低温纤维素酶的研究进展

纤维素酶活力的测定

纤维素酶活力的测定 1.纤维素酶活力单位定义 在37?,pH值为5.5的条件下,每分钟从浓度为4mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液 中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u. 2.测定原理 纤维素酶能将羧甲基纤维素降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还 原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与 酶解产生的还原糖量成正比,而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比.因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度,可以计算反应液中纤维素酶的活力. 3.试剂与溶液 除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合GB/T6682中规定的三级水. 3.1葡糖糖溶液,c(C6H12O6)为10.0mg/ml: 称取无水葡萄糖1.000g,加水溶解,定容至100ml. 3.2 乙酸溶液,c(CH3COOH)为0.1mol/L: 吸取冰乙酸0.60ml.加水溶解,定容至100ml. 3.3 乙酸钠溶液,c(CH3COONa)为0.1mol/L: 称取三水乙酸钠1.36g.加水溶解,定容至100ml. 3.4 氢氧化钠溶液,c(NaOH)为200g/L: 称取氢氧化钠20.0g.加水溶解,定容至100ml. 3.5 乙酸——乙酸钠缓冲溶液,c(CH3COOH—CH3COONa)为0.1mol/L,pH值为5.5: 称取三水乙酸钠23.14g,加入冰乙酸1.70ml.再加水溶解,定容至2000ml.测定 溶液的pH值.如果pH值偏离5.5,再用乙酸溶液(3.2)或乙酸钠溶液(3.3)调节至 5.5. 3.6 羧甲基纤维素钠溶液:0.8%(w/v)

纤维素酶的作用机理及进展的研究

纤维素酶的作用机理及进展的研究 摘要：纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，本文论述了纤维素酶的性质，重点介绍了纤维素酶的作用机理、应用及其研究进展，并对其研究前景做了展望。关键词：纤维素酶；纤维素；作用机理； 0引言 纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。 纤维素占植物干重的35%-50%[1],是世界上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。对人类而言，它又是自然界中最大的可再生物质。纤维素的利用和转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义[2]。 1 纤维素酶的性质 纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。纤维素酶是四级结构，,产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶（amylase）、蛋白酶（Protease）等。 纤维素酶的断键机制与溶菌酶一样，遵循双置换机制。纤维素与酶相互作用中，是酶被底物分子所吸附，然后进行酶解催化，酶的活性较低，仅为淀粉酶的1/100[3] 纤维素酶对底物分子的分解，必须先发生吸附作用。纤维素酶的吸附不仅与自身性质有关，也与底物密切相关，但纤维素酶的吸附机制总体并未弄清，仍需进一步研究[4]。 2 纤维素酶的作用原理 （1）、纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时，可促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质有利于动物胃肠道的消化吸收。 （2）、纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌，补充内源酶的不足，并对内源酶进行调整，保证动物正常的消化吸收功能，起到防病，促生长的作用。 （3）、消除抗营养因子，促进生物健康生长。半纤维素和果胶部分溶于水后会产生粘性溶液，增加消化物的粘度，对内源酶造成障碍，而添加纤维素酶可降低粘度，增加内源酶的扩散，提高酶与养分接触面积，促进饲料的良好消化。 （4）、纤维素酶制剂本身是一种由蛋白酶、淀粉酶、果胶酶和纤维素酶等组成的多酶复合物，在这种多酶复合体系中一种酶的产物可以成为另一种酶的底物，从而使消化道内的消化作用得以顺利进行。也就是说纤维素酶除直接降解纤维素，促进其分解为易被动物所消化吸收的低分子化合物外，还和其他酶共同作用提高奶牛对饲料营养物质的分解和消化。

纤维素酶活力测定

山东大学实验报告2011年4月20日 姓名张行润系年级2009级生科4班学号200900140177 同组者于潜科目生物化学实验题目纤维素酶活力测定—3,5-二硝基水杨酸法仪器编号105 一、实验目的 1、学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法 2、巩固使用分光光度计 二、实验原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 酶活力（enzyme activity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。 本实验中酶活力定义：1mg酶每分钟水解生成1微克葡萄糖的量定义为一个活力单位。由此定义我们可以计算本实验中的纤维素酶活力。 三、实验器材 （1）722型分光光度计（2）恒温水浴 （3）沸水浴锅 （4）电炉子 （5）剪刀 （6）分析天平（7）试管架 （8）胶头滴管 （9）具塞比色管（25mL×10）（10）移液管（2mL；5mL）（11）烧杯（500mL×3）（12）洗耳球 四、实验材料 （1）纤维素酶：0.05g酶溶解定容至50ml，取1ml再定容至100ml待测（用PH4.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制）； （2）3、5—二硝基水杨酸显色液； （3）0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置；（4）标准葡萄糖溶液（1mg/mL）； （5）蒸馏水。 五、实验操作 1.空白管的测定：

@@纤维素酶水解机理及影响因素

收稿日期:2007-04-13 作者简介:黄翊(1980-),男,广东广州人,助理工程师,现从事石油化工设计工作。 纤维素酶水解机理及影响因素 黄翊 (广东省石油化工设计院,广东广州　510130) 摘要:对纤维素酶水解的机理进行了阐述,并初步探讨了各类因素对水解的影响。关键词:纤维素酶;水解 中图分类号:Q55 文献标识码:A 文章编号:1008-021X (2007)05-0029-03 The HydrolysisM echan ics of Cellulose and I nfluenc i n g Factor HUAN G Yi (Guangdong Petr oche m ical Engineering Design I nstitute,Guangzhou 510130,China ) Abstract :This text expound the hydr olysis mechanics of cellul ose,and p reli m inary discuss s ome influencing fact ors on hydr olyzati on .Key words :cellulase;hydr olyzati on 纤维素是自然界中最丰富的可再生资源之一,如将其以工业规模转化成葡萄糖的技术开发成功,那么纤维素资源便可成为人类食粮、动物饲料、发酵工业原料以及能源的新来源。但目前有效利用纤维素生物量的主要障碍是纤维素酶的酶解效率低,与淀粉酶比较相差2个数量级以上,进而导致纤维素酶解过程中纤维素酶的成本过高,约占纤维素糖化工艺的40%以上,从而严重阻碍了纤维素酶在纤维素糖化中的广泛应用。酶的固定化技术为提高纤维素酶的使用效率,降低成本,提供了可能性。因为固定化酶比游离酶具有较好的稳定性,并且可以重复使用和回收,又便于连续化操作,因而可以大大降低成本。1　反应机理 1.1　纤维素酶的作用机制及理化性质 纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。目前普遍认为:完全降解纤维素至少需要有3种功能不同但又互补的纤维素酶的3类组分:EG (内切葡聚糖酶)、CBH (外切葡聚糖纤维二糖水解 酶)和CB (纤维二糖酶或β-葡萄糖苷酶),在它们的协同作用下才能将纤维素水解至葡萄糖。纤维素的降解过程,首先是纤维素酶分子吸附到纤维素表面,然后,EG 在葡聚糖链的随机位点水解底物,产生寡聚糖;CBH 从葡聚糖链的非还原端进行水解,主要产物为纤维二糖;而CB 可水解纤维素二糖为葡 萄糖。需要这三类酶的"协同"才能完成对纤维素的降解。其中对结晶区的作用必须有EG 和CBH,对无定形区则仅EG 组分就可以。 纤维素酶分子由催化结构域(catalytic domain,CD )、纤维素结合结构域(cellul ose -binding domain,CBD )和一个连接桥(linker )三部分组成。不同来源 的纤维素酶分子其特征和催化的活性不尽相同。酶分子都被糖基化,糖基化与蛋白质之间以共价键或解离的络合状态存在。酶分子糖基化的程度决定了酶的多形性和相对分子质量的差别。近年来,纤维素酶分子结构与功能的研究取得了一定的进展。不同来源内、外切酶的CD 晶体结构分析结果表明:纤维素酶遵循溶菌酶的作用机制;真菌和细菌来源的纤维素酶的CBD 的三维结构也得到了解析。真菌和细菌产生的纤维素酶分子差别很大,但它们的催化区在一级结构上氨基酸数量和二维结构上的大小却基本一致,但它们的连接桥和CBD 却存在明显的差异。真菌纤维素酶的连接桥一般富含Glu,Ser 和Thr,而细菌纤维素酶的连接桥则完全是由Pr o -Thr 这样的重复顺序组成。另一方面,真菌的CBD 由33～36个氨基酸残基组成,且具有高度的同源;而细菌纤维素酶的CBD 由100～110个氨基酸组成,同源性也较低。在高级结构的分子形状上,真菌纤维素酶的CD 、连接桥和CBD 呈直线连接,CD 与CBD 间为180°,而细菌纤维素酶的连接桥CD 与CBD 之

真菌与细菌纤维素酶研究进展_高凤菊 (1)

第27卷第2期 唐山师范学院学报 2005年3月 Vol. 27 No.2 Journal of Tangshan Teachers College Mar. 2005 ────────── 收稿日期：2004-10-20 作者简介：高凤菊（1978-），女，河北乐亭人，四川农业大学生命科学学院硕士研究生。 - 7 - 真菌与细菌纤维素酶研究进展 高凤菊1，李春香2 （1.四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安 625014；2.唐山师范学院 生物系，河北 唐山 063000） 摘 要：对分解纤维素真菌及细菌的种类，纤维素酶的组成和分类，分子结构、作用机理，纤维素酶基因工程及研究展望进行了综述。 关键词：真菌；细菌；纤维素酶 中图分类号：Q556+.2 文献标识码：B 文章编号：1009-9115（2005）02-0007-04 资源和环境问题是人类在21世纪面临的最主要的挑战。生物资源是可再生性资源，地球上每年光合作用的产物高达1.5×1011~2.0×1011t ，是人类社会赖以生存的基本物质来源。其中90％以上为木质纤维素类物质，[1]其中的纤维素是地球上最丰富 的多糖物质， [2] 这类物质是植物细胞壁的主要成分，也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。我国的纤维素资源极为丰富，每年农作物秸秆的产量 达5.7×108t ， 约相当于我国北方草原年打草量的50倍。目前这部分资源尚未得到充分的开发利用，主要用于燃料，畜牧饲料与积肥，不仅利用率低，还 对环境造成一定的污染。 [3] 随着世界人口迅速增长、粮食、矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重大的现实意义和光明的发展前景。 在自然界中，许多霉菌[4]和细菌[5]都能产生纤维素酶，但有关细菌纤维素酶的报道很少。由细菌所产生的纤维素酶一般最适中性至偏碱性，因为这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱，长期以来没有得到足够的重视。近十几年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值。[6][7][8] 1 纤维素分解微生物 1.1 纤维素分解性细菌 (cellulose decomposingbacteria ) 纤维素分解性细菌是能分解纤维素的细菌。由于纤维素酶等的作用，纤维素可一直被分解到葡萄糖为止，有时在分解过程中会积累纤维二糖。这类 细菌多见于腐植土中。好氧性细菌如纤维单胞菌属（Cellulomonas ）、纤维弧菌属（Cellvibrio ）、噬胞菌属（Cytophaga ）等能分解纤维素；但在好氧条件下土壤中纤维素的分解，主要是纤维素分解真菌在起作用。而在厌氧条件下纤维素的分解，一些厌氧性的芽孢梭菌属（Clostridium ）的细菌具有重要作用。纤维素分解细菌亦可栖息于草食动物的消化道、特别是反刍动物的瘤胃中。它们在其中进行分解纤维素的活动，这些细菌是厌氧性细菌，例如产琥珀酸拟杆菌（Bacteroides succinogenes ）、牛黄瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens ）、白色瘤胃球菌（R.albus ）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens ）（程光胜 译）等。细菌纤维素酶多数结合在细胞膜上，菌体细胞需吸附在纤维素上才能起作用，使用很不方便，酶的分离提取也较困难。但是细菌主要产生中性纤维素酶和碱性纤维素酶。碱性纤维素酶由于在洗涤剂工业中有良好的应用价值，也成为研究热点，其产生菌主要集中在芽孢杆菌属[9]。由于酶的耐热性在生产中具有现实意义，所以耐热细菌也是研究的热点。 1.2 纤维素分解性真菌 真菌类有黑曲霉、血红栓菌、卧孔属、疣孢漆斑菌QM460、绳状青霉、变幻青霉、变色多空霉、乳齿耙菌、腐皮镰孢、绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉、嗜热毛壳菌QM9381和嗜热子囊菌QM9383等[10]；丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物。真菌纤维素酶通常是胞外酶，酶被分泌到培养基中，用过滤和离心等方法就可较容易地得到无细胞酶制品。目前饲用纤

实验 纤维素酶活力的测定【内容充实】

实验 纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法） 一、实验目的 掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力的方法。 二、实验原理 纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，故可利用比色法测定其还原物生成量来表示纤维素酶的活力。 三、主要仪器与试剂 (一)实验仪器 1. 25mL 比色管 2. 722型分光光度计 3. 滴管 4.水浴锅 5.移液枪 6.电炉 (二)、试剂 1. 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10.0 g 3,5-二硝基水杨酸，溶入200mL 蒸馏水中，加入20g 分析纯氢氧化钠，200g 酒石酸钾钠，加水至500mL ，升温溶解后，加入重蒸苯酚 2.0g ，无水亚硫酸钠0.50g 。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000mL 。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 2. 0.1mol/L pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。 3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。 4. 葡萄糖标准溶液：称取干燥至恒重的无水葡萄糖100mg ，溶解后定容至100mL ， 此溶液含葡萄糖1.00mg/mL 。 5. 纤维素酶液：将0.05g 酶溶解定容至50 mL ，从中取出1.0mL 再定容至100mL ，待检测用。（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制） 四、实验步骤 1.标准曲线的绘制：分别吸取0.0，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00m L 葡萄糖标准液于6支25mL 比色管中，均用蒸馏水稀释至1mL ，加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL ，在沸水浴中煮沸显色10min ，冷却，加蒸馏水21mL ，摇匀。以空白管调零，在550nm 处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖μg 数为横坐标，绘出标准曲线。 序号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标液 0.0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水 1.0 0.80 0.60 0.40 0.20 0.0 3,5-二硝基水杨酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 实验操作 沸水浴加热10min ，冷却后，加水定容，摇匀，比色测定 吸光度A 550nm 0.0 2.空白管的测定： 在2支25mL 试管中各加入1.0mL 酶液，沸水浴5min ，冷却后加 3.0mL 0.5%CMC-Na ，与样品管同时放入50℃水浴30min 。其它操作同样品管。 3.样品的测定：在3支25mL 试管中各加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液3.0mL ，酶液1.0mL ，于50℃水浴中糖化30min ，取出，立即于沸水浴中煮沸10min 使酶失活，得糖化液，冷却加入3.0 mL 3,5-二硝基水杨酸显色液，再沸水浴10min ，冷却后加水定容至25mL ，混匀，以空白管调零，在550nm 处测OD 值，查葡萄糖标准曲线得样品的葡萄糖μg 数。 五、结果计算 在上述条件下，1㎎酶每分钟催化纤维素水解生成1微克葡萄糖定为一个活力单位。 1 30) (??g OD N μ值对应的葡萄糖量

纤维素酶活力测定方法_张瑞萍

测试与标准 纤维素酶活力测定方法 张瑞萍 南通工学院(226007) 摘　要　用DN S 为显色剂,分别以滤纸和CM C 为底物,以滤纸糖酶活性(FP A )和羧甲基纤维素酶活性(CM C a se )表征纤维素酶活力。确定酶活测定用波长为530nm,参比溶液应为失活酶、底物和DN S 等共热的反应物;比较了两种底物的酶活力测定方法。结果表明,CM C a se 比FP A 高,说明酶对水溶性底物有较高的活力,也表明吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响;对于不同牌号的纤维素酶,织物的酶减量率与CM C 酶活力关系密切。 叙　词:　测试　纤维素酶　活度中图分类号:　TS197 纤维素酶是多组分复合物,各组分的底物专一性不同。纤维素酶作用的底物比较复杂,反应产物不同,致使纤维素酶活力测定方法很多,各国的方法亦不统一。我们选择滤纸、CM C 为底物,原理系利用纤维素酶催化水解纤维素,产生纤维多糖、二糖及葡萄糖等还原糖,与显色剂反应,求出还原糖的浓度,间接求出酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力)和CM C ase (羧甲基纤维素酶酶活力)。本文分析确定酶活力测定的主要条件,比较两种底物的酶活力测定方法的结果,探讨纤维素酶活力与织物减量率的关系,为酶在生产中的利用提供依据。 1　实验方法 1.1　化学药品、材料 纤维素酶(工业品),DNS 试剂(自配),冰醋酸,醋酸钠,葡萄糖(均为分析纯),滤纸(定性),羧甲基纤维素酶CM C (试剂级),纯棉针织物半制品(南通针织厂)。 1.2　FPA 滤纸酶活力和CMC 酶活力的测定 取适当稀释的酶液,分别以滤纸或1%的CM C 溶液为底物,于50℃恒温水解反应1h ;然后加入显色剂DNS,沸水浴中煮沸5min;再加入蒸馏水,于530nm 测定吸光度OD 值。 酶活可定义为:每毫升酶液1min 产生1mg 葡萄糖为一个单位( )。 1.3　针织物酶减量率的测定 将酶处理前后的试样在烘箱中105℃烘至恒重。减量率= 处理前织物干重-处理后织物干重 处理前织物干重 ×100% 2　结果与讨论 2.1　显色剂的选择 选用DNS ,在碱性条件下与还原糖反应,生成有色化合物,用分光光度计比色,确定低分子糖含量。 碱性条件下DNS 与还原糖共热反应如下: O 2N OH O 2N CO OH +还原糖 　H 2N OH CO OH O 2N DN S(黄色) 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色) 生成的棕红色氨基化合物系比色法测定基础。2.2　最大吸收波长的确定 选取490～580nm 波长对显色液进行比色。由图1可知,不同浓度的葡萄糖溶液在490～500nm 处有最大吸收,DNS 在此波长下也有较明显的吸收。为了排除DNS 的干扰,选择在波长 530nm 处进行测定,此波长下的葡萄糖吸收虽有所降低,然而符合“吸收最大、干扰最小”的原则。 图1　D NS 与葡萄糖的吸收曲线 2.3　底物及酶本身含糖量的影响 在实验过程中发现,底物特别是滤纸,也含有一定的还原糖,在碱性的DNS 试剂中也会发色。而且,试验所用的纤维素酶是一种工业级的复合酶,品种不同,其本身含糖量也不同。为了排除这类还原糖的干扰,参比溶液取失活后的酶、底物、DNS 等共热的反应物。2.4　葡萄糖标准曲线 用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液,与DNS 共热反应显色后,测出其吸光度OD 值(见图2)。标准曲线的线性相关系数R 2为0.9991(见图2),线性相当好,可以用于酶活力的测定。 38 印　染(2002No .8) www .cdfn .com .cn

纤维素酶的检测方法

纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定 1.纤维素CMC酶 1.0标题 用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。 2.0范围 生产分析和质量控制部门适用。 3.0原理 纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。 4.0试剂 4.1无水醋酸钠(分析纯) 4.2冰醋酸(分析纯) 4.3 3.5－二硝基水杨酸 4.4无水葡萄糖 4.5四水酒石酸钾钠(分析纯) 4.6氢氧化钠(分析纯) 4.7重蒸苯酚(分析纯) 4.8无水亚硫酸钠(分析纯) 4.9叠氮化钠(分析纯) 4.10羧甲基纤维素钠 5.0仪器 5.1水浴锅(恒温)50±1℃ 5.2电热干燥箱80±1℃ 5.3 722型分光光度机计 5.4分析天平感量0.1㎎ 5.5一级玻璃制品 5.6电冰箱 6．0试剂的准备 6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8） 溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。 6.2 DNS试剂: 溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。 溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。 将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。 6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。 7．0标准曲线制作： 7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。 7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。 7.3标准葡萄糖曲线制作

纤维素酶的基因克隆研究进展

纤维素酶的基因克隆研究进展 摘要：纤维素酶是一种高活性生物催化剂，具有广阔的开发和应用前景。本文对纤维素酶的特性、研究进展、应用以及纤维素酶基因克隆等方面进行了综述，并对今后的研究趋势作了预测和展望。 关键词：纤维素酶；分子生物学；基因克隆；前景展望 前言 纤维素是植物细胞壁的主要成分，约占植物干重的1/3—1/2，它是地球上分布最广、含量最丰富、生成量最高的有机化合物。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。利用纤维素酶将纤维素彻底水解是纤维素的有效利用途径。纤维素酶(cellulase)是指能水解纤维素β—l，4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系。近年来对纤维素酶的基础研究，包括酶的氨基酸序列、基因的克隆与表达、酶蛋白的空间结构与功能以及酶蛋白的基因调控等诸多方面，并且均取得了显著进展。由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。 1.1 纤维素酶的组成 纤维素酶是由许多高协同作用的水解酶组成的，根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4,即C1酶），来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cen、外切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex) 和β-葡聚糖苷酶（β-1,4- glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。 (1)外切葡聚糖酶，这类酶作用于纤维素分子的末端，一次从纤维素分子中切下纤维二糖，它可以作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区和羧甲基纤维素。对于外切纤维素酶，传统上认为是从纤维素链的非还原端切下纤维二糖。可是，从一些微生物的外切酶的研究中发现了另一种纤维素酶，它们优先从纤维素分子的还原末端切下纤维二糖。这些研究说明存在两种不同功能的外切酶，它们分别从还原端和非还原端水解纤维素分子[ 1 ]。 （2）内切葡聚糖酶，这类酶是纤维素酶中最重要的酶，可作用于纤维素分子内的无定形区，随机水解糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量的小分子纤维素，即纤维素末端。

纤维素酶活力的测定

β-糖苷酶活力的测定(CＭC) 一目的: 掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。 原理: 纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠(CMＣ-Nａ)中分解出还原糖,还原糖又同3,５－而硝基水杨酸发生反应,产生一种黄橙混合色,用分光光度计可测定其色度,计算酶活力。 二试剂: 1.3,5-而硝基水杨酸显色剂(又称DNS试剂): 称取10g3,5-而硝基水杨酸,溶于蒸馏水中,加入20g分析纯NaOH,２00g酒石酸钾钠,加税5０0mｌ,升温溶解后,加入重蒸酚2ｇ,无水亚硫酸钠0、5g,加热搅拌,待全部溶解后,定容至1000mｌ。贮存于棕色瓶中,室温保存,放置一周后使用。 ２.０、1moｌ／ＬｐH4、5醋酸－醋酸钠缓冲液:称取结晶醋酸钠(CＨ3COOＮａ、3 Ｈ2Ｏ)13.６１g,醋酸(ＣH３COOH)6、０0g,用蒸馏水溶解,并定容至1００0 ml,配好后用pH计矫正。 3、1mg/ml葡萄糖标准溶液:准确称取10０mｇ分析纯葡萄糖(预先在70℃、60０nm汞柱下干燥5h至恒重),用少量蒸馏水溶解并定容至100ｍl,冰箱中保存备用。 ４.代测酶液:称取酶粉1、0ｇ(或吸取酶液1、０0ml),先用少量的０、05ｍoｌ／L pＨ４、5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中,沉渣部分再加上述缓冲液溶解,如此反复捣研３－4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度,４0℃水浴锅中浸提1h,用四层纱布或脱

脂棉过滤,滤液供测定用。 5、底物:０.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液,配制方法为城区0、5000g 羧甲基纤维素钠(Ｓigmａ公司生产),准确至０、0０1g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存,有效期3d。 三仪器: 分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。 四方法步骤: 1．标准曲线的绘制 分别吸取0.２, 0.４, 0、6, ０、8, 1.0, 1.2, １.4ｍl的1ｍg／ml葡萄糖液于７支20ｍl的比色管中,分别用蒸馏水补充体积至2、ｏml,各加３,５-而硝基水杨酸1、5ml,在沸水浴中煮沸5ｍiｎ,冷却后分别用蒸馏水定容至２0ｍl,摇匀。以2ml蒸馏水加DNS溶液１、5mｌ,按上述同样操作为空白调零,在５40ｎm处比色。标准曲线绘制个试管所含物质的体积见下表。以吸光度A值为纵坐标,葡萄糖毫克数Ｗ(mg)为横坐标绘制出标准曲线(理论上此线应过原点)。 标准曲线绘制各试管所含物质的体积

纤维素酶

纤维素酶 科技名词定义 中文名称：纤维素酶 英文名称：cellulase 定义：编号：EC 3.2.1.4。由多种水解酶组成的一个复杂酶系，自然界中很多真菌都能分泌纤维素酶。习惯上，将纤维素酶分成三类：C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶。C1酶是对纤维素最初起作用的酶，破坏纤维素链的结晶结构。Cx酶是作用于经C1酶活化 的纤维素、分解β-1，4-糖苷键的纤维素酶。β葡糖苷酶可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；酶（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 纤维素酶 纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。 目录

纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶 （1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或 纤维素和几丁质分子结构图 endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cen、外切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或 exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex) 和β-葡聚糖苷酶（β-1,4- glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区,产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端,释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。真菌纤维素酶产量高、活性大，在畜牧业和饲料工作中主要应用真菌来源的纤维素酶。 2.纤维素酶降解纤维素的机理研究 纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。 1950年，Reese等提出了C1-Cx假说，该假说认为必须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖。协同作用一般认为是内切葡聚糖酶(C1酶)首先进攻纤维素的非结晶区，形成Cx所需的新的游离末端，然后由CX酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由β-葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖。不过，纤维素酶的协同作用顺序不是绝对的，随后的研究中发现，C1-Cx和β-葡聚糖苷酶必须同时存在才能水解天然纤维素。若先用C1酶作用结晶纤维素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此顺序作用却不能将结晶纤维素水解。 编辑本段二、纤维素酶菌种选育 菌种选育是纤维素酶生产的基础性工作，国内外许多专家进行了大量研究，为了生产高质量的纤维素酶产品，王家林等（1996）在吸收国内外经验的基础上，先后引进了绿色木霉木10、绿色木霉Sn-91014、康氏木霉

纤维素酶的研究进展及应用前景

纤维素酶的研究进展及应用前景 摘要 我国近年来在纤维素酶研究应用领域取得了很大进展。纤维素酶是一组能够分解纤维素产生葡萄糖的酶的总称，按照功能可以分为内切葡糖聚酶，外切葡糖聚酶和β-葡聚糖苷酶。它在纺织，酿酒，食品与饲料行业的市场潜力是巨大，受到国内外业内人士的看重。本文综述了纤维素酶的组成，结构，分类，理化性质与作用机理，阐明了生产纤维素酶的微生物种类，纤维素酶的发酵工艺及高效分解菌。介绍了纤维素酶的特性，重要意义，在各领域的应用，并对其未来研究趋势进行了展望。 关键字：纤维素酶研究应用 前言：因为资源枯竭、能源短缺及环境污染等问题日益加剧，世界各国都在寻找开发新能源。纤维素类物质是自然界中分布最广泛、含量最丰富、生成量最高的有机化合物，也是自然界中数量最多的可再生类质。但这些纤维素大部分没有被开发，造成巨大的资源浪费和环境污染。近年来关于纤维素酶的基础研究获得了显著的进展，主要包括酶的组成部分和结构、发生降解的机理、基因的克隆和表达、酶的发酵和生产、应用等方面。由此可见生产纤维素酶对人类生存环境的改善和可持续发展有着举足轻重的地位。 1，纤维素酶的来源和分类 纤维素酶的最主要来源是微生物，用其生产是最为有效和方便的。不同微生物合成的纤维素酶在组成上差异明显。对纤维素的降解能力也不尽相同。细菌与放线菌生产的纤维素酶产量均不高，在工业上很少应用。而真菌具有产酶的诸多优点：产酶能力强，产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取，且产生纤维素酶的酶系结构较为合理；酶之间有强烈的协同作用，降解纤维素的效率高。纤维素酶是一类能够把纤维素降解为低聚葡萄糖、纤维二糖和葡萄糖的水解酶。根据纤维素酶的结构不同，可把纤维素酶分为两类：纤维素酶复合体和非复合体纤维素酶。纤维素酶复合体是一种超分子结构的多酶蛋白复合体，由多个亚基构成。由四个部分构成：脚手架蛋白、凝集蛋白和锚定蛋白结合体、底物结合区域和酶亚基。非复合体纤维素酶主要由好氧的丝状真菌产生，如子囊菌纲和担子菌纲等的一些种属。它是由不同的三种酶所构成的混合物，即内切葡聚糖酶、外切葡苷糖酶和B一葡萄糖苷酶。 2，纤维素酶的组成与结构 因为种类和来源的不同，纤维素酶的结构存在较大差异，但是通常均具有2

纤维素酶研究进展及固定化技术

纤维素酶研究进展及固定化技术 摘要: 纤维素酶是一类能够水解纤维素的β-D-糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称。传统上将其分为3类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶属于糖苷水解酶类，近年来，根据氨基酸序列的同源性以及纤维素酶结构的相似性，将其分成不同的家族。本文介绍了纤维素酶的研究进展，主要包括纤维素酶的性质及作用机理，应用与发展趋势，来源及生产技术，分离纯化方法，最后介绍几种常用的纤维素酶固定化方法。 关键词: 纤维素酶；研究进展；固定化 引言： 纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。自1906年Seilliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶至今已有一百余年了，随着在工业上的广泛应用，特别是在纺织工业、能源工业上的应用，纤维素酶已成为最近十几年酶工程研究的一个焦点。近年来有关纤维素酶的研究，包括酶的氨基酸序列、基因的克隆与表达、酶蛋白的空间结构与功能，以及酶蛋白的基因调控等诸多方面都取得显著进展。到目前为止，登记在Swiss-Protein数据库的纤维素酶的氨基酸序列有649条，基因序列有433条。我国对纤维素酶的研究始于上世纪50年代，迄今已有50多年的历史。在纤维素酶的菌种开发、发酵培养、基因的克隆与表达、纤维素酶的固定化，以及纤维素酶在纺织、能源等方面的应用都取得较大进展。 1 纤维素酶的性质及作用机理 纤维素酶分子的大小因来源不同而不尽相同，三大类酶分子量一般在23Kda～146Kda之间。多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受糖基化，糖基与蛋白之间以共价键结合，或呈可解离的络合状态。糖基化作用在一定程度上保护酶免受蛋白酶的水解，而纤维素酶正是由于糖基化，使其所含碳水化合物的比率在不同酶之间发生差异，导致酶的多形式和分子量的差别。通过比较分析，人们发现许多不同纤维素酶间表现出一定的同源性，且纤维素酶分子普遍具有类似的结构。由球状的催化结构域(CD)、连接桥和纤维素结合结构域(CBD)三部分组成。(1)连接桥，可能是保持CD和CBD之间的距离，也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体；(2)纤维素结合结构域，它对酶的催化活力是非必需的，但它执行调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用，其结合纤维素的作用机理目前尚不十分清楚；(3)催化结构域，它体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。尽管不同来源纤维素酶的分子量大小差别很大，但它们催化区的大小却基本一致。 研究表明，EG和CBH能引起纤维素的分散和脱纤化。纤维素酶通过打乱纤维素的结晶结构，使其变形，深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁、腔壁和微型隙壁的压力增大，水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏，产生部分可溶性的微结晶，利于进一步被降解。（1），对纤维素分子的吸附作用：纤维素酶对纤维素的降解，一般首先吸附到纤维素上，但并不是吸附的越好催化效果约好。纤维素酶的吸附不仅与酶本身性质有关，也与底物的特性密切相关。其吸附能力大小与酶的含糖量和疏水性均有关联。此外，纤维素酶的吸附机理并未弄清，仍需做进一步研究。（2），单一纤维素酶的作用机制：纤维素酶的断键机理

纤维素酶活力的测定(sdu)

纤维素酶活力的测定 高熹 168615140001 一、实验原理 纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3、5-二销基水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。 酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。 二、实验试剂 1、3、5—二销基水杨酸显色液：称取10克3、5-二销基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000毫升。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 2、0.1摩尔PH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液。 3、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。 4、标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100毫克，溶解后定容至100毫升，此溶液含葡萄糖1.00毫克/毫升。 三、实验器材 1、紫外可见分光光度计 2、胶头滴管 3、水浴锅 4、试管 5、移液管 四、实验步骤 1、标准曲线的绘制：分别吸取0. 2、0.4、0.6 、0.8.0、1.0毫升的葡萄糖于5支试管中,均用蒸馏水稀释至1毫升,加3.5-二销基水杨酸显色剂3毫升,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,加蒸馏水21毫升,摇匀.以1毫升蒸馏水代替糖作空白管,在550nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线。 2、样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于50度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液。取糖化液１毫升，按制标准曲线时一样加显色液比色。同时以１毫升煮沸的酶液代替酶做一空白对照。 五、实验结果

生物技术生产纤维素酶及其应用研究进展

Vol.15,No.18精细与专用化学品第15卷第18期 Fine and Specialty Che m icals2007年9月21日技术进展 生物技术生产纤维素酶 及其应用研究进展 刘　颖3　张玮玮 (哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨150076) 摘　要:简要介绍纤维素酶的酶学性质、降解机制、生产工程菌的选育、纤维素酶的应用情况,以及对纤维素酶生产与应用方面存在的问题和未来发展趋势进行了分析与探讨。纤维素酶在食品、酿造行业、农副产品深加工、饲料、医药、环境保护和化工等领域有着非常广阔的应用前景和应用潜力。我国纤维素酶的生产及应用研究近年来取得了很大进展,今后必将在应用深度和广度上进一步扩展。 关键词:纤维素酶;发酵;克隆;生物技术 Cellul a se Produced by B i otechnology and Its Appli ca ti on Progress L I U Ying,ZHAN G W ei2w ei (College of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin150076,China) Abstract:The enzy mol ogical p r operties of cellulase,degradati on mechanis m,the selecting culture of engineering m i2 cr oorganis m and the app licati on p r os pect of bi otechnol ogy in cellulase industry are intr oduced briefly.The existing p r oble m s in cellulase p r oducti on and app licati on and the devel opment trend in the future are analyzed and discussed.The p r os pect and potential of app licati ons of cellulase are wide,es pecially in the fields of f ood industry,fer mentati on industry,deep2p r o2 cessing of far m ing p r oducts,f orage,medicine,envir on mental p r otecti on and che m ical industry.A great p r ogress has been made in the cellulase devel opment and app licati on recently in China,and in the future it will be certainly expanded deep ly and comp rehensively. Key words:cellulase;fer mentati on;cl one;bi otechnol ogy 纤维素是地球上数量最大的可再生资源,微生物对它的降解、转化是自然界中碳素转化的主要环节。纤维素酶(Cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。纤维素的生物转化与利用对当前世界能源危机、粮食短缺和环境污染等问题具有重要的意义。近年来,我国纤维素酶的应用研究十分活跃,已筛选到一批高产菌株。随着分子生物学、遗传工程的迅猛发展,国内外均在尝试应用基因工程技术来改造和构建高效纤维素降解菌。这些菌具有独特的酶学性质,扩大了纤维素酶的应用范围。根据纤维素酶遗传特性而构建的高效纤维素分解菌开辟了纤维素酶生产的新途径。 1　维素酶的性质及其降解机制 纤维素酶是一种糖蛋白,它是一个多组分的诱导酶系,采用层析分离和电泳技术等可将纤维素酶分成不同的组分。目前普遍认为,完全降解纤维素至少需要由3种功能不同但又互补的纤维素酶协同作用才能将纤维素水解至葡萄糖,它们是EG(内切葡聚糖酶)、CBH(外切葡聚糖酶)和CB(纤维二糖酶或β2葡萄糖苷酶)。纤维素的降解过程,首先是纤维素酶分子吸附到纤维素表面,然后,EG(内切 ? 8 ? 3收稿日期:2007207212 　作者简介:刘颖(19682),女,副教授,研究方向为食品生物技术。