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基因工程考试重点

基因工程考试重点
基因工程考试重点

一、名词解释

1.质粒(plasmid):是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色

体DNA而自助复制的共价、闭合、环状DNA分子(covalently closed circular DNA),也称为cDNA,其大小通常在1-100kb范围内。

2.DNA连接酶(DNA ligase):广泛存在于各种生物体内,其催化

的基本反应形式是将DNA双链上相邻的3羟基和5磷酸基团共价结合形成3,5–磷酸二酯键,使原来断开的DNA缺口重新连接起来,因此它在DNA复制、修饰以及体内体外重组过程中起着重要作用。

3.限制性核酸内切酶的星号活性:第Ⅱ类限制性核酸内切酶虽然具

有特异性的识别序列及切割位点,但当酶解条件发生变化时,酶切反应的专一性可能会降低,导致同种酶识别多种序列,这种现象称为限制性核酸内切酶的星号活性。

4.接合(conjugation):是指通过细菌细胞之间的直接接触导致DNA

从一个细胞转移至另一个细胞的过程。这个过程是由结合型质粒完成的,它通常具有促进供体细胞与受体细胞有接触的接合功能以及诱导DNA分子传递的转移功能,两者均由结合型智力上的有关基因编码。

5.转化率:是转化(包括感染)效率的评估指标,通常由两种形势

表征转化率。一是在待转化DNA分子数大于受体细胞数的条件下,转化细胞与细胞总数之比。转化率的另一种表示形式是在受体细胞相对待转化DNA分子数大大过量时,每微克DNA转化所产生的克隆数。

6.正选择:载体遗传标记法的原理是利用载体DNA分子上所携带

的选择性遗传基因筛选转化子或重组子。由于标记基因所对应的遗传表型与受体细胞是互补的,因此在培养基中施加合适的选择压力,即可保证转化子显现(长出菌落或噬菌斑),而非转化子隐去(不生长),这种方法称为正选择。

7.鸟枪法:将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的

DNA片段,分别连接到载体DNA上,转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子。

8.基因文库(gene library或gene bank):是指某一特定生物体全

基因组的克隆集合。基因文库的构建就是将生物体的全基因组分成若干DNA片段,分别与载体DNA在体外拼接成重组分子,然后导入受体细胞中,形成一整套含有该生物体全基因祖DNA 片段的克隆,并将各克隆中的DNA片段按照其在细胞内染色体上的天然序列进行排序和整理,因此某一生物体的基因文库实质上就是一个基因银行。

9.包含体:在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大

分子,他们致密地集聚在细胞内。或被膜细胞或形成无膜裸露结构,这种结构成为包含体(inclusion bodies,IB)。

10.潜伏期:当细菌接种到无菌培养基后,在一段时间内细菌数量并

不会立即增加,这个阶段称为潜伏期。细菌在此期间主要是适应新的环境条件,包括诱导表达原来处于关闭状态的代谢途径,合成营养物质代谢所需的运输蛋白和相关酶系等。潜伏期的长短首先取决于用于发酵接种的细菌菌龄,其次也与种子培养基和发酵培养之间的差别大小有关。

11.酵母:是一群以芽殖或裂殖进行无性系列的单细胞真核微生物,

分属于子囊菌纲(子囊菌酵母)、担子菌纲(担子菌酵母)、半知菌类(半知菌酵母),共由56个属和500多个种组成。

12.转基因技术:所谓的转基因通常是指在DNA操作过程中整合到

动植物受体细胞染色体上的外源基因。为了使外源基因在动植物体内稳定展现出相应的生物学表型,必须采用转基因的重组子构建技术、重组分子导入动植物体内的转化技术、转基因在受体细胞染色体上的稳定整合及可控型表达技术,这些技术统称为转基因技术。

13.转基因生物制品:含有转基因并为其遗传修饰了的动植物发育个

体则称为转基因生物制品。

14.基因:从化学上来说,指的是一段DNA或RNA顺序,该顺序

可以产生或影响某种表型(genotype,phenotype),可以由于突变生成等位基因变异体(体细胞父源和母源;正常和突变基因);

从遗传学上来说,基因代表一个遗传单位,一个功能单位,一个突变单位。

15.同裂酶与同尾酶:同裂酶(isoschizomer):在II型限制性内切核酸酶中,来源不同而识别序列和切割方式均相同者称为同裂酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。同尾酶(isocaudamer):在II型限制性内切核酸酶中,虽来源及识别序列不同,但DNA经其切割后能形成相同粘性末端者。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一组同尾酶。

注意:由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接,但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。

16. 探针与核酸分子探针

探针(probe),是指在化学与生物学意义上能够与特定的靶分子发生特异性相互作用,并可被特殊的方法探知的分子。抗体-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。

核酸分子探针(nucleic acid molecular probe):是指能与互补核酸序列发生复性杂交的特定已知核酸片段。

17.人工接头(adaptor)

人工接头(adaptor)是一种人工合成的短双链寡脱氧核苷酸,一端是可与目的基因双链(如cDNA)连接的平头末端,一端是可与载体连接的粘性末端。与linker不同,在加到cDNA分子之后adaptor不需要用限制酶降解,与脱磷酸化具有同样粘性末端的载体相连。18.转导(transduction)

转导(transduction)首先将重组的λ噬菌体DNA或柯斯质粒DNA 体外包装成具有感染能力的λ噬菌体颗粒,然后经由在受体细胞表面的λ噬菌体接受器位点使这些重组体DNA注入大肠杆菌宿主细胞。

二、填空

1.核酸是一种线形多聚核苷酸,它的基本单位是核苷酸。核苷酸由

三部分组成:戊糖、碱基和磷酸。

2.野生型质粒的基本特性:自主复制性、可扩增性、可转移性、不

相容性。

3.λ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,由外壳蛋白与一个48.5kb

长的双链线状DNA分子组成。λ-DNA的两端各有一个12碱基组成的互补单链,称为cos末端。

4.Ⅰ类限制-修饰酶DNA识别位点结合以来于M亚基与辅助因子

S-腺苷甲硫氨酸的相互作用,后者通过变构作用使酶处于活性状态。Ⅲ类限制-修饰酶由R亚基和MS亚基组成,其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。II类限制性核酸内切酶具有180旋转对称的回文结构。

5.基因文库的构建通常采用鸟枪法和cDNA法两种方法。用鸟枪法

构建的基因文库又称为基因组文库(genomic bank),由cDNA法构建的基因文库则称为cDNA文库。

6.含有启动子活性的DNA片段的分离大体上有三种方法:鸟枪法

克隆、酶保护法分离和滤膜结合法分离。

7.目前在表达型载体上应用最为广泛的大肠杆菌天然启动子有四

P lac、P trp、P L、P recA它们分别来自乳糖操纵子、色氨酸操纵子、噬菌体左早期操纵子、recA基因。

8.包含体的分离主要包括菌体破碎、离心收集、清洗三大操作步骤。

9.融合蛋白三个特点是分离纯化程序简单、表达率较高、稳定性大

大增强。

10.在大肠杆菌中表达寡聚异源蛋白,还可用于同源或异源多亚基蛋

白质的体内组装,这方面成功的例子包括四亚基的血红蛋白和丙酮酸脱氢酶、三亚基的复制蛋白A以及两亚基的肌球蛋白和肌酸激酶等。

11.细胞内蛋白质降解功能:调控功能,即降低代谢途径关键酶的存量和灭活细胞调控因子

的和清除代谢过程中产生的错误折叠、错误装配、错误定位、毒性大或其他形式的异常蛋白质。

12.SDS已广泛用于牛生长激素、β-干扰素、白细胞介素-2的大规模纯化,其缺点是CMC值低,除去它极其困难。值得推荐的是正十二醇基肌氨酸,它的CMC值可达0.4%,远远高于SDS。

13. 基因工程菌的发酵通常有三种不同的操作方式,即为分批式发酵、流加式发酵、连续式发酵。

14.分批式发酵中整个细菌生长过程可分为六个典型阶段:潜伏期、加速期、对数期、减速期、稳定期、衰亡期。

15. 酵母自主复制型载体质粒的构建主要包括引入复制子结构、选择标记基因、克隆位点三部分DNA序列。

16.目前已广泛用于外源基因表达的酵母有:酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属等,其中酿酒酵母的遗传学和

分子生物学研究最为详尽。

17. pGKLl质粒拥有4个可读框,分别编码DNA聚合酶、毒素蛋白αβ亚基、免疫蛋白、毒素蛋白γ亚基。pGKL2质粒含有10个可读框,其中ORF2、ORF4、ORF6分别编码DNA聚合酶、DNA解旋酶、RNA 聚合酶。

18. 用于酵母转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷互补基因和显性基因两大类,前者主要包括营养成分的生物合成基因。

19.目前广泛使用的酵母可控性启动子表达系统有半乳糖启动子、酸性磷酸酶启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子、Cu2+螯合蛋白启动子、交配0c型阻遏系统。

20.大多数分泌型的蛋白质运输路线是:内质网膜 高尔基体 泡囊 细胞表面。

21. 限制酶的命名主要是参照H.O. Smith和D. Nathans提出的待命名酶的供体微生物的属名与种名相结合的原则进行的。限制性内切酶一般以提取这类酶的微生物的属名的第1字母大写和种名的第1,2个字母小写来命名。如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco, 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为Hin。

22.II型限制性内切核酸酶的酶活辅助因子是Mg2+,其识别序列/识别位点常呈旋转对称性。

23.大肠杆菌DNA聚合酶I全酶主要具有三种活性:①5'→3'DNA 聚合酶活性;②5'→3'外切核酸酶活性;③3'→5'外切核酸酶活性。Taq DNA聚合酶主要具有一种活性:5'→3'DNA聚合酶活性。

24.酵母转化法首先利用蜗牛酶处理对数生长期的酵母细胞,然后将经酶解去除了细胞壁的原生质体悬浮于山梨醇及氯化钙的溶液中,在运载DNA鲑精DNA、小牛胸腺DNA的存在下,用聚乙二醇使重组DNA分子进入酵母细胞。

25.酵母载体分为整合型载体,YIP、复制型载体,YRP和附加型载体YEP。植物农杆菌质粒载体可分为根癌农杆菌诱导肿瘤质粒,Ti plasmid载体和发根农杆菌诱导发根质粒,Ri plasmid载体。

三、选择

1. 1944年Avery证明了基因的物质基础是(A)

A DNA

B RNA

C mRNA

D 蛋白质

2. 0.1.4 20种氨基酸(中英文名称)的三字母代表符号。

甘氨酸(Glycine)→Gly,丙氨酸(Alanine)→Ala,缬氨酸(V aline)→V al,亮氨酸(Leucine)→Leu,异亮苷酸(Isoleucine)→Ile,脯氨酸(Proline)→Pro,苯丙氨酸(Phenylalanine)→Phe,酪氨酸(Tyrosin)→Tyr,色氨酸(Tryptophan)→Try,半胱氨酸(Cysteine)→Cys,甲硫氨酸或蛋氨酸(Methionine)→Met,丝氨酸(Serine)→Ser,苏氨酸(Threonine)→Thr,赖氨酸(Lysine)→Lys,精氨酸(A rginine)→A rg,组氨酸(Histidine)→His, 天冬氨酸(Aspartic acid)→Asp,天冬酰胺(Asparagine)→Asn,谷氨酰胺(Glutamine)→Gln,谷氨酸(Glutamic acid)→Glu

3.下列(B)来源于牛胰脏,(A)来自禽成髓细胞瘤病毒,(D)最初来自水生栖热菌,现可由基因工程途径来生产。

A逆转录酶B RNA酶A C T4–DNA 聚合酶 D Taq DNA聚合酶E碱性磷酸单脂酶 F T4–多核苷酸磷酸激酶。

4.影响连接反应的因素很多,包括(ABCD)。

A温度B离子浓度C DNA末端的性质及浓度 D DNA片段的大小等

5. 人血浆中的血清清蛋白浓度可高达42g/L,其功能是作为机体内集中重要生理物质的可溶性运输载体,包括(ABCDE)。

A类固醇激素、B胆汁色素、C金属离子、D氨基酸、E脂肪酸、F 维生素

6.狭义的转化(transformation)是指感受态的大肠杆菌细胞接受及表达( A )的生命过程。转染(transfection)是指感受态的大肠杆菌细胞接受及表达( B )分子的生命过程。

A. 质粒DNA分子

B. 噬菌体DNA分子

C. 柯斯质粒DNA分子

7.I型限制性内切核酸酶的酶蛋白由(C)构成,II型限制性内切核酸酶的酶蛋白由(B)构成,III型限制性内切核酸酶的酶蛋白由(A)构成。

A. 两种不同的亚基

B. 两个相同的亚基

C. 三种不同的亚基

8.在DNA聚合酶中,依赖于DNA的DNA聚合酶有(C D E F),依赖于RNA的DNA聚合酶有(A),它不以DNA或RNA为模板的DNA聚合酶是(B)。

A. 逆转录酶

B. 末端脱氧核苷酸转移酶

C. 大肠杆菌聚

合酶I(全酶) D. 大肠杆菌聚合酶I大片段(Klenow片段)

E. T4噬菌体编码的DNA聚合酶

F. 耐热的DNA聚合酶

(Taq DNA聚合酶)

9. 噬菌体载体插入型载体(insertion vector)可容纳的外源DNA 一般为(B);置换型载体容纳外源DNA片段大小范围一般为(D)。

A. ≤ 5kb

B. ≤ 10kb

C. 10–15kb

D. 9–22kb

10.柯斯质粒载体,是指一类由人工构建的含有λDNA的(B)和质粒的(C)特殊类型的质粒载体。

A.抗药性选择标记基因

B. cos序列

C. 复制子

D. 多克隆位点区

11.Southern吸印杂交法操作对象是(B),Northern吸印杂交法操作对象是(C),Western blotting操作对象是(D)。

A. RNA-RNA杂交体

B. DNA片段

C. RNA

片段 D. 蛋白质

四、简答

1.蛋白质的结构

(1)蛋白质的一级结构

蛋白质的一级结构即多肽链的氨基酸顺序。多肽链是蛋白质结构的基础,它是由α-氨基酸按一定的顺序通过肽键连接而成的。肽键是由一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基间失水缩合而成的。(2)蛋白质的二级结构

蛋白质的二级结构是指它的多肽链中有规则重复的构象。二级结构可涉及少至3个氨基酸残基或多至肽链中的大部分残基。氢键是稳定二级结构的主要作用力。蛋白质的二级结构有α-螺旋、β-折叠和β-转角三种基本类型。

(3)蛋白质的三级结构

形成二级结构后,多肽链还可进上步折叠成三维球状结构,它们具有独立的结构和功能,称为三级结构。有些较大蛋白质的多肽链会折叠成相对独立的结构域的三维结构。结构域常对应于基因中各自的外显子(exon)。

2.M13-DNA载体改造的内容?

(1)通过定点诱变技术封闭修复的重要限制性酶切口;(2)引入合适的标记基因,如含有启动子、操作子和β-半乳糖苷酶氨基端编码序列(lacZ’)的乳糖操纵子片段(lac)、组氨酸操纵子片段(his)以及抗生素抗性基因等;(3)将人工合成的多克隆位点接头片段插在lacZ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色,而只含有载体DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色;(4)在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的DNA测序引物序列,使得重组DNA分子的单链形式分离纯化后,可直接进行测序反应。

3.与M13-DNA相比,噬菌粒载体的优点是?

1.具有质粒的基本性质,便于外源DNA片段的克隆及重组子的筛选;2.在一定程度上提高了外源DNA片段的装载量,普通的M13-DNA系列载体长度为6.4Kb,外源DNA片段与之重组后通常利用质粒转化方法导入受体细胞,其导入效率在重组分子大于15Kb时与重组分子的大小成反比,因此载体越小,其装载量越大,噬菌粒通常只有M13mp载体大小的一半3. M13-DNA的重组分子在复制时常会发生DNA缺失,而噬菌粒重组分子则相对稳定。

4. λ-DNA载体改造的内容包括?

(1)缩短野生型λ-DNA的长度,提高外源DNA的有效装载量。(2)删除重复的酶切位点,引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆的可操作性。

(3)灭活某些与裂解周期有关的基因,使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌以避免可能出现的生物污染。

(4)引入合适的选择标记基因,便于重组噬菌体的检测。

5. 大肠杆菌DNA聚合酶1在其单一多肽链上具有的活性?

①5'→3'的DNA聚合活性,是DNA链在模板的指导下延伸;②3'→5'的核算酶外切活性,其主要功能是识别切除错配的碱基,通过这种校正作用保证DNA复制的准确性;③5'→3'的核苷酸外切活性,这一功能具有三个特征,首先待切除的核酸分子必须具有5端游离的磷酸基团,其次,核苷酸在被切除之前必须是已经配对的,最后,被切除的核苷酸既可以是脱氧的,也可以是非脱氧的;④核苷酸内切酶活性,当一段DNA带有游离5端磷酸基团的不配对单链时,该酶可作用在与此单链相连的两对配对碱基之间,切断其磷酸二脂键。

11.S1核酸酶(S1 nuclease)的特征?

①降解单链DNA或RNA,包括不能形成双链的区域(如发夹结构中的环状部分),但降解DNA的速度大于降解RNA的速度;②降解反应的方式为内切和外切;③酶量过大时会伴有双链核酸的降解,因为该酶的双链降解比单链低7.5万倍。在DNA重组及分子生物学研究中,S1核酸常用来切平突出的单链末端以及制作S1图谱。

7. 与鸟枪法相比,cDNA法的优点是?

首先,cDNA法能选择地克隆蛋白编码基因,而且由mRNA反转录合成的cDNA对特定的基因而言只有一种可能性,这样大大縮小了后续筛选样本的范围,减轻了筛选工作量;其次,cDNA法克隆的目的基因相当―纯净‖,它既不含有基因的5'端的调控区,同时又剔除了内含子结构,有利于在原核细胞中的表达;最后,cDNA通常比其相应的基因组拷贝要小数倍甚至数十倍,一般只有2~3kb或更小,便于稳定地克隆在一些表达型质粒上。因此,利用cDNA法将真核生物蛋白编码基因克隆在原核生物中进行高效表达,是基因工程常用的战略思想。

8. PCR扩增DNA的基本原理?

PCR扩增技术的本质是根据生物体DNA的复制原理在体外合成DNA,这个反应同样需要DNA单链模板、引物、DNA聚合酶以及缓冲系统,并包括三步程序:①将待扩增双链DNA加热变性,形成单链模版;②加入两种不同的单链DNA引物,并分别与两条单链DNA 模版退火;③DNA聚合酶从两个引物的羟基端按照模板要求合成新生DNA链,构成一轮复制反应。重复上述操作n次,理论上即可从1分子的双链DNA扩增到2n个分子,也就是说,经过42轮反应后,从1分子的1kb DNA即可得到1μg的相同DNA样品,而完成整个扩增反应只需要3h。

9.利用Taq DNA聚合酶扩增DNA片段的缺陷是产物容易发生序列错误的原因?

首先,在体外进行DNA聚合反应,由于脱离了体内较为完善的DNA 合成纠正系统,脱氧核苷酸掺入的误配率自然比体内高。生物体内DNA聚合反应的误配率约为10-9,而体外用大肠杆菌Klenow酶催化相同反应,误配率高达10-4。其次,Taq DNA聚合酶由于缺乏校正功能,其错误掺入率比Klenow酶还要高四倍,也就是说,对于一个1 kb 长的DNA靶序列,经30轮Taq DNA聚合酶循环反应后,扩增产物的出错率可达2.5 bp,这些错误的掺入可以发生在扩增产物的任何位点,既有颠换、转换,也有单碱基缺失或插入。

10.除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因文库还应具备哪些条件?

①重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力;②载体的装载量必须大于绝大多数基因的长度,以免基因被分隔在不同的克隆中;

③含有相邻DNA片段的重组克隆之间,必须具有部分序列的重叠,以利于基因文库各克隆的排序;④克隆片段易于从载体分子上完整卸下且最好不带有任何载体序列;⑤重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。上述条件的满足极大程度上依赖于基因文库的构建战略。

11.目的基因背景知识内容?

⑴目的基因的部分或全部碱基序列已知。

⑵目的基因编码产物的结构或功能已知。

⑶目的基因与某些生物表型(如疾病等)的相关性已知。

12.构建融合蛋白表达质粒必须遵循三个原则?

首先,受体细菌结构基因应能高效表达,且其表达产物可通过亲和层析进行特异性简单纯化。其次,外源基因应插在受体菌结构基因的下游区域,并为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下,并不需要完整的受体菌结构基因,以尽可能避免融合蛋白分子中两种组分的相对分子质量大小过于接近,为异源蛋白的分离回收创造条件。此外,两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要,它直接决定了融合蛋白的裂解方法。最后,当两个蛋白编码序列融合在一起时,外源基因的表达取决于其正确的翻译阅读框架。

13.整合型外源基因表达系统的构建应步骤?

①探测并鉴定受体菌染色体DNA的整合位点,以该位点被外源

DNA片段插入后不影响细胞的正常生理功能为前提,例如细菌的抗药性基因、次级代谢基因或两个操纵子之间的间隔区等;②克隆分离选定的染色体DNA整合位点,并进行序列分析;③将外源基因以及必要的可控性表达元件连接到已克隆的染色体整合位点中间或邻近区域;④将上述重组质粒转入受体细胞中;⑤筛选和扩增整合了外源基因的受体细胞。

14. 理想的变性剂应具备的性质?

①变性溶解速度快;②对包含体中残留细胞碎片的分离没有干扰;③无温度依赖性;④对蛋白酶具有抑制作用;⑤对蛋白质中的氨基酸侧链基团无化学反应活性。

15. 作为一个真核生物表达系统,酵母的优势是?

①基因表达调控机制丝糕清楚,并且遗传操作相对较为简单;②具有原核细菌无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统;③不含有特异性的病毒,不产生毒素,有些酵母属(如酿酒酵母等)在食品工业中有着几百年的应用历史,发球安全型基因工程受体系统;④大规模发酵工艺简单,成本低廉;⑤能将外源基因表达产物分泌至培养基中;

⑥酵母是最简单的真核生物,利用酵母表达动植物基因,能在相当大的程度上阐明高等真核生物乃至人类基因表达调控的基因原理以及基因编码产物结构与功能之间的关系。

16.核酸原位杂交

核酸原位杂交,又称组织原位杂交(Tissue in situ hybridization)和基因组原位杂交(Genome in situ hybridization),是指以特定标记的已知序列核酸为探针与细胞内或组织切片内的待测核酸进行杂交并对其实行检测的方法。根据所用的士民所测核酸种类,可分为DNA-DNA、DNA-RNA、RNA -RNA 。

一般流程:A、载片处理(酸洗、灭菌、涂多聚赖氨酸)→组织细胞切片或涂片的固定→组织细胞杂交前的预处理

17.Northern吸印杂交法

Northern吸印杂交法(Northern blot)是指通过虹吸转移法、电泳转移法、真空转移法等转移方法将经变性及电泳分离的RNA片段转移到一定固相支持物上然后进行杂交并对其进行检测的方法。一般流程:RNA的提取→ RNA变性电泳→ 印记转移→ 预杂交—(探针)→ 杂交→ 洗膜→ 放射自显影或化学显色。

18.基因工程的研究内容

根据一般技术操作流程,基因工程的研究内容主要包括以下几个方面:①运用合适的方法从生物体中分离或通过化学合成制备目的基因;②采用合适的方法将目的基因与合适的载体进行体外连接,构建重组DNA;③运用合适的方法将重组DNA导入生物细胞以获得转化体阳性克隆;④运用合适的方法对重组转化体阳性克隆进行进一步的分析以及操作,使目的基因在受体生物细胞中高效表达。

五、论述

1.阐述DNA重组的载体的功能及理想载体的条件?

(1)为外源基因提供进入受体细胞的转移能力

从理论上讲,任何DNA分子均可以物理渗透的方式进入生物细胞中,但这种频率极低,以至于在常规的实验中难以检测到。某些种类的载体DNA分子本身具有高效转入受体细胞的特殊生物学效应,因此由于外源基因与载体剪接所形成的DNA重组分子转入受体细胞的概率比外源DNA片段单独转化要高几个数量级。

(2)为外源基因提供在受体细胞中的复制能力和整合能力外源基因进入受体细胞后面临两种选择,或者直接整合在受体细胞染色体DNA的某个区域内,作为其一部分复制并遗传,或者独立于受体细胞染色体DNA而存在,在这种情况下,载体DNA分子必须为外源基因提供独立的复制功能,否则外源基因不可能在受体细胞中复制和遗传。

(3)为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力

外源基因的扩增依赖于载体分子在受体细胞中的高拷贝自主复制的能力,这种能力通常由载体DNA上的若干相关基因编码。同时,外源基因高效表达所需的调控元件一般也由载体分子提供。

应当指出的是,上述三大功能并非所有的载体分子都必须具备,DNA重组克隆的目的不同,对载体分子的性能要求也不同。但对于所有不同用途的载体而言,为外源基因提供复制和整合能力是必不可少的,因此通常选择生物体内天然存在的质粒以及噬菌体或病毒DNA作为载体蓝本,并根据分子克隆的的操作原理,对之进行必要的修饰和改造,构建出具有多种性能的载体DNA分子。

一个理想的载体至少应具备下列四个条件:

(1)具有对受体细胞的可转移或亲和性,以提高载体导入受体细胞的效率。

(2)具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,使得外源基因在受体细胞中稳定遗传。

(3)具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,有利于外源基因的剪接插入。

(4)具有合适的选择性标记,便于重组DNA分子的检测。

载体的可转移性和可复制性取决于它与受体细胞之间严格的亲缘关系,不同的受体细胞只能使用相匹配的载体系统。本节主要涉及

具有代表性的大肠杆菌载体系统,其他载体系统分别在相应的章节中述及。

2. 细菌转化的全过程?

(1)感受态的形成

典型的革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚,形成感受态时细胞表面发生明显的变化,出现各种蛋白质和酶类,负责转化因子的接合、切割及加工。感受态细胞能分泌一种小相对分子质量的激活蛋白或感受因子,其功能是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质(如细菌溶素)的合成,使细菌包壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶等。

(2)转化因子的接合

受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性接合,单链DNA或RNA,双链RNA以及DNA-RNA杂合双链都不能结合在膜上。

(3)转化因子的吸收

双链DNA分子与结合蛋白作用后,激活邻近的核酸酶,一条链被降解,而另一条链则被吸收到受体菌中,这个吸收过程为EDTA所抑制,可能是因为核酸酶活性需要二价阳离子的存在。

(4)整合复合物前体的形成

进入受体细胞的单链DNA与另一种游离的蛋白因子接合,形成整合复合物前体结构,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处。

(5)转化因子单链DNA的整合

供体单链DNA片段通过同源重组,置换受体染色体DNA的同源区域,形成异源杂合双链DNA结构。

3. PCR扩增技术的应用?

PCR技术的应用范围极广,概括起来,除了上述的目的基因分离与克隆之外,大致有下列几个方面:

(1)扩增DNA靶序列并直接测序

PCR技术通常用于扩增DNA靶序列产生双链分子,然而采取非对称性扩增方案,可以选择性地从DNA样品中富集某一区域的单链DNA,并直接用于双脱氧末端终止法测序反应,其程序如图2-61所示。非对称性PCR扩增的关键在于双引物的分子数之比悬殊极大,一般为1:100。在开始的几轮扩增反应中,两种引物均可指导合成各自相应的DNA新生链,但随着双链扩增产物的增多,含量少的引物逐渐成为相应DNA链合成的限制因素,于是DNA扩增趋向单链化,最终使得扩增产物单双链DNA分子比高达l010:l,这种方法显然要比M13克隆系统简便得多。

(2) DNA靶序列的突变分析

如果DNA靶序列发生较大范围的插入或缺失突变,则PCR扩增产物的大小就会发生改变,从而确定突变的位置。另外,只要任何一种引物相对应的DNA模板上发生大面积的缺失,则扩增反应根本不能进行,这是识别缺失突变的又一种方法。对于点突变的检测,通常需要进行两组平行的扩增反应,两组反应均使用相同的引物系统,包括引物A、引物B和引物B’,其中B和B’的序列只有一个碱基的差异。在一组反应中,引物B用同位素标记,而另一组反应中B’被标记。在扩增反应进行过程中,能与模板链完全配对的引物B或B’所合成的DNA比含有错配碱基的竞争者自然要多,因此根据两组扩增产物的放射性比活性高低,即可检测出样品DNA的靶序列的点突变。

(3)痕量DNA样品的检测与分析

利用PCR技术可以从痕量的血迹、毛发、单个细胞甚至保存了几千年的木乃伊中复制大量的DNA样品,供进一步分析鉴定之用,因而在疾病诊断、刑事侦察、物种的分子生物进化学研究等领域发挥着不可替代的作用。

4. 包含体的形成机制?

包含体的形成本质上是细胞蛋白质的集聚过程,其机制包括下列三个方面:

(1)折叠状态的蛋白质集聚作用

至少在某些情况下,具有折叠结构的蛋白质集聚是包含体的形成的基础。蛋白质的水难溶性以及细胞内的高浓度均能促进这种集聚过程,如大肠杆菌自身正常表达的膜结合蛋白即便具有良好的天然折叠空间构象,但因其较小的水溶性而倾向于集聚形成疏水颗粒。对外源基因表达的重组异源蛋白而言,尽管他们能靠自身的二硫键进行体内折叠,但这种折叠形式在大肠杆菌中是随机发生的,异源多肽链中半胱氨酸残基的含量越高,二硫键错配的概率也越大。这种错误折叠的蛋白质往往显示出较低的水溶性,再加上高效表达产生的高浓度蛋白分子之间的相互作用概率增大,最终形成分子集聚物。

(2)非折叠状态的蛋白质集聚作用

对于那些热稳定性差的重组异源蛋白,又在生长温度较高的细菌中表达,则蛋白产物的还原状态在细胞质内始终占主导地位,蛋白质分子内部的二硫键不易形成,因此大都处于非折叠状态。包含有高浓度或高比例游离巯基非折叠多肽的存在,均会大大提高多肽分子之间二硫键形成的概率,导致产生高相对分子质量的蛋白多聚体,从而降低其水相溶解度并形成包含体颗粒。

(3)蛋白折叠中间体的集聚作用

有些细菌或噬菌体自身合成的天然蛋白虽然是可溶性的,但其折叠中间体的半衰期较长而且溶解度较低。如果这些细菌或噬菌体生长在非生理条件下(如高温等),那么任何对蛋白折叠速率有负面影响的环境条件均可在不同程度上导致折叠中间体的积累,后者在折叠成天然蛋白质之前集聚为包含体o例如,沙门氏菌噬菌体P22一个编码尾部蛋白基因的突变株在42°C时,由于这一尾部蛋白折叠过程的延长,导致折叠中间体集聚形成包含体,从而影响噬菌体感染颗粒的装配。

5.高效表达的重组异源蛋白在大肠杆菌中形成包含体的影响素?(1)温度

温度对包含体形成的影响虽然不是个别现象,但并不普遍。细菌较低培养温度有利于重组异源蛋白可溶性表达的有β一干扰素、γ一干扰素、肌酸激酶、免疫球蛋白Fab片段、β-半乳糖苷酶融合蛋白、枯草杆菌蛋白酶E、糖原磷酸化酶等,但相当多的重组蛋白可溶性表达并不能依靠降低培养温度而得到改善。虽然较高的培养温度能诱导受体细菌热休克蛋白的表达,它在某种程度上抑制包含体的形成,但高温本身不利于蛋白质的折叠o

(2)表达水平

不管包含体的形成机制如何,重组异源蛋白的过量表达均有利于包含体的形成,然而通过降低表达量来提高异源蛋白的可溶性却并不容易奏效。

(3)细菌遗传性状

相同的重组质粒在不同的大肠杆菌菌株中表达异源蛋白,其可溶性与不溶性流分的比例可能不同,有时甚至相差很大。一般来说,大肠杆菌染色体DNA上的热休克基因表达产物(如Hsp、GroEL、PPlase 等)有助于重组异源蛋白的正确折叠而形成可溶性流分,同理,灭活这些基因则有可能促进包含体的形成。

(4)异源蛋白氨基酸序列

天然的人γ-干扰素在大肠杆菌中往往是以包含体的形式表达,但通过基因人工合成或定点突变技术改变其天然氨基酸序列,则可获得高比例的可溶性蛋白流分,相反,对于另一些异源蛋白而言,突变体比天然分子更易形成包含体。

6. 基因工程菌在发酵过程中,分子水平的优化控制?

基因工程菌在发酵过程中的优化控制有三个分子水平上作用位点

(1)外源基因的表达控制

基因工程菌的构建为这种控制提供了分子结构上的可能性,但它必须通过各种工艺手段在细菌生长过程中得以实现,这些手段包括外源基因转录启动的特异性诱导、表达产物在受体菌中的定位和转运等。外源基因的时空特异性表达控制可以在很大程度上减少表达产物对细菌自身生长代谢过程的影响,提高表达产物的宏观产率。

(2)细胞内蛋白质生物合成系统的均衡

无论基因工程菌的目标产物是蛋白质还是其他小分子化合物,它们都必须与细菌的初级代谢和次级代谢途径共用一套蛋白质翻译系统,其成分包括核糖体、tRNA、A TP/GTP以及相关的酶系。这些成分通常都由受体菌的染色体DNA编码,合理控制这些细菌基因的表达时间与强度,有利于细胞内代谢途径的和谐与稳定。

(3)重组质粒拷贝数或外源基因剂量的维持

从理论上来讲,外源基因剂量的增加有助于提高其表达产物的产量,但实际上并不都是如此的。如果细胞内RNA聚合酶是限制因素,外源基因剂量与其表达水平未必成正相关。而且重组质粒的高拷贝复制耗费大量的能源,不但影响细菌的正常生长与代谢,同时也不利于其稳定性。另外,重组质粒高拷贝复制在提高外源基因剂量的同时也同步增加了载体上其他基因(如标记基因)的分子数,这些基因的表达效率通常并不逊色于外源基因,因此两者之间的表达竞争不容忽视。

7. 论述根据不同的研究目的,可运用DNA重组技术构建哪些不同结构的转基因?

(1)基因组片段:用Y AC或考斯质粒等类型的在克隆动物基因组片段,这类转基因由于相对分子质量较大,能保持较完整的基因结构,能表达不易受宿主细胞基因组和其他因素的影响,从而得到更可靠的对相关基因体内表达及调控特征的认识。

(2)小基因:分别取同一基因的某一或若干区域组成转基因,用于研究该基因个部分在基因表达调控中的作用。

(3)融合基因:将不同来源的结构基因、非编码序列以及表达调控序列重组在一起,构成杂合转基因单位,这是研究最多、应用最广的转基因结构,它通常包括结构基因与异源调控序列的融合基因、由不同来源的结构基因组成的融合基因以及未知功能的调控序列与报告基因的融合基因等

(4)靶基因:结构基因或调控序列经诱变或定向突变处理后,将之重新输入动物体内,用于突变后基因功能的筛选与检测,既可作为遗传标记使用,亦可研究突变机制以及突变位点与基因功能之间的关系。

(5)插入基因:含有在动物染色体上随机或特异性插入的位点,根据需要也可加装标记基因,用于动物染色体的基因打靶,体内检测动物基因组的功能

(6)置换基因:两侧含有动物基因或其他DNA区域的同源序列,用于动物基因的定位分离与克隆,在标记基因的存在下,亦可用于基因您的定位灭活

8.叙述ICP基因工程与蛋白酶抑制剂基因工程机理。(15分)ICP基因工程:ICP基因来自于苏云金杆菌(bacillus thuringiensis,Bt),ICP基因工程主要是运用脓杆菌介导法,基因枪法等对植物进行ICP基因遗传转化,借助于伴胞晶体蛋白的毒性,达到抗病虫害的目的。其抗虫机理为:当苏云金杆菌的营养体发育到一定阶段后,在其一端形成芽孢,在另一端形成胞晶体。当昆虫吞噬伴胞晶体后,在昆虫肠道碱性条件和特定蛋白酶的作用下,伴胞晶体蛋白变成有活性的毒性分子。这种蛋白称为δ-内毒素(δ-endotoxin),被称作杀虫结晶蛋白(Insecticidal crystal protein, ICP)。ICP长期以原毒素(protoxin)形式存在。当ICP被昆虫取食后,在昆虫消化道内,其在碱性条件下溶解,被专一性蛋白酶水解而活化。活化后的ICP与昆虫肠道上皮细胞上的特异性结合蛋白结合而转型为毒性多肽分子。结合转型后的ICP全部或部分嵌合于细胞膜中,使细胞膜产生一些孔道,从而破坏了细胞的渗透平衡,最终就会使昆虫死亡。

蛋白酶抑制剂基因工程:蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor,PI)主要存在于植物的种子及块茎中,其含量可高达总蛋白的1%~10%,在有些果实中丝氨酸蛋白酶抑制剂的含量可达总蛋白的30%。植物中存在3种蛋白酶抑制剂:丝氨酸、巯基和金属蛋白酶抑制剂。其中,丝氨酸蛋白酶抑制剂与抗虫关系密切,因为大多数昆虫的蛋白消化酶为丝氨酸蛋白消化酶。巯基蛋白酶抑制剂鞘翅目昆虫具有独特抗性。基因工程方面的应用是:利用转基因技术将编码这些蛋白酶抑制剂的cDNA转移到某一种植物中,通过表达蛋白酶抑制剂来抑制相应害虫。

9. 简要阐明三种重组转化体的筛选与鉴定的方法(15分)

(一)α-互补(蓝白菌落筛选或称x-gal筛选)

⒈载体PUC系列(PUC18/19)带有 E.coli DNA的短区段,含:

(1)Lacz(N)即编码β-半乳糖苷酶N端的146个AA信息也称α-多肽;(2)编码区插入一个MCS并不破坏阅读框,使少数几个AA插入到该酶的N端而不影响其功能;(3)Plac可以启动Lacz的转录,表达,但受阻pr.阻遏,IPTG(异丙基硫代β-半乳糖苷)能够去阻遏。⒉JM103受体菌含lacz(c)可以编码β-半乳糖苷酶C端部分。⒊α-互补当载体转入JM103 lacz(n)与lacz(c) α互补,编码具有活性酶pr→使底物X-gal生色(5溴4氯3吲哚β-半乳糖苷产生兰菌落)。⒋当MCS 插入外源gene片断时,几乎无一例外产生无α-互补能力的氨基酸片段(插入酶失落)导致白菌落产生。

(二)插入失活

此法适用于带有抗生素抗性标记基因的克隆载体,将外源DNA插入到其一抗生素基因序列内,该基因就失活,据此特性,设计一套药物平板,可筛选出重组子。

1.PBR322含Amp r和tet r,后者含BamH I和Sal I2个单一限制酶切点,具有Amp r和tet r表型。(双抗)2.在tetr任何一个酶切点插入外源基因片断,都会导致tet r失活。3.将插入外源基因的PBR322分别涂布于含Amp r和tet r的琼脂板上,存活者必定是转化子。(Amp r)4.将存活菌复印在tet r的琼脂板上,对照2个平板,凡在Amp r平板上生长而在tet r上不生长的菌落,必定是带有外源基因的重组子。

(三)杂交筛选

1.基本原理:核酸杂交法是目前广泛使用的筛选目的基因片断重组的方法。应用放射性或非放射性标记的特定的DNA或RNA作探针进行DNA/DNA或DNA/RNA杂交的核酸杂交法,利用同源DNA配对的原理筛选含有目的基因片断的重组子。

2.分子杂交主要类型

根据测定对象不同可将分子杂交分为3个基本类型⑴鉴别DNA的杂交(Southern blot),受体片段为DNA,探针为DNA或RNA;⑵鉴别RNA的杂交(Northern blot),受体片段为RNA,探针为RNA或DNA;

⑶鉴别蛋白质的杂交(Western blot),受体片段为蛋白质,探针为另一标记蛋白质。

扬州大学基因工程期末试题复习要点整理

基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学,是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一,是现代生物技术的代表,是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习,使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用,为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发,或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释:共10题,每题2分,共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息,然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞,又称重组体。 5. 人工接头:是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域,是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质,来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术,是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题:共4题,共20分。 1.简述获得目的基因常用的几种方法。(5分)

基因工程复习重点

绪论 1.理论上的三大发现: (1)1944年,美国微生物学家Avery证明基因就是DNA分子,提出 DNA是遗传信息的载体。(2)1953年,美国科学家Watson 和英国科学家Crick提出 DNA Double Helix model。 1958年,Meselson 和Stahl证明 DNA半保留复制。(3)1968年,Nirenberg、Holley和Khorana解读了遗传密码及其在蛋白质合成方面的技能而分享诺贝尔生理医学奖。 2.技术上的三大发现: (1)限制性核酸内切酶的发现(1962年Arber ) (2)DNA连接酶的发现(1967Gellert) (3)基因工程载体的发现 3.基因工程研究的内容: (1)从生物有机体复杂的基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段。 (2)在体外,将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上,形成重组DNA分子。 (3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)。 (4)带有重组体的细胞扩增,获得大量的细胞繁殖群体(菌落)。 (5)从大量的细胞繁殖菌落中,筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。 (6)将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步研究分析; (7)将目的基因克隆到表达载体上,导入寄主细胞,使之在新的遗传背景下实现功能表达,产生出人类所需要的物质。 第二章基因克隆所需的工具酶 一、限制性内切酶 1.限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。 限制作用:是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用,破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等),使得外源DNA 对生物细胞的入侵受到限制 修饰作用:生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后,通过修饰酶的作用:在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰,可免遭自身限制性酶的破坏。 2.核酸内切限制酶的类型:I型、II型、III型 3.核酸内切限制酶的命名法由H.O.Smith和D.Nathans(1973)提议的命名系统 4.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性: a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位,切割DNA分子产生链的断裂; b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布,通常不是彼此直接相对的; c.??? 因此,断裂的结果形成的DNA片段,也往往具有互补的单链延伸末端。 一、识别位点:绝大多数的II型核酸内切限制酶,都能够识别由4~8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。切割位点都具有相同的双重旋转对称的结构形式(回文结构)。 二、切割类型: (1)两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列,这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段; (2)两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心,这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。 三、产生的末端特征: 1、粘性末端:是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构,它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。(平末端的DNA片段则不易于重新环化。) 2、同裂酶:有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列,这类酶特称为同裂酶。 3、同尾酶:与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同,识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。 4、由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点,特称之为“杂种位点”。 四.影响核酸内切限制酶活性的因素: (1) DNA的纯度。 提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率,一般采用如下三种方法: ①增加核酸内切限制酶的用量,平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。 ②扩大酶催化反应的体积,以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 ③延长酶催化反应的保温时间。 (2) DNA的甲基化程度:核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分,因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用,便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题,在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。 (3) 酶切消化反应的温度:大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃。消化反应的温度低于或高于最适温度,都会影响核酸内切限制酶的活性,甚至最终导致完全失活。 (4) DNA的分子结构 (5) 核酸内切限制酶的缓冲液:核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括:氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。酶活性的正常发挥,是绝对地需要二价的阳离子,通常是Mg2+。pH=7.4时,最佳 1、星号活性:EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力,通常叫做星号活性,以EcoRI*表示。 二.DNA连接酶 1、种类: ①、T4噬菌体DNA连接酶:可连接 1,两个带有互补粘性末端的双链DNA分子 2,两个带有平末端的DNA双链DNA分子 3,一条链带有切口的DNA分子 4,RNA:DNA杂合体中RNA链上的切口,也可将RNA末端与DNA链连,底物广泛。 ②、大肠杆菌DNA连接酶 1.底物是一条链带有切口的双链DNA分子 2.具有同源互补粘性末端的不同DNA片段 3.几乎不能催化两个平末端的不同DNA片段 4.底物要求严格,假阳性背景底

基因工程考试试题.doc

基因工程 一名词解释 DNA,1、限制与修饰系统:限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染,可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说,与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶,或者说是甲基化酶,能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp,大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性,至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity?简述Star activity的影响因素及克服方法? 答:在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素:①高甘油浓度(>5%);②酶过量( >100U/μl );③低离子强度( <25mmol/L);④高(> ;⑤有机溶剂如DMSO (二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等;⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施:①减少酶的用量,避免过量酶切,减少甘油浓度;②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇;③提高离子强度到100 ~ 150mM(在不抑制酶活性的前提下);④降低反应pH至;⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素?(影响酶活性的因素?) 答:外因:反应条件、底物纯度(是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染)、何时加酶、操作是否恰当,反应体系的选择、反应时间的长短 内因:星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答:限制酶切割 DNA 时,对识别序列两端的非识别序列有长度要求,也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸,否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时,如果要在末端引入一个酶切位点,为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物,应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ~4 个碱基对。 4、何为载体?一个理想的载体应具备那些特点? 答:将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备:①在宿主细胞内必须能够自主复制(具 备复制原点);②必须具备合适的酶切位点,供外源DNA 片段插入,同时不影响其复制;③有一定的选择标记,用于 筛选;④其它:有一定的拷贝数,便于制备。 5 抗性基因( Resistant gene)是目前使用的最广泛的选择标记,常用的抗生素抗性有哪几种?并举两例说明其原理? 答:氨苄青霉素抗性基因( ampr)、四环素抗性基因(tetr )、氯霉素抗性基因( Cmr)、卡那霉素和新霉素抗性基因( kanr , neor )以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成,与有关的酶结合,抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶,可分泌进入细胞的周质区,并催化β - 内酰胺环水解,从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合,从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白,可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补?如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒? 答:α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成:LacZ △ M15 ,放在 F 质粒或染色体上,随宿主传代;LacZ' ,放在载体上,作为筛选标记,当在 LacZ' 中插入一个片断后,将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β-半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal (同时可作为生色剂)的作用下,含重组质粒的菌落不能产生有活性的β-半乳糖苷酶,不能分解 X-gal ,呈现白色,而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程? 答:裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒,导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程:由感染复数

武生院基因工程期末试题

2013-2014年度第二学期基因工程期末考试 卷型:A 考试时间:90分钟满分:100分 一、名词解释(3×5) 限制性内切酶(或其它工具酶):能在特异位点上催化双联DNA分子断裂,产生相应的限制性DNA片段 荧光定量PCR:所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 (半定量PCR:是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法,通过mRNA反转录成cDNA,再进行PCR扩增,并测定PCR产物的数量,可以推测样品中特异mRNA的相对数量) 星活性:非标准条件下切割相似序列,产生非特异性片段 同裂酶(或同尾酶):来源不同但具有相同识别序列,产生相同或不同末端 转基因技术(或转基因动植物等):就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中,从而达到改造生物的目的。 二、填空(1×15) 1.Cosmid 实际上是由cos 位点和质粒构成的杂合载体,也可以说是带有cos 序列的质粒。 2.超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA、线状质粒DNA 在琼脂糖凝胶电泳的特点是:电泳的泳动速度由大到小分别是:超螺旋质粒>线状质粒>开环质粒。 3.质粒DNA的提取方法有碱裂解法、煮沸法、去污法。 4.基因工程中常用载体是质粒、噬菌体、动植物病毒。

5.设计引物是一般要求C+G的比例在40%-60%,长度在17-30bp 。 6.BAC载体与常规载体的区别在于复制单元的特殊性。 三、选择题(2×15,实卷应是1×35) 1.基因工程创始人(D) A A. Kornberg B W. Gilbert C P. Berg D S. Cohen 2.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于(C) A. 既可以作用于双链DNA ,又可以作用于单链DNA B.只能作用于单链DNA C. 只能作用于双链DNA D.只能作用于RNA 3.氨苄青霉素的工作原理为(A ) A.可以抑制细胞壁肽聚糖的合成 B.可以抑制核糖体的转位 C.可以与核糖体50S 亚基结合并抑制蛋白质合成 D.可以与核糖体30S 亚基结合并抑制蛋白质合成 4.反转录酶是一种(C ) A. 依赖DNA的DNA聚合酶 B. 依赖DNA的RNA聚合酶 C. 依赖RNA的DNA聚合酶 D. 依赖RNA的RNA聚合酶 5.II 类限制性内切核酸酶( A ) A.仅有内切核酸酶活性,甲基化酶活性由另外一种酶提供 B.限制性识别非甲基化的核苷酸序列 C.有外切核酸酶和甲基化酶活性

高中生物选修三基因工程知识点

高中生物选修三基因工程知识点 基因工程:是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,又叫做DNA重组技术。 (一)基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶) (1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性。 (3)结果: 经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较: ①相同点:都缝合磷酸二酯键。 ②区别:E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌,只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:

(2)目的:获取大量的目的基因 (3)原理:DNA双链复制 (4)过程: 第一步:加热至90~95℃DNA解链为单链; 第二步:冷却到55~60℃,引物与两条单链DNA结合; 第三步:加热至70~75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。 (5)特点:指数(2^n)形式扩增 第二步:基因表达载体的构建(核心) 1.目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。 2.组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因 (1)启动子:是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA 聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。 (2)终止子:也是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端。(3)标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。 第三步:将目的基因导入受体细胞 1.转化的概念:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。 2.常用的转化方法:

基因工程知识点梳理

生物选修3知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过,赋予生物以,创造出。基因工程是在 上进行设计和施工的,又叫做。 (一)基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— (1)来源:主要是从中分离纯化出来的。 (2)功能:能够识别的核苷酸序列,并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开,因此具有。(3)结果:经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式: 和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶()的比较: ①相同点:都缝合键。 ②区别:来源于大肠杆菌,来源于T4噬菌体, 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来; 而能缝合两种末端,但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端,形成磷酸二酯键。 必须需要模板 3.“分子运输车”—— (1)载体具备的条件:①。 ②,供外源DNA片段插入。 ③,供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是 ,它是一 种 。

(3)其它载体: (二)基因工程的基本操作程序 第一步: 1.目的基因是指:基因。 2.原核基因采取获得,真核基因是。人工合成目的基因的 常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取 基因文库(1)概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。 (2)类型:基因组文库和部分基因文库(如cDNA文库) (1)原理: (2)过程:第一步:加热至90~95℃; 第二步:冷却到55~60℃,; 第三步:加热至70~75℃,。 第二步:(核心步骤)

基因工程和细胞工程测试题(附答案,可用于考试)

5 高二生物《基因工程和细胞工程》测试题姓名班级 (时间:90分钟分数:100分) 一.选择题(本大题包括25题,每题2分,共50分。每题只有一个选项符合题意。) 1.以下说法正确的是() A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B.质粒是基因工程中惟一的运载体 C.运载体必须具备的条件之一是:具有多个限制酶切点,以便与外源基因连接D.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 2.植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不.相符的是() A.纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理——酶的专一性 B.植物组织培养和动物细胞培养——细胞的全能性 C.植物体细胞杂交和动物细胞融合——生物膜的流动性 D.紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养——细胞分裂 3.有关基因工程的叙述正确的是() A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可作运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 4.能克服远缘杂交障碍培育农作物新品种的技术是() A.基因工程 B.组织培养 C.诱变育种 D.杂交育种 5.下列关于动物细胞培养的叙述,正确的是( ) A.培养人的效应T细胞能产生单克隆抗体 B.培养人的B细胞能够无限地增殖 C.人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株 D.用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞 6.PCR技术扩增DNA,需要的条件是( ) ①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸 ④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体 A、①②③④ B、②③④⑤ C、①③④⑤ D、①②③⑥ 7.以下对DNA的描述,错误的是() A.人的正常T淋巴细胞中含有人体全部遗传信息 B.同种生物个体间DNA完全相同 C.DNA的基本功能是遗传信息的复制与表达 D.一个DNA分子可以控制多个性状 8. 蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是() A.氨基酸结构 B.蛋白质空间结构 C.肽链结构 D.基因结构 9.细胞工程的发展所依赖的理论基础是() A.DNA双螺旋结构模型的建立 B.遗传密码的确立及其通用性的发现 C.生物体细胞全能性的证明 D.遗传信息传递的“中心法则”的发现 10.下列不是基因工程中的目的基因的检测手段的是:() A.分子杂交技术 B.抗原—抗体杂交 C.抗虫或抗病的接种 D.基因枪法 11.在以下4种细胞工程技术中,培育出的新个体中,体内遗传物质均来自一个亲本的是() A.植物组织培养 B. 单克隆抗体 C. 植物体细胞杂交 D.细胞核移植 12.动物细胞融合与植物细胞融合相比特有的是() A.基本原理相同 B.诱导融合的方法类 C.原生质体融合 D.可用灭活的病毒作诱导剂 13.下列哪一项属于克隆() A.将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中 B.将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内 C.将鼠骨髓细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞

华东理工大学2004–2005学年第二学期基因工程期末考试

华东理工大学2004–2005学年第二学期 《基因工程》课程期末考试试卷B2005.6 开课学院:生物工程学院,考试形式:开卷,所需时间:120分钟 考生姓名:学号:专业:班级 一、问答题(共15分) 某表达质粒上含有一个能在大肠杆菌中可溶性表达的基因A,若将外源基因B插入到基因A的3' 末端,使之产生可溶性融合蛋白A-B,试设计合理的重组方案。(15分) ___ 起始密码子 A 基因全序列ATGATCGGGATTCGCTGGGATAAAGTGCACCTCAATATAGCACACGCTTGCAACGCAAAGAGC CCCGATTTCTGTAACCGCCAGCACAAAGATGCGGAACACCCAAAAGTGGCGGCAAACGCCTTC AACCGGATCCCGGGATATCAGCTGAGATCTGCTTTCTAG ___ 终止密码子 ___ 起始密码子 B 基因部分序列TCCCGGGATCCATGCTC.........................CGCTAAGAGGATCCTCCCGGGT ___ 终止密码子 BamHI:G\GATCC BglII:A\GATCT EcoRV:GAT\ATC EcoRI: G\AATTC SmaI:CCC\GGG PvuII:CAG\CTG 二、问答题(共15分) 简述基因洗牌术(DNA Shuffling)的工作原理及用途。 三、问答题(共10分) 为什么说多型汉逊酵母表达系统有可能比巴斯德毕赤酵母表达系统更优越?

四、问答题(共20分) 人促红细胞生长素(EPO)系一糖蛋白,其生物活性严格依赖于糖基侧链的序列和大小,临床上主要用于改善癌症患者由于放疗化疗所引起的红细胞降低症侯群。试设计一种高产人EPO的重组表达系统,内容包括: (1)选择合适的受体系统,并说明理由;(6分) (2)选择合适的载体系统,并说明理由;(6分) (3)确定合适的高效表达方案,并简述其机制。(8分) 五、问答题(共20分) 随着植物转基因技术的日趋成熟,世界范围内被批准上市的转基因农作物也不断涌现,然而人们对转基因产品的安全性仍有争论,至少他们要求对餐桌上的食物是否由转基因植物加工而成拥有知情权。为此,建立一种能区分转基因植物和天然植物的检测方法十分重要。目前,世界各国批准上市的转基因植物种类繁多,但绝大多数使用花椰菜花斑病毒(CaMV)的35S启动子。请设计一种能快速灵敏地检测转基因植物的实验程序,并简述其机制。 六、问答题(共20分) 下图是链霉菌的某段DNA序列,试分析其可能的开放阅读框(ORF),并写出: (1)N端10个氨基酸序列;(7分) (2)C端10个氨基酸序列;(7分) (3)潜在的SD序列。(6分) 5’CGCTTGAATTCGTTCCATCTGGAGTCTGTACATGACCAGCCGATACGGCAGCCGGCAGGAACT CGGCCAGAAGTTCCTCGTCGACCCCGACATCATCAAGCTGATACGCCGAGCCGCCGAACGAACGG AAGGTCCCATCGTTGATCTGGGCGCCGGAGACGGCGCCCTGACGCTGCCCTTGAGTCGATTGGGC CGCCCTGTCACCGCGGTTGAGCTCGATCCCCGCCGGGTCAAACGGCTTTCGGCGCGTGCCCCGGA AAACGTCAAGGTCGTCGGCGAGGACATTCTGCGCTTTCGGCTTCCGACCGTTCCGCACACCGTCG TGGGGAACATCCCCTTCCATGTCACGACGGCCACGATGCGCCGGATCCTGGTGGCTCCCGCATGG GTGTCGGCCGTCCTCGTGGTGCAGTGGGAAGTGGCGCGCCGCCGGGCCGGCATCGGCGGCTGCTC GCTGGTCACGGCGGAGTCCTGGCCGTGGTTCGACTTCTCGGTGCTCAAGCGGGTGCCGAGGTTCG CCTTCCGGCCCGCGCCCTCCGTGGACGGCGGGATCCTCGTCATCGAGCGGCGGCCCGAGCCACTG GTGCGGGAGCGCAGGGAGTACCAGGACTTCGTCAGACAGGTCTTCACCGGGCGCGGTCACGGGCT GCGGGAGATCCTCCAACGCATCGGGCGGGTCCAGGACAGCGACCTGTCCGCGTGGTTCAGGGCAC ATGGAGTCTCGCCGCAGGCGCTGCCGAAGGACCTCACCGCCGAGCAGTGGGCGTCGCTCTGGGGC ATGGCGCGTGGCGGCCGGTCCGTGCCGCGGACGCGGATACTCCGGGACCTGCCGCACCGCACGTC CCTCGGGCCGCGGCGCAACAGCGGCTGACGCGGGCGGCAACCGGCGTGGCGGGCCGG 3’

基因工程期末考试重点知识整理教学文案

基因工程期末考试重点知识整理

基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程(Gene Engineering),是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段:1972,第一个重组DNA分子的构建,构建人:Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生:1973,Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件: 一系列新的基因工程操作技术的出现; 各种表达克隆载体的成功构建; 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容(P9) 4、基因克隆的通用策略(P12)(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)

第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念:一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶,主要存在于细菌体内 特点(参加PPT) 命名:依次取宿主属名第一字母,种名头两个字母,菌株号,然后加上序号。如:从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ,Hin指来源于流感嗜血杆菌,d表示来菌株Rd,Ⅲ表示序号。 分类:依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为:Ⅰ型酶、Ⅱ型(Ⅱs型)酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶:α,β,γ,线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ

基因工程知识点总结归纳(更新版)

基因工程 绪论 1、克隆(clone):作名词:含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词:基因的分离和重组的过程。 2、基因工程(gene engineering):体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中,构成遗传物质的新组合,并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内,且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础:40年代发现了生物的遗传物质是DNA;50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理;60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础:限制性内切酶的发现;DNA连接酶的发现;载体的发现 3、基因工程的技术路线:切:DNA片段的获得;接:DNA片段与载体的连接;转:外源DNA片段进出受体细胞;选:选择基因;表达:目的基因的表达;基因工程的工具酶 1、限制性内切酶(restriction enzymes):主要是从原核生物中分离纯化出来的,是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名:属名(斜体)+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶:来源不同,其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶:来源不同,识别的靶序列不同,但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性:在适当反应条件下,1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物,所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性:改变反应条件,导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点:具有双链特异性,不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA,连接反应是吸能反应,最适反应温度是4至15度,最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶:特异性降解单链DNA或RNA。

(完整版)《基因工程》知识点默写

专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外和 ,赋予生物以新的,创造出更符合人们需要的新的和 。基因工程是在上进行设计和施工的,又叫做。 基因工程育种的原理:;优点:、 (一)基因工程的基本工具(工具酶:、) 1.“分子手术刀”—— (1)来源:主要是从中分离纯化出来的。 (2)功能:能够识别双链DNA分子的某种的核苷酸序列,并且使每一条链中部位的两个核苷酸之间的断开,因此具有性。 (3)结果:经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式:末端和末端。(4)限制酶自身DNA,原因是原核生物中或识别序列已经被。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较: ①相同点:都缝合键。 ②区别:E·coliDNA连接酶来源于,只能将双链DNA片段互补的之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合,但连接平末端的之间的效率较。 (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端, 形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接的末端,形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”—— (1)载体具备的条件:①。 ②。 ③。 (2)最常用的载体是 ,它是一种裸露的、结构简单的、独立于之外,并具有的 DNA分子。 (3)其它载体:、 . (二)基因工程的基本操作程序 第一步: 1.目的基因是指:。

2.获取目的基因的方法有、 和。 3.基因文库是指:将含有某种生物的许多DNA片段,导入 中储存,各个受体菌分别含有这种生物的,称为基因文库。包含了一种生物所有的基因,这种基因文库称为;包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库称为,如。 获取目的基因的依据有哪些?如、、 、、。 4.PCR技术扩增目的基因 (1)原理: (2)特点: (3)条件:()、、()、()。 (4)仪器:。 5.人工合成目的基因的方法有:、。第二步: ----也是基因工程的 1.目的:。 2.组成:+++ (1)启动子含义及作用: 。 (2)终止子含义及作用:。 注意与终止密码子的区别 (3)标记基因的作用:。 常用的标记基因是、。 第三步: 1.转化的概念:是进入受体细胞内,并且在受体细胞内的过程。 2.常用的转化方法: 将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是,其次还有和 等。其中单子叶常有的方法是。

基因工程期末考试重点知识整理

基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程(Gene Engineering),是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段:1972,第一个重组DNA分子的构建,构建人:Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生:1973,Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件: 一系列新的基因工程操作技术的出现; 各种表达克隆载体的成功构建; 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容(P9) 4、基因克隆的通用策略(P12)(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念:一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶,主要存在于细菌体内 特点(参加PPT) 命名:依次取宿主属名第一字母,种名头两个字母,菌株号,然后加上序号。

如:从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ,Hin指来源于流感嗜血杆菌,d表示来菌株Rd,Ⅲ表示序号。 分类:依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为:Ⅰ型酶、Ⅱ型(Ⅱs型)酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶:α,β,γ,线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端:两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的,对称地分布在识别序列中心位置两侧,这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端:两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心,这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的,称之为~。 同裂酶:一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如:BamHI和BstI均可识别GGATCC。 同尾酶:有些限制性内切酶虽然识别序列不同,但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如:TaqI:TCGA;ClaI:A TCGA T;AccI:GTCGAC 星星活性:某些限制性核酸内切酶在特定条件下,可以在不是原来的识别序列处切割DNA,这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱:(多为质粒图谱)

基因工程复习资料

细菌的限制—修饰作用 核酸限制性内切酶的类型及主要特性

一个单位的限制性核酸内切酶定义为:在合适的温度和缓冲液中,在50uL反应体系中,1h完全降解1ug底物DNA所需要的酶量。 星号(*)活性:如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率,内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列,这一现象称为星号(*)活性。 同位酶:识别位点相同,但切点不同。 同裂酶:识别位点和切点均相同,但来源不同。 同尾酶:识别的序列不同,但能切出相同的粘性末端 两种DNA连接酶 (1)大肠杆菌DNA连接酶:只能连接粘性末端。分子质量为68ku (2)T4噬菌体DNA连接酶:不但能连接粘性末端,还能连接平齐末端。分子质量为75ku

p35页表2-4 简述DNA连接酶的作用机制及其特点 说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤 基因工程载体根据来源和性质不同可分为质粒载体,噬菌体载体,黏粒载体,噬菌粒载体,病毒载体,人工染色体等 质粒的概念:质粒(plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状(线型质粒DNA 分子—眼虫、衣藻等)双链DNA 分子(酵母的“杀伤质粒”是RNA),可自身复制和表达。 共价闭合环状DNA(SC构型)开环DNA(oc构型)线形DNA (L构型) 同一质粒尽管分子量相同,不同的构型电泳迁移率不同: SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。 理想质粒载体的必备条件: A、具有较小的分子质量和较高的拷贝数 B、具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点(多克隆位点) C、具有两种以上的选择标记基因 D、缺失mob基因(载体的安全性:质粒不能随便转移、条件致死突变) E、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达(复制起点)、较小的宿主范围蓝白班筛选原理 穿梭质粒载体(shuttle vector) :由人工构建的具有两种不同复制子起点和选择性标记基因 黏粒载体也称柯斯质粒载体:它是一类含有λ噬菌体的cos序列的质粒载体 噬菌体载体的优越性p69

专题一、基因工程知识点归纳

专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点:DNA重组技术所需的三种基本工具;基因工程的基本操作 程序四个步骤;基因工程在农业和医疗等面的应用;蛋白质工程的原理。 2、专题难点:基因工程载体需要具备的条件;从基因文库中获取目的基 因;利用PCR技术扩增目的基因;基因治疗;蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理: 知识点一基因工程的概念:基因工程是指按照人们的愿望,进行格的设计,并通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫做DNA重组技术。 注意:对本概念应从以下几个面理解: 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” (1)限制性切酶的来源:主要是从原核生物中分离纯化来的。 (2)限制性切酶的作用:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。(3)限制性切酶的切割式及结果:①在中心轴线两侧将DNA切开,切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA,切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” (1)来源:大肠杆菌、T4噬菌体 (2)DNA连接酶的种类:E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 (3)作用及作用部位:E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸

二酯键,T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意:比较有关的DNA酶 (1)DNA水解酶:能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸,彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 (2)DNA解旋酶:能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链,作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意:使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外,在适当的高温(如94℃)、重金属盐的作用下,也可使DNA 解旋。 (3)DNA聚合酶:能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。(4)DNA连接酶:是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” (1)分子运载车的种类:①质粒:常存在于原核细胞和酵母菌中,是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子,独立于拟核之外。②病毒:常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 (2)运载体作用:①是用它做运载工具,将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 (3)作为运载体必须具备的条件:①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因,便于筛选。 思维探究:知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”,主要是介绍限制酶的作用,切割后产生的结果。在这部分容学习时,应关心的问题之一是:限制酶从哪里寻找?我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验,进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭,有保护机制?进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA,而使之失效,达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容,不能仅仅着眼于记住这几个 条件,而应该深入思考每一个条件的涵,通过 深思熟虑,才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展: 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是:呈现碱基互补对称,无论是奇数个碱

基因工程 重点复习

质粒拷贝数即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)多寡,质粒可分为两大复制类型:严谨型质粒:分子量大,低拷贝数,1-3拷贝 松弛型质粒:分子量小,高拷贝数,10-60拷贝 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷,不能满足克隆载体的要求,因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。 穿梭质粒载体;人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 优点;①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达 ②也能利用其它细胞系统(酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等)进行基因表达。 ③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。 蓝白斑筛选的机理 由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别,它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色 诱导培养基上只能形成白色菌落。 在麦康凯培养基上,α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶,能分解麦康凯培养基中的乳糖,产生乳酸,使pH下降,因而产生红色菌落,而当外源片段插入后,失去α-互补能力,因而不产生β-半乳糖苷酶,无法分解培养基中的乳糖,菌落呈白色。 这样,LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补,这种互补现象叫做 -互补 蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:(一)材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有:1. 机械破碎法2. 渗透破碎法(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提 取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用方法:1. 等电点沉淀法2. 盐析法 (四)样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质,须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有:凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析 蛋白筛选(SDS)实验原理是:在电场的作用下,带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移,其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。十二烷基磺酸钠(SDS)能与蛋白质的结合,改变蛋白质原有的构象,使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒,其短轴长度一样,而长轴与分子量大小成正比。在SDS-PAGE中,SDS-复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响,而只与蛋白质的分子量正相关。在一定浓度的凝胶中,由于分子筛效应,则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数,实验证实分子量在15kD~200 kD 的范围内,电泳迁移与分子量的对数呈直线关系,用此法可根据已知分子量白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线,再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。同时也可根据不同分离级分的蛋白条带的多少来判定分离纯化产物的纯度。

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