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柱色谱法分离甲基橙和亚甲基蓝==

柱色谱实验教学中甲基橙和亚甲基蓝的分离和测定方法

柱色谱是色谱分析方法中的一种,由于柱色谱能够较大量地有效分离和提纯有机化合物,所以广泛应用在化学分析,药物研究,天然物质提取,医学研究等领域。在大学有机实验教学中,往往都设有柱色谱实验课。在实验教材中,一般采用中性氧化铝为固定相分离甲基橙和亚甲基蓝的混合物[1~3 ],但此方法分离的色谱带有扩散现象,影响分离效果;且实验中只有定性观察,不进行定量操作。在本实验中,我们改用硅胶为固定相,选用了新的样品溶剂和洗脱剂,在很大程度上抑制了色带扩散,而且色谱带分明,大大提高了分离效果。在实验中还增加了定量测定的内容,通过计算回收率,可对同学们的实验情况进行评判,使你们能够认真收集分离物质,不断地提出问题,调动了你们做实验的积极性。

1 实验材料和方法

1. 1 材料分光光度计(岛津UV22201) ,玻璃色谱柱。柱色谱用硅胶(100~140 目) ,甲基橙(指示剂) ,亚甲基蓝(指示剂) ,H2O∶95 %乙醇= 1∶1 (A 液) ,0. 2mol·L - 1HCl∶95 %乙醇= 1∶1 (B 液) 。

1. 2 甲基橙标准曲线的绘制

用A 液做溶剂,配制甲基橙系列标准溶液,在λmax = 450nm处测得甲基橙吸光度(表1) 。

1. 3 亚甲基蓝标准曲线的绘制

用B 液做溶剂,配制亚甲基蓝系列标准溶液,在λmax = 661nm 处测得亚甲基蓝吸光度(表1) 。

1. 4 甲基橙和亚甲基蓝的分离

在玻璃色谱柱( d = 1cm , l = 10cm)底部用脱脂棉轻轻塞紧,称取4g 硅胶于小烧杯中,加入15mL 蒸馏水,用玻璃棒调好。在柱中先加入1/ 2 柱高的蒸馏水,打开活塞,在搅动下把糊状硅胶加入柱中,同时调整活塞使流速为1 滴/ s。当柱中液面将要露出硅胶面时,加入5mL左右的A 液,当硅胶面又将要露出时,关紧活塞,用移液管准确加入0. 50mL 以A 液做溶剂的混合液(含甲基橙和亚甲基蓝各为0. 400 g·L -1) 。待此混合液将要渗入柱内时,立即用A 液洗脱,此时可以观察到有鲜明的黄、蓝两条色带形成。黄色的甲基橙色带随洗脱剂的加入不断下移,而其顶部蓝色带不移动,当黄色带到达柱底部时,更换接受器,全部收集此黄色带,洗脱时间约10 min。此后改用B 液做洗脱剂,这时可看到蓝色带开始下移,当亚甲基蓝色带到达底部时,更换接受器,全部收集此蓝色带,洗脱时间约30 min。

表1 甲基橙标准曲线数据和亚甲基蓝标准曲线数据

甲基橙亚甲基蓝

ρ/ mg· L–1 A ρ/ mg· L – 1 A

0. 000 0. 000 0. 000 0. 000

1. 970 0. 165 1.

110 0. 292

3. 939 0. 326 1. 666 0. 420

5. 909 0. 477 2. 221 0. 547

7. 878 0. 635 2. 776 0. 678

9. 848 0. 784 3. 331 0. 799

甲基橙的吸光度&浓度方程为A = kρ。其中k = 0. 0804mg - 1·L。亚甲基蓝的吸光度&浓度方程为A = kρ,其中k = 0. 2445mg - 1·L。

2 数据处理

把收集到的甲基橙溶液用A 液定容到25mL 的容量瓶中,并在450nm 处测定吸光度A值,甲基橙的回收率可从下公式计算得到:回收率% = ( A ×25 ×10 - 3) / ( km) 。其中k = 0.0804mg - 1·L , m 为甲基橙在混合物上样中的实际量(mg) 。把收集到的亚甲基蓝溶液用B 液定容到100mL 的容量瓶中,并在661nm 处测定吸光度A 值,亚甲基蓝的回收率可从下公式计算得到:回收率% = ( A ×100 ×10 - 3) / ( km) 。其中k = 0. 2445mg - 1·L , m 为亚甲基蓝在混合物上样中的实际量(mg) 。

表2 甲基橙和亚甲基蓝回收率

实验号甲基橙A 回收率亚甲基蓝A 回收率

1 0. 629 97. 8 % 0. 476 97. 3 %

2 0. 628 97. 6 % 0. 474 96. 9 %

3 0. 630 97. 9 % 0. 478 97. 8 %

4 0. 633 98. 4 % 0. 476 97. 3 %

5 0. 62 9 97. 8 % 0. 479 98. 0 %

平均值97. 9 % 97. 5 %

3 讨论

(1) 柱色谱在分离样品时,一般要求柱高和直径之比是8∶1。分离同样量的甲基橙和亚甲基蓝混合物需中性氧化铝6g[1 ]采用本实验方法需硅胶4g就能达到同样的分离效果。

(2) 在进行此实验前,需把待分离的混合物甲基橙和亚甲基蓝溶于溶剂中,下面是它们的结构式:

可以看到,它们结构中既有极性部分,又有非极性部分,通常实验教材提供的方法是用乙醇做溶剂,在实际实验时,导致甲基橙色带分散。原因之一是,虽亚甲基蓝溶于乙醇,而甲基橙

不溶于乙醇等有机溶剂,但它们都可溶于水[4 ]。本实验改用A液溶解样品的好处是:一方面能使混合物样品充分有效地溶解;另一方面,柱色谱实验时要求溶解样品的溶剂极性和溶解度不能太大,也不能太小,前者影响样品与吸附剂的吸附,后者使柱中样品色带分散。实验证明:用A 液为溶剂,既增加了溶解度,又调整了极性,使甲基橙和亚甲基蓝能集中洗脱下来。

(3) 实验教材中以中性氧化铝做固定相,首先用95 %乙醇做洗脱剂

洗脱出亚甲基蓝,然后换用0. 1 mol·L - 1HCl 把甲基橙洗脱下来[1 ],或者换用水洗脱[2 ,3 ]。结果它们的色带分散,不清晰,洗脱体积大。原因是甲基橙(p k a = 3. 4)和亚甲基蓝(p k a1 = 4. 52 ,p k a2 = 5. 85)[4 ]都属于偏酸性物质,氧化铝对它们的吸附性大,需较长时间才能洗脱下来,因而产生扩散现象,使色带难于观察,也影响了分离后的处理工作。本实验换用适用于分离酸性物质的硅胶做固定相,用A 液做洗脱剂,洗脱次序被重新调整,首先集中洗脱出甲基橙,之后改用B 液做洗脱剂,集中洗脱亚甲基蓝,从而保证这两种物质充分有效地分离。

(4) 亚甲基蓝被硅胶吸附后,只能用乙醇-水的电解质溶液方可使亚甲基蓝从硅胶柱上洗脱。这一现象的解释为:亚甲基蓝分子中有一部分结构相当于季铵盐,以离子态存在,仅用水或极性较强的有机溶剂洗脱不能使它从偏酸性硅胶上解吸,而单独用电解质水溶液虽然增强了电解质的离子与亚甲基蓝分子中的季铵离子部分的作用力,但与亚甲基蓝结构中的非极性部分作用力弱,故洗脱能力弱,这样单独用电解质水溶液也达不到有效洗脱的目的,所以只有在有机溶剂中加些电解质水溶液,才能同时满足上述要求。电解质可以选用HCl、NH4Cl、NH4NO3、(NH4) 2SO4、NaCl、Na2SO4、ZnSO4、Na2CO3等物质,因为亚甲基蓝结构中有Cl-,考虑到不带入杂质离子,所以选用B 液做亚甲基蓝的洗脱剂。

(5) 在柱色谱实验教学中,由于缺少对学生实验情况的评判标准,学生实验开始时较认真,当混合物在柱中被分离开,认为达到了实验要

求, 往往就不仔细收集柱中分离出的物质。我们针对这一方面的不足,设计用移液管定量上样,对收集到的物质测定吸光度,然后根据标我们针对这一方面的不足,设计用移液管定量上样,对收集到的物质测定吸光度,然后根据标准曲线,计算每一种物质的回收率。由于本实验在装柱、上样、洗脱和收集等项操作之外还训练学生的定量操作,对于培养他们实验中精益求精的科学态度,起到了较好的效果。

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