浅谈滋养层细胞在胚胎植入中的作用

题目：浅谈滋养层细胞在胚胎植入中的作用院-系：生命科学与技术学院

专业：08生科

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上课时段：周二（10、11）

浅谈滋养层细胞在胚胎植入中的作用

摘要：胚胎植入是哺乳动物生殖的关键环节, 是一个非常复杂的过程。本文通过滋养层细胞的来源、生长、功能分化对滋养层细胞进行了概要的叙述，并对滋养层细胞在胚胎植入中的作用的阐述,为进一步阐明胚胎植入的分子机制提供思路。

关键词：胚胎植入；滋养层细胞

Abstract:Embryo implantation is an important and complicated physiological process in mammalian reproduction.The paper introduce embryo implantation by elaborating the origin growth, functional differentiation of trophoblast cells .The aim of the review is to suppor t some idea oft he molecule mechanism in the embryo implantat ion by expatiating the role of embryonic tr ophocytes in imbedding.

Key words: trophcyte; embryo implantation;

胚胎植入(emb ryo imp lan tat ion) 是指从卵子受精到胚泡着床的一系列细胞或分子生物学事件, 主要包括游离胚泡(f ree b lastocyst)、粘附和穿透(at tachmen t and penet rat ion)以及胎盘形成(p lacen tat ion) 。这一过程受许多因素的精确调节。激素、细胞因子、生长因子、粘附分子和细胞外基质均参与调节哺乳动物胚胎植人过程。在整个胚胎植入过程中,这些调节因素的表达、合成与分布状态沿着一定的空间和时间顺序发生变化, 而且它们之间存在着广泛的联系[1]。能否成功的植入取决于胚泡侵入性和子宫内膜接受性的密切合作。位于胚胎外围的滋养层细胞在胚胎侵入过程中发挥着关键的作用, 它通过分泌系列细胞因子和激素行使妊娠识别作用, 还通过分泌这些因子、激素的作用使胚胎对子宫内膜发生粘附及侵入的作用[2]。

1.1 滋养层细胞的来源

早期胚胎发育至囊胚时, 胚体细胞分为两层,外层细胞为滋养层细胞( t

rophoblast ) ; 内层为内细胞团(inner cell mas s) , 此时整个囊胚称为胚泡( blastocyst ) 。滋养层将来发育为绒毛膜、胎盘等胚外器官, 而内细胞团以后则发育为胚体及卵黄囊、尿囊、羊膜等[3]。

1.2 滋养层细胞的生长

滋养层细胞的生长与胚胎侵入和胎盘的发育同时进行,受促进因素和限制因素两个方面调控[4]。滋养层细胞的生长包括两个阶段,即原始血管网生成阶段和血管微循环结构生成阶段。血管内皮生长因子(VEGF) , 血小板衍生生长因子(PDGF) ,血小板活化因子( PAF)和血管生成素在早期的血管发育中至关重要。由间质细胞产生的肝细胞生长因子(HGF)和其c2met酪氨酸激酶受体在上皮细胞表达,参与调节滋养层细胞分化和生长,并且调节侵入的深度。其他参与调节滋养层生长的因子包括白细胞介素1 ( IL21)、干细胞因子、CSF21、IG F和T辅助细胞因子( Th) 。IL21和细胞集落刺激因子21都能够刺激滋养细胞生长和功能的发挥, IGFBP21、Th21、IFN2γ及TNF则可能会限制滋养层生长。这些相同的细胞因子/生长因子也可能影响滋养细胞生产人绒毛膜促性腺激素和黄体酮[5]。

1.3 滋养层细胞功能的分化

靠近子宫内膜的滋养层细胞分裂时只发生核分裂, 细胞质不分裂, 形成多核细胞。早期滋养层细胞叫细胞滋养层, 而多核细胞则构成合胞体滋养层(syncytiotrophoblast STB) , 也可以称为滋养层巨细胞。细胞分化导致其功能分化, 细胞滋养层通过一系列粘着分子附着到子宫壁及子宫内膜(endomet rium) 上。合胞体滋养层组织使胚胎和子宫联系更进一步, 子宫向合胞体滋养层发出血管, 并最终与合胞体滋养层接触, 胚外中胚层和滋养层细胞上的突起相连产生血管, 把营养由母体输送给胎儿, 胚胎和滋养层相连的胚外中胚层狭窄的基柄最终形成脐带( umbilical cord) 。合胞体滋养层细胞充分发育后, 形成由滋养层组织和富含血管的中胚层构成的器官绒毛膜(chorion)。绒毛膜和子宫壁融合形成胎盘[6]。

2 胚胎植入及其影响因素

胚胎植入( implantantion ) 又称胚胎着床( imbed) , 是胚胎到达子宫进行定向定位后, 与子宫内膜上皮接触、粘附, 并侵入子宫内膜基质中,建立胚胎发育所必需条件的过程。成功的植入取决于胚泡侵入性和子宫内膜接受性的密切合

作。这两个方面与细胞分化/发育状态有关。细胞在生长发育过程有两种主要表型: 间充质/成纤维型和上皮型, 并能进行上皮-间充质表型转换(ep ithelial2mesenchymalt ran sfo rmat ion, EM T )。胚泡的滋养层细胞在转成侵入性时, 必须丢弃部分典型的上皮细胞特性: 顶质膜上表达细胞粘附分子, 或改变其运动特性。同样, 子宫上皮细胞在接受性的获得过程中, 极性结构逐渐消失, 甚至一些特征性蛋白(如钙粘蛋白、波形蛋白) 表达改变。子宫上皮细胞还发生行为变化, 以利于滋养层细胞侵入, 如在啮齿类动物中, 子宫上皮细胞从基膜处分离;人类和家兔, 上皮细胞通过向基膜伸出突起, 呈现一种半侵入行为[1]。

3 滋养层细胞在胚胎植入中的作用

3.1 滋养层细胞所分泌细胞因子和激素的作用

胚胎着床包括胚泡在子宫内膜的迁移、定位、粘附、入侵及子宫内膜蜕化反应等过程。滋养层细胞可分泌多种细胞因子, 参与局部的免疫调节。现已证实, 滋养层细胞可分泌集落剌激因子-Ⅰ(CSF-Ⅰ) , 粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子( GM-CSF) 、IL-1、IL-6、I L-10、TNF-、TGF- 、IFN-等[7]。此过程中, 胚胎外围滋养层这些物质作为一种化学信号, 对子宫上皮细胞起作用, 以抑制前列腺素的分泌, 维持功能性黄体产生孕酮, 刺激和维持子宫内膜功能, 支持早期胚胎发育。同时滋养层细胞还通过自分泌途径, 分泌多种细胞因子和激素, 如IL、EGF、CSF、IGF、绒毛膜促性腺激素等使胚胎作好侵入准备。使母、胎双方达到最佳结合状态[2]。

3.1.1 表皮生长因子

表皮生长因子是由53 个氨基酸组成的多肽, 其受体为一跨膜糖蛋白, 具有酪氨酸激酶活性,EGF与EGFR结合引起EGFR构象发生变化, 激活位于羧基端的酪氨酸激酶, 启动一系列生物学反应。EGF可以促进生殖系统细胞增殖和分化, 促进子宫内膜细胞发生蜕膜化, 介导性激素的某些功能, 其作用与类固醇激素的作用类似。有人实验证明在妊娠第4天切除卵巢用孕酮维持延迟着床的小鼠, 子宫内注射EGF成功地启动了胚胎着床[8] 。在体外培养基中加入EGF明显能增加胚胎的孵化率和生长率, 滋养层细胞的侵入能力能增加几倍。

3.1.2 白细胞介素（IL-1）

滋养层细胞可产生IL-1, 通过旁分泌作用于母体免疫系统,在植入过程中,

胚胎和子宫内膜产生的IL-1通过旁分泌和自分泌途径,协调子宫内膜和胚胎之间联系,促使植入顺利完成。其作用机制还不明确。IL-1ra是IL-1受体的拮抗剂, 小鼠腹腔注射IL-1ra可阻止小鼠胚泡着床。临床上,胚泡能着床的妇女IL-1水平明显高于胚泡不能着床的妇女。说明IL-1在胚胎植入中发挥了重要作用。采用一种研究滋养层细胞侵入的体外模型(JEG-3在用mat rigel包埋的滤膜上培养) , 研究IL-15对细胞滋养层细胞侵入能力的影响, 发现IL-15可增加细胞滋养层细胞( JEG-3)的胶原水解活性, 且MMP-1浓度增加, 而MMP-2 及MMP-9、TIMP-1的浓度均无变化。IL-15对滋养层细胞的增殖无明显影响, 而能提高其迁移能力和侵入能力。另外, 据推测IL-15还与滋养层细胞侵入过程中细胞粘附分子表型的变化有关[9]。

3.1.3 胰岛素样生长因子( IGF)

滋养层细胞可分泌IGF,与蜕膜细胞产生的IGF结合蛋白( IGFBP-1 )共同刺

激滋养层细胞的侵入和迁移,另外对滋养层细胞明胶酶或溶血酶原激活因子的分泌无影响, 说明IGF和IGFBP以自分泌/ 旁分泌的方式主要通过刺激细胞迁移增强滋养层细胞的侵入行为[10]。另外, 两者对滋养层细胞明胶酶或溶血酶原激活因子的分泌无影响, 说明IGF 和GFBP 以分泌/ 旁分泌的方式主要通过刺

激细胞迁移增强滋养层细胞的侵入能力, Jasinska A2004 对狒狒实验表明IGF促使子宫膜发生蜕膜化[11], 这也很好的证明了IGF能促进滋养层细胞的侵入。

3.1.4 集落刺激因

滋养层细胞还可表达激落刺激因子1 (CSF-1) ,CSF-1由子宫内膜巨噬细胞和内膜上皮分泌。有两种类型：可溶性CSF-1，可促进胚胎发育；膜结合的CSF-1，存在于子宫内膜上皮，可与胚泡滋养细胞表面的CSF-1受体结合。孕第1天小鼠中可测到CSF-1，孕第5天CSF-1分泌量是第1天的5倍，转基因小鼠CSF-1缺陷者，其孕卵不能着床[12]。Omigbodun A 等1998 实验证明CSF-1能增加纤连蛋白的分泌及表达, 也能增加整合素-5亚基的表达[2] 。这些对胚胎植入起着重要作用。

3.1.5 激素

滋养层巨细胞能分泌hCG, 侵袭性滋养层细胞上有hCG受体的表达, 提示hCG 在滋养层侵入调节中有重要作用, 采用滋养层细胞株( JEG-3) 体外模型的研究表明, hCG在体外可显著增加JEG-3细胞的侵入能力, 且表现出一定的剂量效应,同时,hCG还可以促进滋养层细胞的运动[13] 。第二信使的模拟物dbcAMP

( cibutyrylcAMP)以及cAMP促进剂(forskolin)可模拟HCG的作用, 促进JEG-3 细胞的侵入。HCG还可以增加滋养层细胞JEG-3的胶原溶解活性, 而对滋养层细胞的增殖无影响。说明滋养层细胞产生的hCG可通过自分泌和旁分泌的方式调控滋养层细胞的侵入过程[14]。

3.2 滋养层细胞在胚胎粘附与侵入子宫内膜中的作用

胚胎附植是在母、胎双方和谐状态下发生的,而胚胎方面起着主动侵入的作用, 侵入过程首先需要滋养层细胞对子宫内膜基质的粘附、然后发生类似肿瘤细胞的浸润。其粘附需要细胞外基质( ECM)与整合素的连接, 侵入需要基质金属蛋白酶( MMP)对ECM的降解。

3.2.1粘附性作用

粘附分子分为4大类：整合素家族、钙调素家族、选择素家族及免疫球蛋白超家族。其中整合素和钙调素直接参与子宫的功能性变化，与胚胎着床有关。其表达障碍可导致胚胎着床能力低下、着床后血管重铸障碍，造成不孕或病理妊娠[15]。

胚胎发生粘附作用主要是通过滋养层细胞分泌整合素, trophinin、tast in、byst in、钙粘素、细胞外基质、连接蛋白等因子实现的[2]。

大量研究表明整合素在胚胎着床过程中介导胚胎滋养外胚层和子宫内膜上皮细胞之间的相互作用,被认为是子宫内膜容受性的标记分子[9]。

3.2.2 侵入性作用

侵入性并不是滋养层细胞所固有的, 只是在一定时期才具备, 胚胎侵入过程和癌细胞浸润转移十分相似, 胚胎侵入过程有许多特征性分子参与ECM 的降解作用, 其中蛋白水解酶作用极关键。在胚胎侵入子宫内膜过程中, 发生作用的水解蛋白酶有金属基质蛋白酶( MMP) 、纤维蛋白酶( PAS) 、组织蛋白酶等[15]。

研究表明：当细胞滋养层表达整合素a6亚基时, 基质金属蛋白酶增多, 胚胎侵人能力增强; 相反, 当表达。a5亚基时, 金属蛋白酶水平下降, 侵人能力相应减弱。说明层粘连蛋白能促进体外培养的胚胎合成uP A , 在侵人期, 当胚胎粘着到子宫内膜表面时, 整合素与细胞外基质结合, 从而沟通了一种信息传导路径, 促使胚胎和子宫内膜合成蛋白酶, 强化了胚胎的侵人能力[16]。

综上所述, 滋养层细胞在胚胎植入中发挥着关键的作用。在胚胎植入过程中,

多种着床相关因子、激素在母体- 胚胎之间进行多重作用, 引发复杂的生理作用, 从而完成胚胎着床。在母体- 胚胎界面上,胎源性滋养层细胞与母体子宫内膜细胞在信号联系( 妊娠识别) 和组织紧密连接( 胚胎植入) 过程中起着决定性作用, 尤其是胚源性滋养层细胞, 在胚胎植入过程中起主导作用。随着研究的深入, 越来越多的活性分子被发现来自于胚胎植入期的滋养层细胞, 因此进一步研究细胞因子的作用机制有助于更清楚胚胎植入及调控的机理。

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以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞_杨俊林

·基础研究· 以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞* 杨俊林 刘雄昊喻姣玲冯劢谭杨李卓吴 奔 高 庭 潘 盛 邬玲仟梁德生夏家辉 （中南大学医学遗传学国家重点实验室湖南长沙410078） 摘要目的：比较人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs ）与小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的增殖能力及研究人皮肤成纤维细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs ）未分化生长的能力。方法：利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs ，通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs 与MEFs 的体外增殖能力。将HDFs 作为饲养层细胞与hESCs 共培养，传代12代后，检测hESCs 碱性磷酸酶(AKP)、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。结果：HDFs 可连续传代培养15代以上，10代以下的HDFs 增殖迅速，而MEFs 自第4代起，增殖能力就明显下降；hESCs 在HDFs 饲养层上可传代培养12代以上，克隆边界清晰，细胞排列紧密，碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性，表达了hESCs 特异性转录因子。结论： HDFs 比MEFs 具有更强的增殖能力；HDFs 可作为培养hESCs 的饲养层细胞。关键词：人胚胎干细胞；人皮肤成纤维细胞；饲养层细胞中图分类号： R329.2文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009） 16-3001-05Culture of human embryonic cells by using human dermal fibroblasts as feeder cells* YANG Jun-lin,LIU Xiong-hao,YU Jiao-ling,FENG Mai,TAN Yang,LI Zhuo,WU Ben,GAO Ting, PAN Sheng,WU Ling-qian,LIANG De-sheng,XIA Jia-hui （State Key Laboratory of Medical Genetics,Central South University,Changsha,410078，China ） ABSTRACT Objective:To compare the proliferative potential of human dermal fibroblasts(HDFs)and mouse embryonic fibroblasts (MEFs),and to explore the feasibility for HDFs as feeder cells to support the growth of human embryonic cells (hESCs).Methods:HDFs were obtained from human skin by using the method of tissue-adherence.The proliferative capacities of HDFs and MEFs were compared by cell morphology and growth curve.HDFs were used as feeder cells to culture hESCs.After growing on HDFs for 12passages,the hESCs were tested for the expressions of alkaline phosphatase (AKP),the cell surface markers and cell-specific transcription factor of hESCs.Results:HDFs could be subcultured for more than 15passages,and retained strong proliferative potential before 10passages,while it decreased obviously in MEFs after subcultured for 4passages.The hESCs can passaged on HDFs feeder cells for 12passages with tightly packed cells and clear boundaries of clone,showing the positive results of alkaline phosphatase (AKP)and the cell surface markers and the expression of hESCs-specific transcription factor.Conclusion:HDFs showed a stronger proliferation ability than MEFs;HDFs can support the growth of hESCs. Key words:Human embryonic stem cells;Human dermal fibroblasts;Feeder cells Chinese Library Classification:R329.2Document code:A Article ID:1673-6273（2009） 16-3001-05*基金项目：国家重点基础研究发展计划（2004CB518800），国家高技术研究发展计划（2007AA021002和2007AA021206）和国家自然科学基金（30700458和30971298） 作者简介：杨俊林（1977-），男，博士研究生，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：yangjunlin@https://www.wendangku.net/doc/7112062758.html, 刘雄昊（1975-），男，博士，助理研究员，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：liuxionghao@https://www.wendangku.net/doc/7112062758.html, 杨俊林、刘雄昊为并列第一作者 △通讯作者：梁德生，E-mail ：liangdesheng@https://www.wendangku.net/doc/7112062758.html, （收稿日期：2009-07-06接受日期：2009-07-30） 前言 自1998年Thomson [1]等人建立第一株人胚胎干细胞（hu-man embryonic stem cells,hESCs ）细胞系以来，hESCs 迅速成为人干细胞领域的研究热点。 hESCs 是具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，可以定向分化成不同的细胞、组织，这使得hESCs 在细胞治疗以及再生医学方面具有巨大的潜力。目前大 多数的人胚胎干细胞系是以小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse em-bryonic fibroblasts,MEFs)作为饲养层细胞维持其生长和未分化状态的， MEF 细胞通过与hESC 直接接触及分泌多种因子维持人胚胎干细胞未分化状态。而鼠源性的饲养层细胞很可能给hESCs 带来动物源性的病原体或生物活性分子的污染，严重阻碍hESCs 的临床应用。早期就在鼠的细胞发现Hantaan 病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）、呼肠病毒-3[2]，这些病

胚胎干细胞培养有新法

胚胎干细胞培养有新法 2010-12-22 来源：科技日报责编：杨婷 据美国每日科学网12月19日报道，美国研究人员发现，利用软凝胶基质代替硬培养皿来培养小鼠胚胎干细胞，无需添加昂贵的生长因子，便可让干细胞培养物长时间维持同质的多能状态。研究人员表示，这一技术在未来的再生医学中有着巨大的应用前景。相关论文发表在《公共科学图书馆·综合》杂志上。 干细胞研究面临的主要障碍就是如何让小鼠胚胎干细胞培养物保持一种均一的多能状态。多能干细胞可自发地分化成皮肤或者肌肉等不同的组织类型，长期以来，科学家都是利用一种被称作生长因子的化学物质来维持干细胞的多能态不变，但即便如此，培养出来的干细胞还是会很快进入各自的分化阶段，呈现出不同的基因表达和形态，这种多样性分化使得干细胞培养物很难被诱导生成所需的特定组织。 该研究负责人之一、伊利诺伊大学基因组生物学研究所动物科学教授田中哲也表示，可以从培养一群同质的未分化细胞入手，诱使其分化成特定的细胞类型以实现临床应用。 研究小组发现，多能小鼠胚胎干细胞喜欢“抱团”黏附在一起，而处于群体边缘、与坚硬的培养皿接触的细胞分化速度相对较快，于是他们决定对小鼠胚胎干细胞进行机械学研究而非化学研究。由于干细胞比成熟细胞要柔软10倍，研究人员猜测是否是培养皿和细胞之间的机械力刺激了细胞分化，并通过前期研究证实，即使很小的机械力也可诱导细胞分化。 接下来，研究小组将小鼠胚胎干细胞分成3组进行平行试验：第一组用加入了生长因子的常规培养基培养；第二组采用与这些细胞同样硬度的软凝胶基质进行培养，并加入生长因子；第三组同样用软凝胶基质培养，但没有加入生长因子。结果显示，即使缺乏生长因子，利用软凝胶基质培养的干细胞在3个多月传代20次后仍能表现出更明显的同质性和多能性。 研究合作者、伊利诺伊大学机械科学和工程系教授王宁(音译)说，这体现了事物的两面性：机械力能够诱导分化，但如果降低培养基和干细胞之间的机械力，就可以将干细胞保持在多能状态。这项研究证实了在干细胞分化过程中力学环境的重要性不亚于化学生长因子。在活的有机体中，细胞只在短期内分泌生长因子，而机械力则始终在影响每个细胞。 研究小组下一步打算利用这种新技术来培养诱导多能干细胞(iPS)，虽然iPS 细胞医学应用前景广阔，但也是出了名的难以培养。田中哲也说：“我们可以试

滋养层细胞

滋养层细胞 科技名词定义 中文名称：滋养层细胞 英文名称：trophoblast;trophoblastic layer 定义：哺乳动物胚泡的外层细胞，不能发育成胚体，只能发育成胚外结构。 所属学科：遗传学（一级学科）；发育遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 在胚胎发育成桑椹胚后，桑椹胚进一步发育，细胞开始出现分化。聚集在胚胎的一端，个体较大的细胞，称为内细胞团（innercellmass，ICM），将来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和排列的，个体较小的细胞，称为滋养层细胞，它们将来发育成胎膜和胎盘。所以做基因诊断时，通常取少量滋养层细胞诊断是否患有遗传病，这样不会影响胎儿发育。 滋养层 科技名词定义 中文名称：滋养层 英文名称：trophoblast 定义：哺乳动物围绕胚泡形成的胚外层上皮。将来形成绒毛的外层，和母体组织共同组成胎盘。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞分化与发育（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 滋养层 滋养层trophoblast为哺乳类早期胚泡壁的单层细胞所形成的薄膜。

是因为以后从母体摄取胎儿营养起重要作用而有此名。植入时滋养层局部增生肥厚（极端滋养层）侵着于子宫壁的组织内，并将一部分子宫壁溶解吸收。内胚层和中胚层分化之后，它虽然相当于外胚层，但与胚体形成部的胎儿外胚层是有区别的，所以有称滋养外胚层（trophectoderm）的。滋养外胚层不久被胚外体壁中胚层贴附，这样合起来的两层（广义的体壁层）称为滋养膜（滋养层和滋养膜使用上不一定明确区别）。又滋养膜相当于卵生羊膜类的浆膜，所以也仍可称为浆膜。在人的滋养层一部分形成发达的海绵状构造，包围于植入胚的周围。称此为合体滋养层（sy- ncytialtrophoblast）或海绵滋养层（spongiotro- phoblast）。相反，而与胚胎直接相邻的一层称为细胞滋养层（cytotrophoblast）。海绵滋养层将成为合胞体，认为它能吸收与其相接腔中的母体组织分解物。

胚胎干细胞的体外诱导分化模型

胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源　李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1　胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2　胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1　神经细胞　体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 　1　Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 　2　Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 　3　Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 　4　裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)

猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用2002

一，酶消化法制备猪胎儿成纤维细胞 猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用2002 1. 3. 1剪切猪妊娠35 d，剖腹手术取出子宫，用75% 的酒精浸泡消毒，无菌取出胎儿，用含双抗的PBS ( 137mmol /L NaCl 2. 7 mmol /L KCl 10 mmol /L Na2HPO4 2 mmol /L KH2 PO4 1 mmol /L CaCl20. 5mmol /L MgCl2 ) 漂洗2 遍，放入含双抗的PBS 中，分离2 个胎儿,放于塑料平皿中, 用无Ca 2+、Mg2+，含有双抗的PBS 缓冲液洗涤3 次, 洗至无色, 备用。将洗涤好的胎儿转移到另一平皿中,用无菌剪子剪掉头,四肢, 尾,去掉内脏, 继续用无Ca2+、Mg2+- PBS 缓冲液洗涤数次, 洗至无色, 将剩余的部分放入到100mm 的平皿中，然后用剪子将胚胎剪切成2～3 mm 小块, 将碎块转移到50ml离心管中。 1. 3. 2消化向放有组织块的离心管中加入二分之一离心管体积的0.25% Trypsin-0.04%EDTA 消化液（胰蛋白酶常用浓度为0.25%，PH为8.0。也有用胶原酶的，因为此酶消化温和，但是价格高，如果用胶原酶则为胶原酶+DMEM+Antibiotic-antimycotic，小鼠多用10ml离心管，因此加入胰酶消化液5ml即可）然后在室温下轻轻吹打组织块(或者，在37℃水浴摇床内消化)。室温消化15～20 min 左右（如果在37摄氏度最好在5min 内消化完）。可以边消化边吹打组织块, 也可以每隔5 min 吹打一次。消化结束后, 加入等体积的终止液10% 胎牛血清的DMEM 培养液(即吸出来细胞上层液如果多则放于到5ml 离心管中，如果少则放于1.5ml离心管中）,并轻轻吹打。 1. 3. 3离心、接种和培养800 r·min 离心5 min, 弃上清液, 然后加入5ml（或1ml) 的含20%胎牛血清的低糖DMEM 培养液培养基, 轻轻吹打重新悬浮细胞, 按常规方法进行细胞计数（1ml离心沉淀的细胞数=5个中方格中细胞个数X 5 X10 X1000 X稀释倍数，此时的计算值为体细胞的密度即个/ml. 大约徘徊在1-3 x 106个/ml）。以2×105个细胞/ mL(此值因为离心后又加入5ml,即稀释倍数为5.）的浓度接种于25 mL 预先2小时涂有0.1%明胶（来源：猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研究）的培养瓶中(根据具体情况加入4-5ml培养基，但是加入的培养基要求细胞的最终浓度为2 ×105个/ml)(或者转入到10mm平皿中，在38.5℃，5%CO2和饱和湿度培养）于39℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养。12小时候观察细胞贴壁生长状况，（原代培养24 h 后，可见细胞贴壁生长，来源：借助慢病毒将EGFP 基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞）一般在第二天换液，随后隔天换液，逐天观察，待细胞将80%-90%培养瓶铺满后即形成细胞单层，开始进行传代。一般消化1 个猪胎儿获得的细胞可接种 2 个50 ml的培养瓶。 如下图为传代培养第一代的西藏小型猪胎儿成纤维细胞图：

小鼠胚胎干细胞培养

以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液

胚胎干细胞体外诱导分化综述

胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞

胚胎翻译 DISCUSSION

Discussion 讨论 In the current study, we report the birth of live cloned piglets from cultures of fetal fibroblast cells. These cells were harvested from Day 25 fetuses before being frozen in liquid nitrogen for 2 yr. They were then passaged up to 12 times (approximately 40 population doublings) before nuclear transfer. Taken together, this result illustrates the utility of cloning for storing and multiplying genotypes and for transgenesis by enabling enough population doublings for selection of gene-targeted cells before nuclear transfer. We believe our success was due to the development of a porcine nuclear transfer system in which donor nuclei were exposed to unactivated cytoplasm for approximately 3 h before activation by chemical means. 在目前的研究中，我们报告了通过胚胎成纤维细胞培养出生的克隆活仔猪。这些收集的细胞来自在液氮中冷冻了两年的Day 25 胎儿。然后，在核移植前他们传代12次（约40倍群体倍增）。两者合计，为储存和繁殖基因型的克隆，并且在核移植前选择基因靶标细胞来确保足够的群体倍增和进行转基因组的克隆，结果表明这两者都是可利用的。我们相信，我们的成功是由于猪核移植系统的发展，它是用化学方法激活之前移植核供体暴露在未活化的细胞质中大约三个小时。 Exposure to unactivated oocyte cytoplasm is believed to facilitate remodeling and reprogramming of donor nuclei, [12, 22]. Unactivated cytoplasm contains high levels of active maturation promoting factor (MPF), which induces nuclear membrane breakdown (NEBD) and premature chromatin condensation (PCC) of transferred nuclei. Tani et al. [9] recently observed NEBD and PCC when bovine cumulus cells were fused with enucleated ova, regardless of the phase of the cell cycle in which donor cells existed. In the current study, we demonstrate the importance of fusing donor cells under calcium-free conditions to avoid concurrent activation in the majority of recipient cytoplasts. This was evident in the first experiment when 69% of cybrids that were fused in calcium-containing medium and not receiving chemical activation stimulus cleaved after 2 days of culture compared with only 10% of their counterparts fused under calcium-free conditions. Our finding contrasts with results in cattle in which reconstructed cybrids were found not to prematurely activate during fusion, despite the presence of calcium in the fusion medium [23, 24]. It is likely that there are differences between species with the ease at which recipient cytoplasts activate upon fusion. Other factors such as the age of recipient cytoplasts, source of oocytes (in vivo-matured or in vitro-matured), and fusion parameters utilized are also likely to influence the activation status of fused cybrids. 暴露在未激活的卵母细胞的细胞质中被认为是促进供体核的重塑和重新编程，[12，22]。未激活细胞质中含有活跃的成熟促进因子（MPF），它能诱导核膜破裂（NEBD）和移植核的染色体提早浓缩。当不考虑供体细胞中细胞周期的存在时，牛卵丘细胞与去核的卵子融合期间，，谷等人[9]，最近观察到核膜破裂和染色体提早浓缩。在目前的研究中，为避免在大多数受体细胞质中发生并发激活，我们证明了在缺钙条件下培养对于融合供体细胞的重要性。

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

浅论胎盘滋养层细胞的功能

浅论胎盘滋养层细胞的功能 胎盘有两大重要功能，内分泌功能与侵袭功能，其功能与滋养层的结构密不可分。在妊娠早期胚泡埋入子宫内膜之后，滋养层细胞分化成两个主要的细胞谱系，即绒毛滋养层( villoustrophoblasts，VTS) 和绒毛外滋养层( extravilloustrophoblasts，EVTs) 。绒毛滋养层包括两种细胞，与内膜接触的滋养层细胞迅速增殖，滋养层增厚，细胞分化为内外两层。外层细胞互相融合，细胞间界限消失，称为合体滋养层，起到强大的内分泌作用; 内层细胞界限清楚，由单层立方细胞组成，称为细胞滋养层，其不断分裂，补充进入合体滋养层。二者构成绒毛结构，运输营养物质给胎儿; 此外，细胞滋养层绒毛的尖端可以分化成另一种类型的滋养层细胞称为绒毛膜外滋养层细胞，绒毛膜外滋养层细胞对母体子宫上皮的黏附与侵入行为是胎盘形成的前提。 1 侵袭功能 EVT 细胞的侵袭性迁移行为是胎盘形成、发育及妊娠顺利完成的基本要素。EVT 细胞首先迁移到母体子宫蜕膜，然后侵入到子宫肌层的螺旋动脉壁内，并沿着螺旋动脉壁进行迁移，启动血管重塑的过程，建立母胎循环联系。细胞介导的血管重塑由螺旋动脉穿过蜕膜板进入母体叶，最终在母胎之间形成一种高流量、低阻力的脉管系统，在胎儿小叶绒毛处进行物质交换，保证对胎盘充足的血液灌注，满足胎儿的生长发育和对氧气及营养物质的需求。

EVT 细胞的侵袭性迁移功能受到体内微环境的精确调节，有多种蛋白酶和黏附分子直接或间接地参与了滋养层细胞的浸润和黏附过程，这些因子之间可以相互作用，共同参与血管重塑过程的调节，对妊娠结果产生重要的影响。 1. 1 金属基质蛋白酶 EVT 细胞之所以具有强大的侵袭功能，是因为它能够分泌金属基质蛋白酶( MMPS) ，其中金属蛋白酶-2( MMP-2) 和金属蛋白酶-9( MMP-9) 是妊娠期EVT 细胞侵袭的关键酶。EVT 细胞分泌的这些胶原酶可以降解弹力蛋白、胶原以及层粘连蛋白，从而能够侵入子宫蜕膜的细胞外基质，整合到肌层螺旋动脉壁内。现有研究表明，趋化因子-6( CXCL-6) 通过抑制基质MMP-2 活性来抑制人早孕胎盘滋养层细胞的迁移和侵袭。 1. 2 激活素A 激活素A 是一种多功能的生长因子，近年来发现滋养层细胞通过分泌激活素A 来上调MMP-2 和MMP-9 的表达从而促进滋养层细胞向子宫蜕膜浸润，同时刺激胎盘激素的产生，对早期胎盘形成发挥重要的作用。 1. 3 解整合素-金属蛋白酶 解整合素- 金属蛋白酶( a disintegrin andmetalloproteinase，ADAM) 是一类属含锌蛋白酶超家族的跨膜蛋白，定位在滋养层细胞中。ADAMs 分子作为多功能蛋白，通过其分子内在的催化、细胞黏附和细胞内信号的转导从而在妊娠系统中发挥作用，包括参与精卵识别和融

滋养层细胞的制备

1．器材 眼科镊子；眼科剪；平皿；200目筛；小烧杯；细胞计数板；离心管2．试剂 双抗；DMEM(DMEM/F12)；FBS；胰蛋白酶(0.25%)；Ⅰ-胶原酶(0.1%)；PBS；75%酒精；0.4%台盼蓝； 3．方法步骤 3.1．滋养层的分离 (1)将剥离下的组织放入75%酒精中10s，用含双抗的PBS冲洗2次，取出组织放入含有双抗的PBS缓冲液中，4℃保存，6-8 小时内带回实验室。 (2)将采集的胎盘样品用75%的酒精表面消毒后迅速的移入到新鲜的含双抗的PBS缓冲液中冲洗2-3次，移入无菌间内的超净工作台内。无菌双抗PBS缓冲液冲洗3 次，用眼科剪小心剥离胎膜、尿囊膜、毛细血管等与绒毛膜紧密相连组织，无菌双抗PBS缓冲液冲洗3次。 (3)用眼科剪剪成1-3mm3的组织小块，含双抗的PBS悬浮沉淀漂洗3 次，每次3 min。加入等体积于组织样品的0. 25 %胰蛋白酶消化液，37℃恒温震荡箱消化10 min，弃上清。再加入等样品20-30 倍的0.25%胰蛋白酶和0. 1 %胶原酶1:1 复合消化液，37℃消化30 min，收集上清液。将剩余组织再次加入复合消化液 5 min，直至大部分组织被消化成细胞悬液，收集每次消化后的上清液加入等体积含10%血清的培养基终止消化。 (4)将所得到的细胞悬液通过200 目的不锈钢筛网。

(5) 1200 r/min,离心5 min,用完全培养基重悬离心沉淀的细胞,将细胞悬液浓度调整至5~6X105个/mL。 (6)置于37℃5% CO2培养箱中培养；隔日更换培养基一次以去除血细胞和其它无法贴壁的成分，待细胞贴壁后更换培养液，此后每3d 更换培养液1 次。直至首次传代。 3.2．滋养层的纯化与传代 纯化过程与传代培养同时进行。当原代培养的滋养层细胞贴壁生长到90%以上汇合度时应进行传代。首次传代前24 小时更换培养液。 (1)反复贴壁法 将原代培养的细胞用0. 25%胰蛋白酶消化后，制成不含血清的细胞悬液，接种到培养瓶内，静止20 min；镜下观察部分细胞贴壁（稍加摇荡也不浮起），由于在无血清培养液内成纤维细胞比上皮细胞贴壁快，此时的贴壁细胞主要为成纤维细胞，上皮细胞大多数悬浮在培养液内，然后将培养液（含未贴壁细胞）吸到另一培养瓶内，加入含血清的培养液继续培养；再次制备不含血清的细胞悬液，重复以上操作传代培养3 次，可获得较高浓度的胎盘滋养层细胞。 (2)消化排除法 将原代培养的细胞用0. 25%胰蛋白酶消化液（含0. 02% EDTA）加入培养的细胞中，镜下见纤维样细胞缩短变圆，部分细胞脱壁，立即加入含有血清的培养液终止消化。轻轻振摇培养瓶后，倒掉液体，用含血清的培养液清洗瓶内贴壁的细胞，最后向瓶内加入含血清的培养液后继续培养，等下次传代时重复以上操作。这样重复传代 5 次即可

MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结

MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结 2008-06-19 00:00 来源：丁香园点击次数：1517 关键词：MEF小鼠胚胎成纤维细胞 知识总结 分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 小鼠胚胎成纤维细胞的富集 1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。 2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。 4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/ED TA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。 6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。 7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。 8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。 9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。 10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。

11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。 12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。 13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。 注释： 我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。 培养基成分： 88％DMEM 10％FBS 1％NEAA 1% 双抗 对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。 小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代 1、移去MEF培养基 2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。 3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。

胚胎干细胞体外培养.

胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs