第3卷第1期2004毒3l
临床和实骆|薹学杂志
Journalof(1inieaimidExtⅫinumtaiMedicine
V01.3.No.1
Mar。,21104
文章编号:1671—46蜡《2004)0l一0043一惦
巴斯德毕赤酵母表达系统及其分泌型
蛋白表达的研究进展
路蓉综述簧云庆审校
(首榔医科大学免疫学系,北京100054)
【摘萋J巴斯德毕赤簿母表达系统可使用张效的醇氧化酶1(AOXl)启动乎,在甲醇诱导下实现外源基因的糍效表达。外源基耀整台人酵母的染色体基最组后,通过营葬缺陷型基蹦或抗性基艘进行暇性转化子的筛选。将外源基鑫耀读框架与信警菔褶融套辩可褥羁被蘩饰酶分泌垂扑源强粒蛋蛊。臻已有多种方法哥遘一步提高静潦雷的蛋巍鸹表达量。
£羲键词1巴斯德毕赤辩母(P蛐妇0astotls);毕醇;酵载化酶(bOX)
在过去的20年中,甲基营养型巴斯德毕赤酵母(Pichiapast04s)已发腥残鸯能够生戏多秘羚源虽舀豹卓越表达系统。随着精株和载体的改良以及操作技术上的显著进步,此系统已成为实验室研究及商业生产重缌蛋鑫魏豁宠。拳突对基赫德擎赤浚达系统瓣傀势、原理及应用进展进行综述。
1表达藏豁魏擒建
所有的袭达载体均包含以下基本组件:①在火肠轷藏中进行蠡主复制曲起始饿点;②农夫瑟抒慧穗/或毕赤酵母中具有功能的选择标记;③寝达元件:来源予醇氧化酶1(AOXI)基因5’端扁动子序列的0.9kb痔段辍寒潦手AOXl基辫转录终盘亭弱鹣O.3kb片段;④多克隆傥点:一般而言,外源基因编码序列第一个腺嘌岭一胸腺嘧嚷拨瞽.岛禳岭(^倦)与AOXl萋掰ATC之闻的距离达到最小时.袭达效果最佳,此捕人位置与大多数多克隆位点的第一个酶甥位点摇荐il’;③绩母豉寒残:凌其与秘嚣基嚣黻舍克隧到表达载体阅读框架内,以分泌形式表达目的蛋白。常见的裘达载体驶其选择标记见表1(2J。
1。l寤动予
巴斯德毕赤酵母簌达系统最常用的启动子是_米源子爨斯德毕券酵母醇氧诧酶(alcoholoxidase,AOX)基礴的启魂子。巴渐德毕赤辩母可和用AOXI和AOX2基因编码醇氧化酶,但细胞中醇氧化酶活性以AOXl基爨编码的产物巍主。荦醇霹严挺调控秘诱导
AOXI基霸的表达,以甲醇为碳源进行摇瓶培养时,AOXl基因编码的酵氧化酶可达细胞可溶性蛋白总量
鼹5锈,建发酵系统培养融霹达蓟或越过缨稳《溶性
髓白总最的30%。AOXI基因表达水平的调控发生在转录水平,以甲醇强碳源生长的细煦髓捡测到AOXl
罄困的转泶(占蒽mRNA的5%);黼在其它碳源中生长的细胞则检测不到AOXl转录的信息,据此可用
肇醇诱导巴擐德毕券酵母表达烬瀑嚣涎蛋鑫。AOXI基因存在抑制/去抑制和诱导两种调控机制:培养物
中抑制物(如葡萄糖)去除后,并不能使AOXl基因
大量转录,其有意绎簿诱导下,AOXl基嚣才麓太量转录。
虽然利用AOX!基因已成功表达了多种辨嚣蛋
臼,但戴基因表达系统不适粥于食品生产;此外,发酵培养时由于添加大量甲酵还存在火灾隐患。因此,
不拨争醇强唯一诱鬻狻瓣襄韵子具餐受丈啜{l为,嚣
筒已研制成功的盘要包描:GAP,FLDI,PEX8和溯1启动子。研究证实:①巴斯德毕赤酵母3一磷
鹱曹滴醛脱氢酶耩函(glyeeraldehyde一3一蕊osphatedehydrogenase,GAP)的启动予(即GAP启动子)在麓莓糖的诱导下,糍提供与AOXt癌淤子瘩平籀当静连续性表谴,在培养过程中不需更换碳源,搽作更为
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穗乐和实验蕨学毒志
Jotm'miofClinicalandExperimentalMedicine
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篱便。但GAP启动子的连续憾表达不遗用于对簿母具有毒性僚厢蛋白的生产。甘油或甲醇也可激发GAP启动子,但GAP产量分别是葡萄糖诱导条件下静2/3秘1/3。②蓉龋德毕蠹簿母§黪嚣获蔹赣蠖季醛脱氢酶(glutathione—dependentformaldehydedeh—ydro辨nase,FLO)基因的启动予(即FLDI启动子),在攀基范黢为氦源(蘩萄糖为羰源)培葬条{牛下,筏够提供与AOXl启动子水平相当的表达。在甲醇为碳源(硫酸铵为氮舔)的培蓁条谗下,墩可诱导I,IDl稿动子表达鞫的蛋白。③研究发现,菜蝗外源基因可因被启动的液达水平过高,而导致目的蛋白折叠失臻,趣工无姥或定像罐误珏j。主透AOXI、GAP或FLDI启动予即为导致外源基因过高表达的启动子。为扩大外源藏因的有效表达,某些能够启动基因粱和表述抟癌蚤予鲡琵x8商Ylrrl癌葫予,己莰毫新德毕济酵母中分离获得。
寰l常辩舳襄达载髂艇萁选择檬记
注:HIS4:缎胺酸脱妻【酶基因;Kart,;卡那霉索族抗性基因ble':褥采霉幕蒜抗控鏊强。
1.2选择标记
巴斯德毕赤酵母表达系统中豹选择标记包括:①营养缺陷型选择标记,如来源于巴斯德毕赤酵母的HIS4基因秘来派于酸漆酵母的ARG4基嚣秘SUC2基因;②抗性谶择标记,如来源于太肠杆两TrL903的能够使真核细胞对卡那撼索家族成员G418产生抗技的k∞I基透,巍来嚣于印度赣堡链异壁蔷(Streptoallote。ichushindustanus)的能够使细菌和真核缃胞对博策霉素家族成员Zeocin产生抗性的Shbler慕因,该慕嚣(375bp)髓够作为细蒴和酵母菌的选撵标记,鞠此含有此种选择标记的表达载体(pPICZ系列)较其他一44——裁体更易子筛选,可麓他操作程序。近来,j豢成凌获得一系剃新的营养筛选标记,如B斩藩毕赤酵母氨基眯唑琥珀酸草酰二胺合成酶(amidoimldazole*succinocarboxamidesyntha—se,ADE)瓣基因《ADEI)和乳清酸榱苷一5’一磷酸脱羧酶(orotidine5’一
phosphatedecarbo时tase,URA)的基蹦(UttA3)。具有上述选撵标记豹嚣种表达载律稻各种营养缺陷型
(adel,ar94,his4,ura3)毕赤酵母菌株业已构建成功。
1.3表选载体的转化
携带完整组件的表达载体首先以质粒的形式转化大瑟抒蘧势在其疼遴嚣扩增,经酶秘幕l溅痔{菱鞠表运载体构建正确后,转入巴新德毕赤酵母中进行表达。
2巴凝镶箪赤酵母蓑拣
所有的巴斯德毕赤表达菌株都来源予NRRL(N.rthemRegionalResearchtaboratories)一Y11430。绝大部分菌株具有一个至多个营养缺陷型突变或抗性选择标记以供转化后进行筛选。
2.1巴簸德毕赤翡母的表麓
根拱利用甲醇的能力,可将巴拼德毕赤酵昧分成三型:第一型:即Mut+型,此型毕券酵母具寄完整的AOXl翔AOX2罄透,能够在甲醇中潋野垒狻速率生长,为甲醇快利用型,绝太多数毕赤酵母为Mut+裘型。第二型:即Muf型,此型毕券酵母,如K&i71(his4ar酗aoxl△j?SARG4)的AOXl基因部分敲除,被酿酒酵母ARG4基因所取代,菌细胞可依赖AOX2黎因壤褥的步量酵畿往酶完蔽攀酵我瀣,嚣jl{:在擎酵培养基中生长缓慢,为甲醇慢利用型;第三测:即Mut。型,如MCl00—3(his4ar94aoxl△.‘?SARC_.4aw,2A■PhM),避型毕赤酵母AOXl聂AOX2基嘏均被敲除,菌细胞不能进行甲酵代谢,戈法在甲醇中生长,为甲酵不剥用毅啦j。越终,研究发理,姿AOXI和/或AOX2基因敲除后,AOXI启动予也可通过直接与外源目的基因融台的方式产生外源嗣的蛋白,有时蒸表达量筵至赛予Mut+鳖媾j。
2,2蛋白酶缺陷型毕赤酵母
研究发现,蛋白酶缺陷测毕赤酵姆。如SMDll63(hls4pep4pe01)、SMDll65(his4幽1)和SMDll68(his4pep4)可有效降低外源目的蛋白的酶解㈨。因jll:在太规摸发酵壤葵对,使粥此类蛋爨酶缺陷黧菠攮祷乖j于获得功能性外源目的擞自。但嫩此类蛋融酶缺陷型菌株的活力较皴,转化帛低且生长缀慢,所获外
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源目的蛋白产量较低。因此,只有在其他降低蛋白酶解方法均不理想时,才使用蛋白酶缺陷型菌株。
3表达载体的整合
巴斯德毕赤酵母细胞不含天然质粒,表达载体多以整合方式进入巴斯德毕赤酵母染色体基因组中。整合有如下两种方式:①在选择标记基因如HIS4或AOXI启动子处酶切表达载体使之线性化后,将其转入适当的营养缺陷型毕赤酵母苗内,经过同源重组以单交换(singlecrew5一over)的方式插人毕赤酵母菌基因组中。此种整合的成功率为50%一80%,转化子的Mut表型与原宿主菌相同。②载体经酶切后,使其外源基因表达元件和标记基因的两端与酵母染色体AOXl基因3’和5’端发生双交换(doubleeIoss—over)性整合…(整合率为10%~20%),即使酵母染色体AOXl基因被载体外源基因表达元件和标记基因所代替。因此,酵母只能依赖AOX2基因编码的活性较低的醇氧化酶进行甲醇代谢,此种转化子为Muts表型。
4分泌型外源蛋白的修饰
4.1信号肽及其选择
研究证实,巴斯德毕赤酵母表达系统能以胞内和分泌方式表达外源基因编码的蛋白。同时发现,以分泌方式表达的外源蛋白可占培养物上清总蛋白的80%¨J,这将有利于目的蛋白的进一步纯化。可供毕赤酵母选择的信号肽分为两类:即外源蛋白自身的信号肽和来源于酵母的信号肽。实验证实,虽然外源蛋白自身的信号肽能够介导目的蛋白的分泌表达,但有时也会出现目的蛋白胞内堆积,不能有效分泌表达的现象。因此当用毕赤酵母细胞表达分泌型外源蛋白时,通常选用来源于酵母的信号肽【6j。
目前可供选择的酵母信号肽有a一交配因子的前导肽序列、酸性磷酸酶信号肽和蔗糖酶信号肽等。其中酿酒酵母n一交配因子前导肽序列的使用最为广泛。但下列几种因素可影响此种前导肽序列的酶切效率:①受外源目的蛋白前导肽序列邻近氨基酸种类的影响:如前导肽序列邻近的氨基酸为脯氨酸时.Kex2内肽酶的切除效率会明显下降;②受全前导肽序列(pre+pro)或pre序列选用情况的影响:根据分泌型蛋白种类的不同,有时单独使用前导肽序列中的Dre序列.有时则使用全前导肽序列(pre+pro)会获得较高的酶切效率;③外源蛋白形成的三级结构可通过对相应酶切位点的保护作用,而降低对前导肽序列的酶切效率。有时,采用上述信号肽序列均不能引导外源蛋白分泌性表达。为此,Martinez—Ruiz等人将ct一交配因子前导肽序列进行突变,以产生更为有效的Kex2内肽酶酶切位点。此外,还使用完全人工合成的prepro前导肽序列提高了人胰岛索蛋白的产量【7J。4.2外源蛋白的糖基化作用
巴斯德毕赤酵母对分泌的外源蛋白具有糖基化作用.可通过N一连接使寡糖链与外源蛋白肽链糖基化识别位点(Asn—X—Ser,ItIr)天冬酰胺上的氮原子(N)共价结合;也可通过O一连接使寡糖链与外源蛋白肽链丝氨酸/苏氨酸上的羟基(OH)共价结合。高等真核细胞在其分泌的外源蛋白上所添加的寡糖链含N一乙酰半乳糖胺、半乳糖和唾液酸;而低等真核细胞如巴斯德毕赤酵母在其分泌的外源蛋白上所添加的寡糖链只含甘露糖。值得注意的是:有些天然分泌时不被糖基化的蛋白。由巴斯德毕赤酵母表达时却可能发生糖基化。如人体内合成的胰岛索样生长因子I为非糖基化蛋白,而由巴斯德毕赤酵母表达时,却有15%发生了糖基化作用【3J。此外,巴斯德毕赤酵母为其外源蛋白添加寡糖链时,所选择的丝氨酸和苏氨酸有时也与天然宿主细胞不一致。
巴斯德毕赤酵母对外源目的蛋白的糖基化作用具有以下两个主要特征:①极少出现过度糖基化,可避免外源蛋白产生过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能。②糖链中不含具有潜在致敏作用的Ⅱ一1,3一甘露糖【8J,使用安全。
5提高蛋白表达量的策略
5.1筛选高拷贝转化菌株
优化蛋白表达的常用方法是获得高拷贝转化菌株。实验表明整合高拷贝外源基因的转化菌株,其外源蛋白的表达量高于单拷贝转化菌株。获得含高拷贝外源基因的巴斯德毕赤酵母转化菌株的方法如下:①构建含高拷贝外源基因的表达载体,此种表达载体构建方法如下:用BamHI—BdⅡ或salI—Xhol双酶切外源目的基因,然后利用BamHI与B一Ⅱ或SalI与XhoI酶切位点的交叉结合性,将酶切产物插入到用BamHI或SalI酶切的含有单拷贝外源目的基因的表达载体上。重复以上方法即可获得含高拷贝外源基因的表达载体。②构建含HIS4和kant基因的表达载体:转化菌株对抗CAl8的能力与表达载体拷贝数密切相关,提高抗生素C,418的浓度可以得到含高拷贝表达
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载体的转化菌株。巴斯德毕赤酵母被转化为His4+菌株后,再进行高浓度抗生素G418筛选,获得的转化菌株所含表达载体的拷贝数可高达30个。③构建含Shble基因的表达载体:经此种表达载体转化的宿主菌,可直接用抗生素zeoein进行筛选,提高zeoein浓度可筛选出含高拷贝表达载体的转化菌株。
5.2发酵系统培养
发酵系统培养具有以下主要优势:①巴斯德毕赤酵母在发酵系统中可高密度生长(500OD600U/m1)。在大量发酵培养条件下,培养物中毕赤酵母的细胞浓度与其分泌的目的蛋白的产量成正比。②发酵系统可提供刚好满足菌细胞生长所需的甲醇量.在此种条件下,外源基因的转录水平是过量甲醇诱导时的3—5倍。③发酵系统可监测并及时补充毕赤酵母生长所需的氧气,以保证外源基因的正常表达。
5.3降低外源蛋白的酶解
降低外源目的蛋白酶解的方法如下:①降低培养基的pH值和培养温度(22℃一30"(2),破坏蛋白酶作用的最适条件,可减少外源目的蛋白的酶解;②培养基中添加蛋白胨和酵母提取物以增加蛋白酶作用的底物,可减少对目的蛋白的酶解;③在pH为6.0的培养基中,添加蛋白胨可以抑制蛋白酶的酶解作用;
④选用蛋白酶缺陷型菌株。
此外,尝试不同的转化方法,选择适宜的信号肽,构建泛肽过量表达的菌株【9’和通过筛选大量转化菌株也可获得高表达菌株。表2),其中很多产物已应用于临床实验[10一…。但毕赤酵母的更广泛应用,还有待于对此体系进一步的研究和开发。
表22G(13年报道的应用巴斯德毕赤酵母袭选的蛋白
6结语参考文献
巴斯德毕赤酵母表达系统具有极好的生产应用前景,其主要优势如下:①毕赤酵母更接近高等真核细胞,不含内毒素和其他有害物质,使用安全;同时表达的外源性目的蛋白可正确折叠和进行糖基化作用,因此具有天然蛋白所应有的生物学活性。②培养要求条件低,繁殖速度快,能进行高密度培养,且能耐受较高的液体静压,因此能低成本大规模生产。③目的基因整合在染色体上具有高稳定性;同时可高表达分泌型功能性外源目的蛋白,因此能有效克服复性造成的蛋白损失。④毕赤酵母极少分泌自身蛋白,在其培养液中除目的蛋白外,几乎不含任何其他蛋白,易于纯化。
巴斯德毕赤表达系统作为生产外源蛋白的重要宿主菌已经得到广泛的应用,表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等(最新表达的蛋白见一46—1Cer时Iino_IL.CreggⅢ.HetetDlogousprotein∞wi∞inthemet)ay.10t酬cyeastPichlapa“s.FE惜Miembiolo∞,P,ev,2000,24(1):
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抗菌肽及其转基因动物的研究进展
郭向华综述安云庆审校
(首都医科大学微生物和免疫学系,北京100054)
【摘要】
抗菌肽是具有广谱抗菌活性的小分子阳离子多肽,不易产生抗性菌,是新一代抗生索的理想候选者。
利用转基因动物不仅能够进行抗菌肽活性研究,而且能够用来生产抗菌肽,在医学上具有独特的研究和应用价值。本文简述了抗菌肽的作用机理和特点、抗菌肽的转基因动物研究进展,并探讨了进一步研究和应用抗菌肽中存在的问题
及对策。
【关键词】抗菌肽;转基因动物
一47——
巴斯德毕赤酵母表达系统及其分泌型蛋白表达的研究进展
作者:路蓉, 安云庆
作者单位:首都医科大学免疫学系,北京,100054
刊名:
临床和实验医学杂志
英文刊名:JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE
年,卷(期):2004,3(1)
引用次数:7次
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1.期刊论文谢静莉.张励.叶勤.周庆玮.辛利.杜鹏.甘人宝Muts型基因重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中甲醇
流加的控制-无锡轻工大学学报2003,22(1)
在采用Muts表型基因重组巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)发酵生产血管生长抑制因子(angiostatin)的过程中,诱导表达阶段甲醇的质量浓度对血管生长抑制因子的表达至关重要.因重组Muts型巴斯德毕赤酵母利用甲醇极慢,按文献方法流加甲醇时,甲醇逐渐积累达30 g/L,血管生长抑制素表达水平仅为4 mg/L.采用甲醇检测与控制系统对甲醇流加进行反馈控制后,甲醇质量浓度可稳定控制在设定范围.采用此系统控制诱导阶段的甲醇流加,同时手动流加适量甘油以促进细胞生长,血管生长抑制因子表达水平量最高可达89 mg/L.
2.期刊论文杜中军.朱水芳.黄文胜.翟衡毕赤酵母外源基因表达系统研究进展-生物技术通报2002(4)
巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris外源基因表达系统已经成功表达了很多胞间型和胞内型蛋白质.与酿酒酵母Saccharomyces ceresiviae相比,该系统所具有的很多优势使其应用越来越广泛.有关研究主要涉及以下几个方面:宿主菌株、表达载体、转化方法、外源基因整合、外源蛋白糖基化和高密度发酵培养等.
3.学位论文陈芳牛白细胞介素2在毕赤酵母中的表达2004
白细胞介素2(Interleukin-2,IL-2)主要是由激活的T淋巴细胞产生的一类细胞因子,在机体免疫应答中起重要作用.其最重要的功能是诱导T淋巴细胞增殖(从G0期到S期)和分化,并且具有刺激T辅助细胞和自然杀伤细胞分泌细胞因子等功能.采用重组DNA技术生产牛白细胞介素2(Bovine Interleukin-2,BoIL2)作为免疫增强剂和免疫治疗剂无疑具有重要意义.该文成功实现了BoIL2在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达.Pichia pastoris表达系统是近年来得到迅速发展的一种真核表达系统.Pichiapastoris是一种甲醇酵母,可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长.在表达真核细胞外源蛋白时,不仅具有原核生物生长快、操作简便、成本低的特点,又具备哺乳类动物细胞的翻译后加工和修饰的功能,从而表达有生物活性的蛋白.该研究将BoIL2基因成熟肽编码序列cDNA定向克隆到Pichia pastoris表达载体pPICZB中,构建出含BoIL2基因的重组质粒pPICZB-BoIL2,将经Sac Ⅰ酶切后线性化的pPICZB-BoIL2电转化到巴斯德毕赤酵母X-33中,经ZeocinTM抗性浓度梯度筛选出高拷贝重组菌株,用1﹪甲醇诱导目的蛋白表达.经SDS-PAGE及Western Blotting检测,表明BoIL2基因在酵母细胞质中获得了可溶性表达;通过金属螯合亲和层析(MCAC)获得纯化的C端带有His-Tag的重组蛋白;培养IL2依赖的小鼠CTLL-2细胞进行活性检测,证实所表达的重组BoIL2具有促淋巴细胞增殖的生物学活性.
4.学位论文龙娟人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白在毕赤酵母中的融合表达2008
胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种肠促胰岛素,它作为人体内功能性多肽,是迄今能诱导胰岛素分泌的最强物质,可以促进胰岛素基因转录和胰岛素分泌,提高受体对胰岛素的敏感性,消除胰岛素抵抗引发的各种并发症,其最显著的功能是促进胰岛β-细胞功能再生,防止胰岛凋亡[1,2,3],明显改善糖尿病人的血糖水平。 如前所述,GLP-1能通过刺激胰岛β细胞的增殖和新生,使β细胞数晕增加,对Ⅱ型糖尿病的治疗具有重要的意义。但GLP-1在体内被二肽基肽酶(dipeptidy 1 protease Ⅳ,DPP-Ⅳ)水解后,形成无活性的GLP-1(9-36)NH2,成为胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1receptor,GLP-1R)的体内天然拮抗剂,因此它在体内的半衰期不足5分钟。其短的体内半衰期决定了只有频繁、反复地给药才能取得令人满意的疗效,这一点极大地限制了GLP-1的临床应用。而且化学合成hGLP-1不仅成本高,而且合成产率低,不利于产业化规模生产。为此,本论文构建了人胰高血糖素样肽hGLP-1的突变体基因2Gly-hGLP-1,并使之与人血清白蛋白HSA进行融合,由于大肠杆菌和哺乳动物细胞表达系统具有明显的缺陷,因此本课题选用比较成熟的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达系统,使2Gly-hGLP-1-HSA融合基因在毕赤酵母中获得高表达,并对纯化条件进行摸索,同时对纯化后的2Gly-hGLP-1-HSA融合基因的生物学活性进行了鉴定,为今后长效GLP-1的研究与产业化发展奠定基础。 本研究通过人工合成和PCR相结合的方法获得人胰高血糖素样肽-1突变体基因片段2Gly-hGLP-1,同时获得了2Gly-hGLP-1和白蛋白的融合基因2Gly-hGLP-1-HSA(2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽(GGGGG)接头作为连接肽),构建了能在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的重组表达载体(pPIC9/2GIy-hGLP-1-HSA),通过电击转化到巴斯德毕赤酵母(GS115)中并进行诱导表达,筛选得到的高表达菌株经5L发酵罐发酵培养,分离纯化后,目的蛋白纯度可达到95%以上,浓度为为1.24g/L。通过动物实验证实了在毕赤酵母中分泌表达的重组蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有控制血糖的生物活性。现
min,72℃延伸10 min,2个循环。一步PCR得到目的基因为90bp。 2.通过已经得到的2Gly-hGLP-1基因和白蛋白基因进行融合,确定了PCR条件为
:94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸2min,共进行30个循环,最后72℃延伸10min,获得的融合基因长度为1884bp。 3.得到的2Gly-hGLP-1-HSA基因经过EcoRI+XhoI双酶切,连接到pPIC9载体后在大肠杆菌DH5α进行克隆,并且菌落PCR和测序结果表明目的基因已经连接到载体中。 4.制备了巴斯德毕赤酵母(GS115)感受态细胞,重组表达载体(pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA)通过电击转化剑感受态细胞中,电转化参数为电压2.0KV,电击时间4.5ms,通过MD平板筛选得到工程菌株。 5.确定了工程菌诱导的起始时间和收获时间:工程菌株接种于BMGY培养基中,当菌液OD600=1左右时,添加0.5%的无水甲醇进行诱导,每12h补加0.5%甲醇,经过10%SDS-PAGE电泳检测,结果表明有目的蛋白条带(2Gly-hGLP-1-HSA融合蛋白为69.5kD),并且在摇瓶条件下,随着诱导时间延长,目的蛋白表达量有累积趋势,并且在诱导84小时内,没有出现目的蛋白降解的情况。 6.在5L发酵罐进行了多批次的发酵培养实验,基本摸清了各项控制参数,获得了稳定高效的表达,5升发酵罐上的表达量超过了100mg/L。 7.初步确定了2Gly-hGLP-1-HSA融合蛋白的纯化工艺:发酵产物离心取上清,依次通过阳离子交换柱SP Sepharose E.F,疏水层析Phenyl Sepharose HP,阴离子交换柱Source 30
Q和分子筛Superdex 75纯化,取各步洗脱液做10%SDS-PAGE电泳分析。结果表明经纯化后样品中的杂蛋白明显减少,目的蛋白纯度可达到95%以上,并用Lowry法测定纯化后2Gly-hGLP-1-HSA融合蛋白的浓度为1.24g/L。 8.对昆明小鼠的糖耐量实验表明,皮下注射3.5mg/Kg纯化后的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA后20min即可显著地抑制血糖升高的趋势(P<0.05),整个过程中血糖的升高程度明显比对照组(皮下注射等体积的生理盐水)缓和,说明2Gly-hGLP-1-HSA融合蛋白具有降血糖活性。
5.期刊论文易巧.宋小双.朱祥伟.刘堰.YI Qiao.SONG Xiao-shuang.ZHU Xiang-wei.LIU Yan毕赤酵母工程菌表达
人白细胞介素-2突变体发酵条件的优化-西南大学学报(自然科学版)2008,30(1)
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)工程菌(KM71/pPIC9K-MvhIL-2,本室构建)能分泌表达三突变体人白细胞介素-2(MvhIL-2),突变位点分别为125 Cys→Ala; 18leu→Met; 19leu→Ser.通过对其发酵条件的研究,探索重组人白细胞介素-2突变体工程菌KM71/pPIC9K-IL-2的生长及产物表达规律,通过
3因素(即:发酵液起始pH值、甲醇诱导浓度、诱导时间)从3个不同水平上进行正交试验,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,得出摇瓶发酵表达MvhIL-2的最佳条件:发酵液初始pH 6.0,甲醇诱导浓度为0.5%,诱导72 h,最终使目的产物达到菌体总蛋白的30%以上,表达的MvhIL-2考马斯亮蓝染色条带最明显,为其进一步上发酵罐,大量生产重组人白细胞介素-2奠定了基础.
6.期刊论文张励.叶勤.辛利.杜鹏.甘人宝氨离子浓度对重组毕赤酵母的生长和血管生长抑制素表达的影响-微生
物学通报2002,29(1)
本研究采用流加补料培养方式培养重组巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),表达血管生长抑制素(Angiostatin).整个培养过程分为以甘油为碳源的生长阶段和以甲醇为碳源的诱导阶段.全过程用氨水调节PH时,诱导阶段菌体生长受到抑制,蛋白的最大表达量为9.08mg/L.进行不同氨离子浓度的摇瓶培养,证实在以甲醇为碳源时,氨离子浓度对菌体的生长有明显的影响.高密度培养中改用2 mol/L的KOH溶液调节pH,诱导阶段菌体有缓慢的生长,蛋白最大表达量增为20mg/L.
7.期刊论文顾小勇.李强.曹竹安毕赤酵母基因工程菌胞内AOX酶的检测方法-生物工程学报2001,17(4)
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为外源基因的表达宿主,已成功表达出一系列胞内和胞外蛋白[1~6],并已建立起了一套较成熟的发酵工艺.巴斯德毕赤酵母基因工程菌的外源基因,由胞内AOX酶(乙醇氧化酶)基因启动子调控.在非甲醇碳源条件下(如甘油或葡萄糖),AOX酶基因表达被抑制,外源基因也处于不表达状态.而以甲醇为唯一碳源时,AOX酶在胞内大量合成,同时外源基因被调控表达.在一般情况下,AOX酶的变化直接反映了外源基因的表达状况,因此通过分析检测胞内AOX酶的含量和变化速率,就可以确定外源基因所处的状态.
8.学位论文姚博纤维素外切葡聚糖酶CBH I在Pichia pastoris中的表达研究2004
常规的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统已广泛应用,虽已积累大量经验,但也存在不足之处,如菌株生长速度慢、密度不高、外源蛋白的表达和翻译后加工都不够理想.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统,近年来已受到广泛重视,是一种非常具有潜力的真核表达系统.此系统不但能克服酿酒酵母表达系统的不足,而且具有高分泌、高稳定和高表达三大显著特点,外源蛋白的表达水平也比酿酒酵母高.该论文的研究使用基因重组技术表达纤维素外切酶CBH I,构建了在毕赤酵母细胞中表达的重组质粒pPIC9k-cbhl,转化嗜甲醇酵母并进行表达实验研究.根据目的的基因cbhl的cDNA序列设计两条引物,使上游带SnaB I酶切位点,下游带Avr Ⅱ酶切位点,以质粒pUCmT-cbhl为模板,进行PCR扩增反应;将所得的DNA片段经SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ双酶切后与载体pPIC9k质粒进行连接,然后导入大肠杆菌JM109,用Amp<'r>筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组质粒pPIC9k-cbhl.再用电穿孔法转化酵母(Pichia pastoris),用缺组氨酸的MD平板筛选阳性菌株,通过甲醇诱导表达.该论文用所设计的引物扩增出了两端分别带SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ酶切位点的cbhl DNA片段,插入载体pPIC9k并导入大肠杆菌JM109获得了阳性克隆,经双酶切鉴定表明重组质粒是pPIC9k-cbhl,说明目的基因cbhl已成功克隆到载体pPIC9k上.转化嗜甲醇酵母获得重组的毕赤酵母菌株,并诱导其分泌表达目的蛋白,发现甲醇浓度为0.5﹪、连续诱导3天得到的蛋白表达量较高.经SDS-PAGE电泳得到
56kD的重组蛋白条带;而且,表达的CBH I可以分解底物pNPC,但对羧甲基纤维素(CMC)不产生作用.实验结果表明我们构建的重组质粒pPIC9k-cbhl已经在嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)中获得了表达.在上述研究的基础上,该论文试图通过点突变对CBH I的糖基化位点进行改造,构建点突变重组质粒,转化毕赤酵母,研究过度糖基化对纤维素外切酶CBH I在酵母中表达的影响.
9.期刊论文张亚波.刘连盟.徐荣燕.李多川.ZHANG Yabo.LIU Lianmeng.XU Rongyan.LI Duochuan嗜热子囊菌光孢
变种内切葡聚糖酶Ⅰ基因在毕赤酵母中的表达及部分酶学性质-应用与环境生物学报2009,15(3)
嗜热子囊菌是一种嗜热真菌,可以产生具有很高工业价值的内切葡聚糖酶.本研究成功表达了嗜热子囊菌内切葡聚糖酶Ⅰ基凶,并获得热稳定的重组内切葡聚糖酶.提取嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)总RNA,通过RT-PCR方法克隆出内切-β-葡聚糖酶eg1基因的成熟肽编码序列.采用基因重组的方法构建该基因的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris分泌型表达载体pPIC9K-eg1,经线性化后采用电穿孔法将其导入毕赤酵母
GS115中,大量筛选后获得高效表达内切葡聚糖酶Ⅰ的毕赤酵母工程菌株GpN24.该菌株采用甲醇诱导120 h后,内切葡聚糖酶Ⅰ的活力可达570.7 U/mL,最适温度为55℃,在90℃的条件下保温30 min后仍具有60%的酶活力;最适pH为5.0,在pH 3.0~5.0的条件下酶活力保持稳定.图6表2参16
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文]-微生物学通报 2007(05)
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