lipo 2000说明书

Lipofectamine?2000转染说明书Introduction

Lipofectamine? 2000 CD is a proprietary animal origin-free formulation for the transfection of nucleic acids into eukaryotic cells. A Drug Master File (DMF) has been submitted to the FDA. Contact Technical Service or your local Sales Representative for permission to cross-reference the DMF. Using Lipofectamine? 2000 CD for transfection provides the following advantages:

Highest transfection efficiency in many cell types and formats. Refer to the Cell Lines database at https://www.wendangku.net/doc/7c14534443.html, for a list of cell types transfected. he animal

origin-free formulation ensures that mammalian cell culture and bioproduction processes are free of animal-derived materials. DNA-Lipofectamine? 2000 CD complexes can be added directly to cells in culture medium. It is not necessary to remove complexes or change/add medium after transfection, but complexes may be removed after 4-6 hours.

Important Guidelines for Transfection

1.Culture cells in serum-free media that are free of animal-derived components.

Test serum-free media for compatibility with Lipofecta mine? 2000 CD since some serum-free formulations (e.g. CD 293, 293 SFM II, CD Hybridoma)

may inhibit cationic lipid-mediated transfection.

2.For consistent animal origin-free transfection, use OptiPro? SFM (Cat. No.

12309-019) to dilute DNA and Lipofectami ne? 2000 CD before complexing.

3.Transfect cells at high cell density: For adherent cells, 90-95% confluence at

the time of transfection is recommended for high efficiency, high expression

levels, and to minimize cytotoxicity. For suspension cultures, transfect cells at

a density of 0.8-1.1 x 106 cells/ml. Optimization may be necessary. Maintain

the same seeding conditions between experiments.

4.Do not add antibiotics to media during transfection as this causes cell death.

5.Do not add Pluronic? or charged media extracts (e.g. dextran sulfate) to

media during transfection as these reagents can inhibit transfection Transfecting Adherent Cells

Use the following procedure to transfect mammalian cells in a 24-well format. For other formats, see Scaling Up or Down Transfections. Use the recommended Lipofectamine? 2000 CD amount as a starting point, then optimize conditions for your cell line and serum-free medium, as needed. All amounts and volumes are given on a per well basis.

1.One day before transfection, plate 0.5-2 x 105 cells in 500 μl of growth

medium without antibiotics so that they will be 90-95% confluent at the time

of transfection.

2.For each transfection sample, prepare complexes as follows

o a. Dilute DNA in 50 μl of OptiPro? SFM. Mix gently.

o b. Mix Lipofectamine? 2000 CD gently before use, then dilute the appropriate amount in 50 μl of OptiPro? SFM. Incubate for 5 minutes

at room temperature. Note: Combine diluted Lipofectamine? 2000

CD with diluted DNA within 30 minutes.

o c. After 5 minute incubation, combine the diluted DNA with diluted Lipofectamine? 2000 CD (total volume = 100 μl). Mix gently and

incubate for 20 minutes at room temperature (solution may appear

cloudy). Note: Complexes are stable for 6 hours at room temperature.

3.Add the 100 μl of complexes to a well containing cells and medium. Mix

gently by rocking the plate back and forth.

4.Incubate cells at 37°C in a CO2 incubator for 18-48 hours prior to testing for

transgene expression. It is not necessary to change the medium, but medium

may be replaced after 4-6 hours.

5.For stable cell lines: Passage cells at a 1:10 (or higher dilution) into fresh

growth medium 24 hours after transfection. Add selective medium the

following day.

TOP Scaling Up or Down Transfections

To transfect cells in different tissue culture formats, vary the amounts of Lipofectamine? 2000 CD, DNA, cells, and medium used in proportion to the relative surface area, as shown in the table. With automated, high-throughput systems, a complexing volume of 50 μl is recommended for transfections in 96- well plates.

Culture vessel Surf. area

per well

(cm2)

Relative

surf. area

vs. 24-well

Vol. of

plating

medium

DNA (μg) in

media vol. (μl)

Lipofectamine?

2000 CD (μl) in

media vol. (μl)

96-well 0.3 0.2 100 μl0.2 μg in 25 μl0.5 μl in 25 μl 24-well 2 1 500 μl0.8 μg in 50 μl 2.0 μl in 50 μl

12-well 4 2 1 ml 1.6 μg in 100

μl

4.0 μl in 100 μl

35-mm 10 5 4.0 μg in 250

μl

10 μl in 250 μl

6-well 10 5 2 ml 4.0 μg in 250

μl

10 μl in 250 μl

60-mm 20 10 5 ml 8.0 μg in 0.5

ml

20 μl in 0.5 ml

10-cm 60 30 15 ml 24 μg in 1.5 ml 60 μl in 1.5 ml

Note: Surface areas are determined from actual measurements of tissue culture vessels, and may vary depending on the manufacturer.

Transfecting Cells in Suspension

Use the following procedure to transfect suspension cells at any scale. Before beginning, make sure that cells are healthy and > 90% viable.

1.On the day of transfection, prepare a single cell suspension from stock cells at

< 3 x 106 cells/ml. Seed cells at a density of 0.8-1.1 x 106 cells/ml in growth

media without antibiotics.

2.For each transfection sample, prepare complexes as in Step 2, using the

following reagent amounts and volumes for every ml of cells transfected:

o Dilute 0.5-1.5 μg DNA in 34 μl of OptiPro? SFM

o Dilute 1-10 μl of Lipofectamine? 2000 CD in 34 μl of OptiPro? SFM

3.Add the complexes to the flask containing cells and media.

4.Incubate the cells at 37°C in a CO2 incubator on an orbital shaker rotating at

125 rpm for 24-96 hours prior to testing for transgene expression.

Optimizing Transfection

To obtain the highest transfection efficiency and low non-specific effects, optimize transfection conditions by varying cell density and Lipofectamine? 2000 CD concentrations.

Quality Control

Lipofectamine? 2000 CD is t ested for the absence of microbial contamination using blood agar plates, Sabaraud dextrose agar plates, and fluid thioglycolate medium, and functionally by transfection of CHO-K1 cells with a reporter plasmid.

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤 24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染实验步骤： （在生长培养基中直接加入复合物） 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，将细胞转至24孔板，控制密度使其在转染日密度接近90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。温柔混匀LIPOFECTAMINE 2000，室温温浴5分钟 （在5-25分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。） 注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。 3.对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。 4.混合稀释的DNA（由第3步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000（由第2步）。在室温保温20分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。

5.直接将复合物（100μl）加入到每孔中，前后（或左右）摇动培养板，轻轻混匀。 注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.2ml无血清培养基。 6.在37℃，5％的CO2中保温18-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7.在细胞中加入复合物18-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中（1：10），两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

Lipofectamine 2000 Transfection Reagent

Lipofectamine? 2000 Transfection Reagent TABLE OF CONTENTS PRODUCT DESCRIPTION SHIPPING CONDITIONS STORAGE CONDITIONS STABILITY QC SPECIFICATIONS PROTOCOL & APPLICATION NOTES Relative Surface Areas Of Tissue Culture Vessels Surface Areas Of Tissue Culture Vessels Tubes Recommended For Use With Lipofectamine? 2000 Optimizing Plasmid DNA Transfections With Lipofectamine? 2000 Transfection Protocols Co-Transfection Of Sirna And Plasmid DNA Transfection Of Fluorescently Labeled Oligos With Lipofectamine? 2000 Transfection Of Cells In 96-Well Plates Transient Transfection Of Suspension Cells ALTERNATE PRODUCTS & COMPATIBILITY PRODUCT DOCUMENTATION REFERENCES PRODUCT NAME & CATALOG NUMBERS ASSOCIATED PRODUCTS RELATED TECHNICAL SUPPORT NOTES

lipo2000转染操作步骤

L i p o2000瞬时转染细胞步骤 Stealth?RNAiorsiRNATransfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。PlasmidDNATransfection DNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。1中板。 贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。 2转染。 A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection

siRNA 中文操作手册(lipo2000)

THE RNAi COMPANY RNAi 产品使用手册 上海吉玛制药技术有限公司 Shanghai GenePharma Co.,Ltd.

Ⅰ. RNAi 简介 1 A. RNAi 实验原理 B. RNAi 实验流程 C. RNAi 实验所需试剂 D. 上海吉玛 RNAi 相关产品 Ⅱ. siRNA设计7 A. 哺乳动物siRNA设计 B. 上海吉玛 siRNA 产品特性 C. siRNA oligo 技术数据 Ⅲ. siRNA 对照9 A. 普通阴性对照 B. 荧光标记的阴性对照 C. siRNA阳性对照 D. 转染试剂对照 E. 避免off-target对照 Ⅳ. siRNA 转染10 A.siRNA 转染的方法 B.Lipofectamin2000 转染试剂 C.Lipofectamin2000适用的细胞类型 D.转染前细胞培养 E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例 F.贴壁细胞转染程序 G.悬浮细胞siRNA转染程序 H.DNA和siRNA共转染细胞程序 I. 体内siRNA导入方法 J. siRNA转染常见问题与建议 Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15 A. siRNA细胞转染条件优化 B. Real-Time PCR RNAi 效果检测 C. Real-Time PCR 结果分析 Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20 A. western-blot原理 B.western-blot操作步骤 w C.estern-blot上样液的制备 D.western-blot常用试剂的配制 Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22

Ⅰ. RNAi 简介 A. RNAi实验原理 RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

lipo2000转染操作步骤(精)

Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。

Invitrogen Lipofectamine2000

Lipofectamine? 2000 前言 Lipofectamine? 2000试剂是一项专利配方，用于高效转染Stealth? RNA或者短的干扰RNA（siRNA）到哺乳动物细胞，以进行RNAi分析（1，2）。该说明书提供了一般的指导以及使用Lipofectamine? 2000转染Stealth? RNA或者siRNAj 进入哺乳动物细胞的步骤。提供推荐的起始使用试剂剂量。为了获得最佳的RNAi实验结果，需要针对哺乳动物细胞系和目的基因优化转染的条件。 影响基因阻断水平（Gene Knockdown Level）的因素 在RNAi实验中，有许多因素影响目的基因表达程度的降低（例如：基因阻断），包括： ·转染效率 ·目的基因转录效率 ·蛋白质稳定性 ·所选择特异StealthTMRNA或者siRNA序列的效率 ·所选择哺乳动物细胞系的生长特征 当设计转染和RNAi实验时，需要考虑这些因素。如果需要更多的信息帮助您成功的进行RNAi实验，查阅标题为"RNAi成功的七个步骤"的文献。随同StealthTMRNA订货可以得到说明书，也可以从我们的网站（https://www.wendangku.net/doc/7c14534443.html,）下载或者通过与技术服务联系获得说明书。 转染的一般性指导 使用Lipofectamine? 2000转染Stealth? RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，遵从以下一般性指导： 1 为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染Stealth? RNA或者siRNA的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个Lipofectamine? 2000的浓度，并在20-100nM范围内改变Stealth? RNA或者siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。高浓度的Stealth? RNA或者siRNA可能具有细胞系依赖性。注：我们推荐开始时使用40nM Stealth? RNA或者siRNA。 2 在30-50％细胞汇合度时进行转染。通常基因阻断的分析至少要在转染后24-72小时进行。低密度转染细胞可以使转染和分析之间更长的间隙更长，从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。根据靶基因的特性，高密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。 3 不要在转染时的培养基中加入抗生素，因为这将会降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。 4 为了获得更好的结果，可以使用Opti-MEM? I 低血清培养基（目录号31958-062）在形成复合物前稀释Lipofectamine? 2000和Stea lth? RNA或者siRNA寡聚物。 5 可以使用invitrogen BLOCK-iT?荧光寡聚物(BLOCK-iT?Fluorescent Oligo)(目录号2013)帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定了用来转染的最佳条件，在每一次实验都包括BLOCK-iT?荧光寡聚物，作为转染效率的指示剂。如果需要的更多的信息，请参阅BLOCK-iT?荧光寡聚物说明书，说明书可以通过我们的网站下载或者通过拨打技术服务热线。

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参

lipo2000转染操作步骤(一类特选)

Lipo2000 瞬时转染细胞步骤 Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

lipofectamine2000转染说明

L i p o f e c t a m i n e 2000转染说明-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1

Lipofectamine TM 2000 CAT. NO. 11668-027 Size: CAT. NO. 11668-019 Size: ml 4℃储存（不要冻存） 说明： Lipofectamin TM 2000是核酸（DNA或RNA）转染真核细胞的一个专用的试剂盒，其有如下优点： 对各种细胞及细胞板（如96孔板）都有高的转染效率，在的细胞系数据库中有各种细胞转染成功的实例。 在含有或是不含有血清的培养基中，DNA- Lipofectamin TM 2000复合物能够直接加给细胞。 在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液，但在培养4-6小时后需要除去复合物。 关于转染的一些重要建议： 1.不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。在上有转染步 骤，登陆后点击说明。 2.对于大多数细胞系，转染复合物中DNA(μg)与Lipofectamine TM 2000(μl) 的比例在1：2到1：3之间，最好达到最优化的比例。注意：在混合之 前，我们建议用Opti-MEM I 低血清培养基（Cat: ）（reduced serum medium）稀释Lipofectamine TM 2000和DNA. 3.为了实现高的转染效率、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效 应，受体细胞最好达到高的浓度：在转染时，细胞的培养液的混浊度建 议为90%-95%并最优化混浊度。此外，在实验过程中保证相同的接种条 件。 4.为避免细胞死亡，在培养基中不要加抗生素。 5.由于一些无血清复合物（如CD239、SFM II、VP-SFM）会抑制阳离子脂 质体介导的转染，因此有必要检测一下无血清培养基和Lipofectamine TM 2000的相容性。 转染步骤（用于DNA）： 按照如下步骤在24孔板中转染哺乳动物细胞。对于其它种类细胞板请参照转染量度标准。步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积。 1.贴壁细胞：转染的前一天，在500μl无抗生素培养基中接种×105个细胞， 以保证在转染时候细胞的混浊度达到90%-95%。 悬浮细胞：在准备转染混合物时，每500μl无抗生素培养基中含有细胞数量为4-8×105。 2.对于每个转染样品，按下面的方法准备： a、在50μl无血清Opti-MEM I 低血清培养基中（或是其它无血清培养基） 稀释DNA，并轻轻混匀。 b、使用前轻轻混匀Lipofectamine TM 2000，然后取相应的量稀释在 Opti-MEM 培养基中。室温下静置5分钟。注意：要在30分钟内混合 Lipofectamine TM 2000和DNA的稀释液。

lip2000转染说明书

4. 哺乳动物细胞siRNA转染 4.1 转染方法： 将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。目前用的最多的是阳离子脂质体法。 4.1.1 磷酸钙共沉淀 将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。 4.1.2 电穿孔法 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。 4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene 带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。 4.1.4 机械法 转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。 4.1.5 阳离子脂质体试剂 在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。

Lipofectamine 2000转染说明

Lipofectamine TM 2000 CAT. NO. 11668-027 Size: 0.75ml CAT. NO. 11668-019 Size: 1.5 ml 4℃储存（不要冻存） 说明： Lipofectamin TM 2000是核酸（DNA或RNA）转染真核细胞的一个专用的试剂盒，其有如下优点： ●对各种细胞及细胞板（如96孔板）都有高的转染效率，在https://www.wendangku.net/doc/7c14534443.html, 的细胞 系数据库中有各种细胞转染成功的实例。 ●在含有或是不含有血清的培养基中，DNA- Lipofectamin TM 2000复合物能够直接加给细 胞。 ●在转染之后不需要除去复合物以及添加或是更换培养液，但在培养4-6小时后需要除去 复合物。 关于转染的一些重要建议： 1.不要用即将要介绍的转染程序进行RNAi的转染实验。在https://www.wendangku.net/doc/7c14534443.html,/rnai 上有转染步骤，登陆后点击说明。 2.对于大多数细胞系，转染复合物中DNA(μg)与Lipofectamine TM2000(μl)的比例 在1：2到1：3之间，最好达到最优化的比例。注意：在混合之前，我们建议用 Opti-MEM I 低血清培养基（Cat: NO.31985-062）（reduced serum medium）稀释 Lipofectamine TM 2000和DNA. 3.为了实现高的转染效率、高的目的基因表达水平以及低水平细胞毒效应，受体细胞 最好达到高的浓度：在转染时，细胞的培养液的混浊度建议为90%-95%并最优化 混浊度。此外，在实验过程中保证相同的接种条件。 4.为避免细胞死亡，在培养基中不要加抗生素。 5.由于一些无血清复合物（如CD239、SFM II、VP-SFM）会抑制阳离子脂质体介导 的转染，因此有必要检测一下无血清培养基和Lipofectamine TM 2000的相容性。 转染步骤（用于DNA）： 按照如下步骤在24孔板中转染哺乳动物细胞。对于其它种类细胞板请参照转染量度标准。步骤中均按照一个细胞孔的量给出质量和体积。 1.贴壁细胞：转染的前一天，在500μl无抗生素培养基中接种0.5-2×105个细胞，以保 证在转染时候细胞的混浊度达到90%-95%。 悬浮细胞：在准备转染混合物时，每500μl无抗生素培养基中含有细胞数量为4-8×105。 2.对于每个转染样品，按下面的方法准备： a、在50μl无血清Opti-MEM I 低血清培养基中（或是其它无血清培养基）稀释DNA， 并轻轻混匀。 b、使用前轻轻混匀Lipofectamine TM 2000，然后取相应的量稀释在Opti-MEM 培养基中。 室温下静置5分钟。注意：要在30分钟内混合Lipofectamine TM 2000和DNA的稀 释液。 c、室温下静置5分钟后，混合Lipofectamine TM2000和DNA的稀释液（总体积为 100μl）。轻轻混匀并在室温下静置20分钟（溶液混合后可能会看上去浑浊）。注

lipo转染操作步骤

l i p o转染操作步骤 This manuscript was revised by the office on December 22, 2012

L i p o2000瞬时转染细胞步骤 Stealth?RNAiorsiRNATransfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。PlasmidDNATransfection DNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。1中板。 贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。 2转染。 A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection

lipo2000转染操作步骤

. Lipo2000 瞬时转染细胞步骤RNAi or siRNA Transfection Stealth? 1 24孔板为例，其余规格的转染见表以适宜30-50%。1 中板，细胞密度为如 果转染后需要长时间注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 24-36小时后）每个孔转染方式如下：2 第二天（无血清培养基中。溶于A 将20pmol siRNA50ul Opti-mem 。B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min 两管混合，放置C 将A B20min。加管mix3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C 孔板对应孔中，4-6小时候 换成有血清培养基。入24Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 70-80%5 时转染 cells/well贴壁细胞：0.5-2X10，第二天待细胞密度达到 5 ， 中板后随即转染。4-8X10cells/well悬浮细胞：2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 1 / 3 .

lipo 2000说明书

Lipofectamine?2000转染说明书Introduction Lipofectamine? 2000 CD is a proprietary animal origin-free formulation for the transfection of nucleic acids into eukaryotic cells. A Drug Master File (DMF) has been submitted to the FDA. Contact Technical Service or your local Sales Representative for permission to cross-reference the DMF. Using Lipofectamine? 2000 CD for transfection provides the following advantages: Highest transfection efficiency in many cell types and formats. Refer to the Cell Lines database at https://www.wendangku.net/doc/7c14534443.html, for a list of cell types transfected. he animal origin-free formulation ensures that mammalian cell culture and bioproduction processes are free of animal-derived materials. DNA-Lipofectamine? 2000 CD complexes can be added directly to cells in culture medium. It is not necessary to remove complexes or change/add medium after transfection, but complexes may be removed after 4-6 hours. Important Guidelines for Transfection 1.Culture cells in serum-free media that are free of animal-derived components. Test serum-free media for compatibility with Lipofecta mine? 2000 CD since some serum-free formulations (e.g. CD 293, 293 SFM II, CD Hybridoma) may inhibit cationic lipid-mediated transfection. 2.For consistent animal origin-free transfection, use OptiPro? SFM (Cat. No. 12309-019) to dilute DNA and Lipofectami ne? 2000 CD before complexing. 3.Transfect cells at high cell density: For adherent cells, 90-95% confluence at the time of transfection is recommended for high efficiency, high expression levels, and to minimize cytotoxicity. For suspension cultures, transfect cells at a density of 0.8-1.1 x 106 cells/ml. Optimization may be necessary. Maintain the same seeding conditions between experiments. 4.Do not add antibiotics to media during transfection as this causes cell death. 5.Do not add Pluronic? or charged media extracts (e.g. dextran sulfate) to media during transfection as these reagents can inhibit transfection Transfecting Adherent Cells

转染的步骤

使用Lipofectamine?2000转染Stealth? RNA或者siRNA进入哺乳动物 Lipofectamine? 2000试剂是一项专利配方，用于高效转染Stealth? RNA或者短的干扰RNA（siRNA）到哺乳动物细胞，以进行RNAi分析（1，2）。该说明书提供了一般的指导以及使用Lipofectamine? 2000转染Stealth? RNA或者siRNAj进入哺乳动物细胞的步骤。提供推荐的起始使用试剂剂量。为了获得最佳的RNAi实验结果，需要针对哺乳动物细胞系和目的基因优化转染的条件。 影响基因阻断水平（Gene Knockdown Level）的因素 在RNAi实验中，有许多因素影响目的基因表达程度的降低（例如：基因阻断），包括： 转染的一般性指导 使用Lipofectamine? 2000转染Stealth? RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，遵从以下一般性指导： 1 为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染Stealth? RNA或者siRNA的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个Lipofectamine? 2000的浓度，并在20-100nM范围内改变Stealth? RNA或者siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。高浓度的Stealth? RNA或者siRNA可能具有细胞系依赖性。注：我们推荐开始时使用40nM Stealth? RNA或者siRNA。 2 在30-50％细胞汇合度时进行转染。通常基因阻断的分析至少要在转染后24-72小时进行。低密度转染细胞可以使转染和分析之间更长的间隙更长，从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。根据靶基因的特性，高密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。 3 不要在转染时的培养基中加入抗生素，因为这将会降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。 4 为了获得更好的结果，可以使用Opti-MEM? I 低血清培养基（目录号31958-062）在形成复合物前稀释Lipofectamine? 2000和Stealth? RNA或者siRNA寡聚物。 5 可以使用invitrogen BLOCK-iT?荧光寡聚物(BLOCK-iT?Fluorescent Oligo)(目录号2013)帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定了用来转染的最佳条件，在每一次实验都包括BLOCK-iT?荧光寡聚物，作为转染效率的指示剂。如果需要的更多的信息，请参阅BLOCK-iT?荧光寡聚物说明书，

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期：2012-06-25 来源：互联网作者：青岚点击：3644次 摘要： 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品，上生物帮>> >> 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]：

转染步骤(精)

Lipofectamine 2000 转染试剂转染步骤(24孔板 /6孔板 : 一 :瞬时转染 (贴壁细胞 1. 转染前一天,胰酶消化细胞并计数,细胞铺板在500 μl/2ml含血清,不含抗生 素的正常生长的培养基中 (每孔 0.5-2×105 /3×105 胞。使其在转染日能达到90-95%的融合。 2. 对于每孔细胞,使用 50ul/250 ul无血清培养基(如 OPTI-MEM I培养基稀释0.8ugDNA/ 4.0ugDNA, 轻轻混匀。 3. 使用前将 Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀,每孔细胞用 50ul/250 ul无血清培养基(如 OPTI-MEM I培养基稀释 2ul/10ul Lipofectamine 2000转染试剂 . 轻轻混匀 , 室温孵育 5分钟。 NOTE :Lipofectamine 2000稀释后, 在 5分钟后同稀释的 DNA 混合 (<30分钟。长时间孵育会降低活性 . 若使用 DMEM 培养基稀释, 则需在 5分钟内同稀释的 DNA 混合。 4. 混合稀释的 DNA (第二步和稀释的 Lipofectamine 2000(第三步 , 此时总体积是 100 ul/ 500ul 。轻轻混匀 , 室温放置 20分钟以使 DNA- Lipofectamine 2000复合物形成。溶液可能会比较浑浊 , 但这不影响转染效率 . DNA- Lipofectamine 2000复合物室温放置 6小时都比较稳定 . 5. (optional 将 24孔板中的旧营养液吸出,用无血清培养基清洗两次。加入 0.5ml/2ml无血清配养基。 6. 逐滴加入 100 ul/500ul 脂质体 /DNA混合物到每孔中(从培养孔一边到另一边,边加边前后来回摇动培养板,轻轻混匀。 7. 在 37℃, 5%CO

Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项

Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16 Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000 Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。 特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕 （2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基 操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。 转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释 0.8μg-1.0μg DNA。 对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。保温时间过长会降低活性。）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。 混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。在室温保温20分钟。 注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。 注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基。 在37℃，5％的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。