小烧杯中，用PBS或培养液漂洗2-3次，去除血污； 2.加少量培养液，用剪子把组织剪碎，1 平方mm左右，再用吸管吹打； 3.加含10%小牛血清的1640培养液，制成均匀的细胞悬液，移入培养瓶，将组织块放在培养瓶底部，采用薄层营养液培养法，盖上瓶盖。 4.换液，只将旧的培养液吸弃，换上新的培养基。 六、传代培养 1.显微镜观察是否需要传代 细胞生长良好：上清液清亮，无悬浮物，折光性好，均质而透明，胞膜完整，胞内颗粒少，无空泡和脂滴。细胞生长不良：悬浮物多，发差增大，胞膜不完整，胞质中颗粒多，出现空泡和脂滴。
实验室化学技术手册-麻省理工
警示：这些材料所叙述的实验可能是危险的，因此需要高标准的安全训练、特殊的设备和装置，并在合适的人员监管下才能进行。对于履行这样的安全程序和措施，你负有全部的责任和义务，并独自承担其风险。对于所提供的任何材料的内容或其执行情况，MIT 将不负任何责任和义务，不承担任何风险。法律提示 麻省理工学院化学系 实验室手册 5.301 化学实验技术 Katherine J Franz和Kevin M Shea编写 Rich L Danheiser和Timonthy M Swager教授协助编写 J Haseltine, Kevin M Shea和Sarah A Tabacco修改 IAP 2004
目录 1．简介 1.1. 概述 3 1.2. 教材 4 1.3. 导读 5 1.4. 等级 6 1.5. 日程安排 7 1.6. 怎样使用本手册 8 1.7. 实验室介绍 9 2. 转移和萃取技术 2.1. CC：“乙酯的轻松之旅” 14 2.2. EE：酸、碱及其互变 17 3. 重结晶纯化固体 3.1. CC：怎样对樟脑球进行重结晶？ 19 3.2. EE：单晶培养 21 4. 蒸馏纯化液体 4.1. CC：“桃子是怎样进入香蕉的？” 24 4.2. EE：高海拔下应该怎么操作? 26 5. 快速柱色谱纯化法 5.1. CC：“外观可能是欺骗性的” 28 5.2. EE：设定速度 30 6. 蛋白质鉴定和误差分析 6.1. CC：“牛的心脏里有什么呢？” 32 6.2. EE：“我心坚如磐石” 35 7. 原创性研究介绍 7.1. Mn(salen)配合物催化烯烃的环氧化反应 37 1
防水工程技术手册
防水工程技术手册（2015版－1） 设计工程部
目录： 第一部分：总说明 第二部分： 第一节：屋面露台防水部分（设计要求）——————————————————第05页第二节：屋面露台防水部分（施工要求）——————————————————第10页第三节：墙面防水部分（设计要求）————————————————————第20页第四节：墙面防水部分（施工要求）————————————————————第24页第五节：厨卫防水部分（设计要求）————————————————————第29页第六节：厨卫防水部分（施工要求）————————————————————第29页第七节：门窗及幕墙防水部分（设计要求）—————————————————第30页第八节：门窗及幕墙防水部分（施工要求）—————————————————第32页第九节：地下室防水部分（设计要求）———————————————————第33页第十节：地下室防水部分（施工要求）———————————————————第37页第三部分：具体案例分析
第一节：常见案例分析——————————————————————————第38页第二节：特殊案例分析——————————————————————————第47页第四部分：相关项目实施大样 第一节：常见部位大样——————————————————————————第50页第二节：特殊部位大样——————————————————————————第56页第三节：施工流程大样——————————————————————————第58页 第一部分：总说明 1总说明 防水工程的设计及施工应遵循“防、排、截、堵相结合，刚柔相济、因地制宜，综合治理的原则”，做到先排后防，即首先不能有积水，要将水在短时
实验技术手册(细胞免疫方面)
单克隆抗体的制备 1975年，K?hler和Milstein创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体，单克隆抗体具有特异性高，灵敏度高，重复性好，可供应量大，检测时间短以及能够查出混合物中的少量成分等优点。 1试验材料 1.1试验动物和细胞 雌性6～8周龄BALB/c小鼠 SP2/0骨髓瘤细胞 1.2主要实验试剂 HRP标记羊抗小鼠IgG、福氏完全佐剂（FCA）、福氏不完全佐剂（FIA）、聚乙二醇（PEG）、二甲基亚砜（DMSO）、降植烷、TMB底物、HAT(50×)、HT(50×)、三抗溶液（100×）小鼠单抗Ig类和亚类鉴定用ELISA试剂盒均为SIGMA公司； DMEM粉、特级胎牛血清（FBS）均为GIBCO公司； 牛血清白蛋白（BSA） 1.3主要实验仪器和耗材 CO2细胞培养箱（Thermo和上海新苗医疗器械制造有限公司WJ-160B-Ⅲ） 酶联检测仪（BIO-RAD Model 680） 血球计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司） pH计（Sartorius赛多利斯科学仪器） APL高压灭菌锅（CL-32L） 生物安全柜(ESCO北京五州东方科技发展有限公司) 三恒电泳仪（JY600C） 数显恒温磁力搅拌器（78HW-1，杭州仪表电机有限公司） 电子分析天平（Sartorius赛多利斯科学仪器） 分光光度计（WPA Biowav eⅡ+） 进口液氮罐（Thermo） Protein A柱 恒温水浴锅（HH-2金坛市科兴仪器厂） 微型台式真空泵（GL-80ZB型，海门市） 电热恒温培养箱（DHP-9032上海天恒医疗器械） 低速离心机 (L-550长沙湘仪离心机仪器有限公司) 高速冷冻离心机（SIGMA 2-16PK） 倒置显微镜（Nikon TS100） 超低温冰箱(Thermo) 96孔酶标板（） 96孔、24孔细胞培养板、T25培养瓶、35mm培养皿、60mm培养皿、100mm培养皿、冻存管0.22μm过滤器(PALL) 2主要试剂配制 2.1常规试剂配制 PBS（或PB）（0.02mol/L，pH7.4）： A液（0.2 mol/L Na2HPO4）：Na2HPO4·12H2O 71.64g,加蒸馏水至1000ml；
化学实验基本操作
化学实验基本操作 一、药品的取用 1、实验室所用的药品，很多是易燃、易爆、有腐蚀性或有毒的，为保证安全，在取用药品时，不能用手接触药品、不要把鼻孔凑到容器口闻药品，不得尝任何药品的味道。 2、取药品应按实验规定的用量取用，没有说明用量，一半应该按最少量取用：液体1-2ml，固体只需盖满试管底部。 3、实验剩余的药品既不能放回原瓶，也不要随意丢弃，更不要拿出实验室，要放入指定的容器内。 4、取用固体药品一般用广口瓶，块状的可用镊子夹取。用过的药匙或者镊子要立刻用干净得纸擦拭干净，以备下次使用。 5、往试管里装入固体粉末时，为避免药品沾在管口和管壁上，应做到一斜二送三直立，即先使试管倾斜，把药匙小心送到试管底部，然后使试管直立起来，让药品全部落到底部。 6、把块状的药品或者密度较大的金属颗粒放入玻璃容器时应做到一横二放三慢竖，即应该先把容器横放，把药品放入容器口以后，再把容器慢慢地竖立起来，使药品或者金属颗粒缓缓地滑到容器的底部，以免打破容器。 7、液体药品通常盛在细口瓶里。取用药液时，先拿下瓶塞，倒放在桌面上，然后拿起瓶子，瓶口要紧挨着试管口，使液体缓慢地倒入试管。倾倒时，标签要朝向手心，以防止药品腐蚀标签。 8、取用一定量的液体药品，也可以用量筒量出体积，量液时量筒必须放平，视线要跟量筒内液体凹液面的最低处保持水平，如果俯视读数时所量体积大于（大于或小于）实际体积，仰视读数时所量体积小于（大于或小于）实际体积。 9、滴管是用来吸取和滴加少量试剂的一种仪器，取液后滴管滴加时垂直、悬空放在烧杯正上方，试剂便滴入烧杯中。 10、实验中要特别注意保护眼睛，万一眼睛里进入药液，要立即用水冲洗（切不可用手揉眼睛），洗的时候要眨眼睛，必要时请医生治疗，提倡使用防护眼镜。 二、托盘天平的使用 1、托盘天平能准确到0.1g。 2、化学实验称量的药品，常是一些粉末状或是易潮解的，有腐蚀性的药品，称量时应在两个托盘上各放一张质量相同的纸，如果称量易潮解、有腐蚀性的药品，应放在玻璃器皿如烧杯、表面皿里进行称量。 三、连接仪器装置 把玻璃管插入橡皮塞和胶皮管时，先要把玻璃管口用水润湿，在容器口塞橡皮塞时，切不可把容器放在桌上再使劲塞进塞子，因为这样做容易压破
EtherCAT技术手册
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初中生物实验操作步骤
实验名称：观察植物细胞 1、用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净 2、把载玻片放在试验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水。 3、①用镊子从洋葱鳞片叶内侧撕取一小块透明薄膜内表皮。②把撕下的内表皮浸入载玻片的水滴中，用镊子把它展平。 4、用镊子夹起盖玻片，使它的一边先接触载玻片上的水滴，然后缓缓地放下，盖在要观察的材料上。 5、把一滴稀碘液滴在盖玻片的一侧。染 6、用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，使染液浸润标本的全部。 观察人的口腔上皮细胞 1、用干净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净。 2、把载玻片放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水 3、用凉开水把口漱净。用消毒牙签从口腔侧壁处轻轻刮几下，牙签上就附着了一些碎屑。把牙签放在载玻片的生理盐水滴中均匀地涂抹几下。 4、用镊子夹起盖玻片，使它的一侧先接触载玻片上的液滴，然后缓缓放平。 5、在盖玻片的一侧滴加稀碘液（染），另一侧用吸水纸吸引，使染液浸润到标本的全部。 观察鸡卵的结构 1.取一个鸡卵，观察其外部形态。（放大镜，气孔） 2.将鸡卵的钝段轻轻敲出裂纹，将碎裂的卵壳连同紧贴壳的膜除去，观察鸡卵的气室。（镊子，卵壳，外卵壳膜和气室） 3.用剪刀将气室下的内卵壳膜剪破。（剪刀） 4.将卵壳膜内的卵白和卵黄转移到培养皿中，卵黄完整。（培养皿） 5.观察鸡卵的结构。若未见胚盘，可用镊子夹起细系带把卵黄轻轻翻转。 观察种子的结构 1.观察菜豆种子的结构 ⑴取一粒浸软的菜豆种子，观察它的外形[来源:学|科|网Z|X|X|K] ⑵剥去种子最外面的一层薄皮-------种皮，分开合拢着的两片子叶。 ⑶用放大镜仔细观察子叶.胚根.胚轴和胚芽，看看它们各有什么特点？ 2观察玉米种子的结构 ⑵一粒浸软的玉米种子，观察它的外形。 ⑵用刀片将这粒种子从中央纵向剖开。 剖面上滴一滴碘液，在用放大镜仔细观察被碘液染成蓝色的胚乳以及未被染成蓝色的果皮和种皮，胚芽，胚根，胚轴和子叶，看看它们各有什么特点？ 测定某种食物中的能量 1．取一只锥形瓶（50毫升），量筒量取30毫升水注入其中，再将它固定在铁架台上。 2.再锥形瓶里放入一支温度计（温度计下端要浸入水中，但不要接触锥形瓶的瓶底） 3.参照右图安装好试验装置，并测定水温。 4.称出一粒干燥花生种子的质量，将这粒种子放倒火焰上点燃， 5.将刚刚燃烧的花生种子尽快放倒锥形瓶底部。待这粒花生种子完全燃烧后，测量水温。 6.计算：Q=CM△T=30×4.2×（t2－t1）(把测量的温度代入，得出数据)
生物实验操作步骤
生物 一、A类实验操作练习题 1.用显微镜观察洋葱鳞片叶表皮细胞 实验器材及设置：显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、纱布、滴管、单面刀片、镊子、清水、稀碘液、解剖针、小块木板、洋葱鳞片叶、擦镜纸（备用）。 [附]显微镜状态:目镜已安装好，最大光圈对准通光孔，转换器上两个物镜位于通光孔两侧，呈外八字形，镜筒降到最低处。 实验要求：（1）制作洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片； （2）用显微镜观察洋葱鳞片叶表皮细胞。 方法步骤： （一）、制作洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片 1. 准备用洁净的纱布把载玻片和盖玻片擦拭干净；用滴管在载玻片中央滴1-2滴清水。 2. 取材用刀片切取一块洋葱鳞片叶（大约0.5cm2），用镊子撕取洋葱鳞片叶的内表皮；把撕取的表皮浸入载玻片上的水滴中，并展平。 3.盖盖玻片用镊子夹起盖玻片，使它的一边先接触载玻片上
的水滴，然后缓缓地放下，盖在要观察的材料上。 4.染色把一滴碘液滴在盖玻片的一侧，用吸水纸从盖玻片的另一侧吸引，使染液浸润标本全部。 （二）、用显微镜观察洋葱鳞片叶表皮细胞 1.取镜与安放一手握镜臂，一手托镜座，把显微镜放在实验台中央略偏左，距实验台边缘约7cm。 2.对光上升镜筒，转动转换器，使低倍物镜对准通光孔；一只眼注视目镜，另一只眼睁开，同时转动反光镜，使视野明亮。 3.安放玻片将玻片轻放载物台上，标本正对通光孔的中心，用压片夹压住玻片的两端。 4.调焦双手转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，同时眼睛从侧面看着物镜下降，直到物镜接近玻片；一只眼注视目镜，同时转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升至视野中出现物像，微调细准焦螺旋使物像清晰。 5.观察移动玻片，将物像移到视野中央，在低倍镜下观察洋葱鳞片叶表皮细胞。 2.用显微镜观察人的口腔上皮细胞 实验器材及设置：显微镜、载玻片、盖玻片、吸水纸、纱布、滴
公司工程技术资料管理手册
榆林神华能源有限责任公司 工程技术资料治理方法 (试行） 第一章总则 第一条为规范矿、土、安工程技术资料（以下简称资料）治理，提高工程质量治理水平，统一资料验收标准，建立完整、准确、规范的工程档案，依照《中华人民共和国建筑法》、《建设工程质量治理条例》、《建设工程文件归档整理规范》及国家、地点和神华集团现行有关法律、法范、规范、标准和规定，结合公司实际情况，制定本方法。 第二条本方法适用于榆林神华能源有限责任公司新建、改建、扩建的矿、土、安三类工程及其配套工程资料的编制、治理。参与工程建设的有关单位均应执行本方法。 第三条本方法与国家、地点及神华集团公司现行的法律、法规、规范、标准及规定相抵触的，执行国家、地点及神华集团公司的相关要求。 第二章参建方责任 第四条资料形成责任单位应对资料内容的真实性、完整性、有效性负责；由多方形成的资料，要各负其责。
第五条参与工程建设的有关单位应将资料的收集和整理纳入工程建设治理的各个环节及有关人员的职责范围。 第六条建设单位对工程预备时期、竣工验收时期形成的资料进行收集、整理和立卷，同时组织、监督和检查其他参与工程建设有关单位的资料形成、积存和立卷工作，并负责工程档案的归档。 第七条监理单位应按施工进度对施工资料的收集、整理及资料的完整性、准确性进行检查和审核。 第八条施工单位负责资料的收集、整理和立卷归档工作。 施工单位应建立健全内部工程技术资料治理体系，实行企业技术负责人负责制。工程项目的资料收集整理应由专人负责。施工单位资料员应在项目部技术负责人的指导下，负责资料督促收集、整理归档工作。资料员应严格按照《建筑工程资料归档规范》的要求，切实履行岗位职责，认真做好工程资料收集整理、立卷归档工作，不得代替他人编写工程施工资料。 实行总承包的工程项目，总承包单位负责汇总整理各分包单位的资料，并编制全部资料。分包单位应对各自分包项目的资料进行收集整理。在分包工程验收合格后，将施工资料及时移交总承包单位。
蛋白质组技术实验手册
第一部分组织和细胞蛋白样品的制备 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 组织和细胞的来源： 1.1.2 仪器设备 机械组织匀浆器 低温高速离心机(>40,000 g) 超速离心机 超生细胞破碎仪 超纯水装置 1.1.3 试剂 三氯醋酸(TCA) 丙酮 二硫苏糖醇(DTT) 尿素 CHAPS PMSF EDTA 乙醇 磷酸 考马斯亮蓝R350 抑肽素A 亮肽素 ●试剂纯度均应是分析纯或以上。
1.1.4 溶液配制 (1)PBS： NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L； (2)EDTA 储存液： 18.61 g Na2EDTA·2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约 需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用； (3)亮肽素储存液(50 μg/ml，100×) 10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存； (4)抑肽素储存液(70 μg/ml，100×) 1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存；使用时配成70 μg/ml储液，-20℃保存； (5)PMSF储存液(10 mM, 100×): 17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。 (6)DTT 储存液(1 M): 0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃保存(DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处 理，可过滤除菌)。 (7)裂解液: Lysis buffer A (9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Final concentration Amount 9 M 10.8 g Urea (FW 60.06, Sigma, >99.5%) 4% (w/v) 0.8 g CHAPS (FW 614.89, Sigma, >98% Ultrapure H2O to 20 ml prepare fresh or store in aliquots at –20℃ A cocktail of protease inhibitors DTT(FW 154.25, Promega) 1% 13 μL/200 μL Lysis buffer (15.5×stock), -20℃
化学实验基本操作方法
化学实验基本操作方法 （一）常见计量具的使用 （二）药品的取用 （三）加热、蒸发 （四）溶解、过滤、结晶 （五）蒸馏、升华 （六）分离液体、萃取 （七）纸上层析 （八）渗析 （九）气体的收集、贮存与净化 （一）常见计量具的使用 1.量筒、量杯 实验室中计量取用一定体积的液体用。为准确读出量筒（或量杯）液体体积，必须把量筒放置在水平的桌面上，使眼睛的视线，刻度、液体凹面的最低点处在同一水平上。 量筒（或量杯）不能用来加热，也不能用来配制或稀释溶液，热溶液须冷至室温时，方可使用量筒（或量杯）量取。 2.滴定管的使用
当需要精确而方便地量取少量液体或做滴定实验时，常使用滴定管。 酸式滴定管使用较多，不能用来盛放碱液。酸式滴定管有无色和棕色两种，见光易分解的试液如硝酸银溶液滴定时，应置于棕色酸式滴定管中。 碱式滴定管下端套有一小段橡皮管，将滴头和管身相接，凡是能与橡皮管作用的物质，如高锰酸钾、碘、硝酸银等溶液，尤其是氧化性酸，不能使用碱式滴定管。 使用滴定管前，先检查是否漏水。将盛水滴定管夹在滴定管架上，仔细观察有无水从活塞隙缝中渗出或尖嘴处滴下。如果发现酸式滴定管活塞有漏水现象，应把塞子拔出来，用滤纸将活塞及活塞槽的水和凡士林擦干净，然后在活塞的周围重新涂上一薄层凡士林（不要太多堵住小孔），插入塞孔，向同一方向旋动活塞至外部观察全部透明为止。用一根橡皮筋将活塞套在滴定管上，用蒸馏水将滴定管洗净，再用滴定溶液润洗2～3次，润洗液要从下端放出。加入溶液后，先要把活塞或胶管处的气泡赶出，再调节液面至刻度“0”或“0”以下。排除停留在酸式滴定管的气泡，可用右手拿住滴定管，左手迅速开足活塞，让急流冲走气泡。如冲不走，可斜拿滴定管，再开大活塞冲。赶走碱式滴定管尖端气泡时，要弯曲橡皮管，让尖嘴管斜向上方，并挤压橡皮管的玻璃球使液体向上喷出，如果碱式滴定管漏水，应更换橡皮管或玻璃球。 使用酸式滴定管时，应该用左手拇、食、中三指旋转活塞，控制流量。右手拿住接受液体的容器。如图5-15。使用碱式滴定管时，用左手捏在玻璃球外胶管的上部，无名指和小指夹住尖嘴管，使它垂直向下，轻轻挤压胶管，让液体从胶管和玻璃球的隙缝间流出。如图5-16。 3.移液管 移液管又叫吸量管，用以精确移取一定体积的液体。