真菌感染性皮肤肉芽肿病变病原学诊断进展
综述
!!!!由真菌感染所致的皮肤及皮下组织慢性肉芽肿病变，如孢子丝菌病、着色芽生菌病、足菌肿等，在组织病理上均可表现为肉芽肿样结构。可引起肉芽肿样结构的常见病原真菌有皮肤癣菌、念珠菌、隐球菌、曲霉、孢子丝菌、马尔尼菲青霉、暗色真菌、毛霉目、虫霉目、镰刀菌等。病原学诊断是临床确诊并进行抗真菌治疗的根本依据。与表皮真菌感染相比，肉芽肿病变位置深在，病变组织内真菌含量相对较少，病原学诊断相对困难。常见的病原真菌检查技术如直接镜检、真菌培养及鉴定、组织病理、免疫组化、PCR及相关技术、原位杂交、显微切割PCR、血清学实验等方法在应用于真菌感染性皮肤肉芽肿病变时各有其优缺点及适应证，本文结合近年来上述方法在临床诊断中的应用情况，对真菌感染性皮肤肉芽肿病变的病原学诊断思路作一综述。
1直接检测病原真菌
1.1直接镜检
取肉芽肿组织、分泌物及组织液等临床标本制作涂片，寻找真菌菌丝和孢子。有经验的医生可初步判断念珠菌、毛霉、曲霉、马拉色菌、硬壳细胞等，墨汁涂片可发现隐球菌；直接镜检简单易行，阳性发现有助确诊。但直接镜检阳性率较低，阴性结果不能排除诊断。直接镜检发现真菌多不能鉴定到属或种；发现真菌孢子亦不能排除污染菌，需结合组织病理检查等结果综合分析。
1.2真菌培养及形态学鉴定、生化鉴定
培养法与直接镜检法可互相补充，从而提高真菌检出的阳性率[1]。取肉芽肿组织或分泌物、组织液等临床标本，培养有致病真菌生长可助确诊。发现条件致病真菌生长一般认为多次培养出同一种真菌诊断意义较大。开放性创面标本培养阳性应排除污染菌。培养发现未知真菌时不可轻易认定为污染菌，可多次做培养并结合组织病理及致病性动物实验分析[2]。培养1个月无菌落生长才能判定为阴性。阴性者可改换培养条件再次培养。培养阴性不能完全排除诊断。在怀疑真菌感染性皮肤肉芽肿病变临床病例的病原学诊断中培养法被广泛采用，有报道其阳性率超过组织病理检查[3-4]。特别是标本较少、取材困难不便做其他检查者更适宜做培养法。培养法亦可发现肉芽肿病变中多种致病真菌的混合感染[5]。
1.3普通组织病理及特殊染色
普通组织病理及特殊染色是诊断深部真菌感染的金标准[6]。肉芽肿病变中暗色真菌很容易被分辨[7]。但大多数致病真菌在组织中形态非常相似，组织病理方法只能确定真菌感染而不能鉴定致病真菌的属种，且阴性结果不能排除诊断[3]。临床常需与其他方法共同使用。
2检测病原真菌结构成分
2.1检测与病原真菌有关的抗原物质——
—免疫组化技术免疫组化技术的敏感性及特异性均较普通组织病理及特殊染色高，可提高病原真菌检出率。使用属或种特异性抗体可将某些真菌鉴定到属或种。但由于交叉抗原的存在，免疫组化结果亦可能存在假阳性，或者所用的特异性抗体不能覆盖临床病原菌而导致假阴性。所以阳性结果应与其他检查互相印证，阴性结果不能完全排除诊断。针对申克孢子丝菌、马尔尼菲青霉、曲霉属、毛霉目、念珠菌属、隐球菌的特异性抗体已有用于免疫组化检查的报道，临床上皮肤肉芽肿患者怀疑属上述真菌感染所致者可行免疫组化检查。相对于临床病原真菌来源的广泛性，现有用于免疫组化检测的抗体显得很有限。临床需要敏感性更高、特异性更强、覆盖面更宽的抗体用于初诊患者的检测。
2.2检测病原真菌核酸
2.2.1PCR及相关技术PCR及相关技术用于检测病原真菌的DNA，具有敏感性高、特异性强、快速便捷等优点，有较高的学术和临床价值。缺点除PCR实验易受污染外，在临床样本中有多种菌存在时（例如混合感染、污染菌）可能导致混淆或遗漏。采用属或种特异性引物可将样本中的目标真菌一步鉴定到种，但有可能将其他属或种真菌遗漏而呈现假阴性；采用通用引物做PCR得到阳性条带只能说明有真菌而不能明确是什么菌，进一步做测序可鉴定菌种。郑岳臣等[8]报告1例念珠菌感染所致肉芽肿病例，直接涂片可见菌丝、孢子，真菌培养因污染无法鉴定菌种。使用两对真菌通用引物做巢式PCR扩增组织标本中的DNA，扩增产物测序比对鉴定为解脂念珠菌，由此确定诊断。PCR法尤其适用于培养阴性或失去培养时机的患者[9]。PCR 的阳性率与真菌的数量有关，与肉芽肿结构形式无关[10]。用于检测孢子丝菌、白念珠菌、烟曲霉、茄病镰刀菌的特异性引物均有
真菌感染性皮肤肉芽肿病变病原学诊断进展
The progress of etiological diagnosis of dermato-granulomatous lesions caused by fungous infection
张瑞峰1，冉玉平2
ZHANG Rui-feng,RAN Yu-ping
（1.广西皮肤病防治研究所，广西南宁530000；2.四川大学华西医院皮肤性病科，四川成都610041）
[摘要]真菌感染性皮肤肉芽肿病变的诊断大多依据直接镜检、真菌培养、鉴定及组织病理检查，特别在首报病例的诊断中培养和组织病理检查的作用无可替代。免疫组化及以PCR为基础的分子诊断实验技术多见于回顾性诊断报道，尚未广泛应用于临床初诊。皮肤损害并发系统性真菌感染者可用血清学方法辅助诊断。
[关键词]真菌感染；慢性肉芽肿；病原学诊断
[中图分类号]R756[文献标识码]A[文章编号]1000-4963（2012）08-0513-02
收稿日期：2011-07-10；修回日期：2011-09-21
相关实验技术的报道，但尚未见直接将上述特异性引物用于以肉芽肿患者临床标本提取的DNA进行PCR试验并依此做出诊断的报道。另外一些报道中，PCR技术被用作培养菌落的分子鉴定[11-12]。国内也有很多类似应用的报道。
2.2.2原位杂交原位杂交检测技术可以明确肉芽肿病变中病原真菌与组织细胞的相对位置及生长状态，排除污染真菌的干扰。当使用种特异性探针时，可将病原真菌一步鉴定至种，具有高度的灵敏性、准确性和快速性，是非培养法病原学诊断技术之一。但由于所用探针具有特异性，用于检测未知病原真菌可能会出现假阴性；在真菌感染性皮肤肉芽肿病变中，针对曲霉、镰刀菌[13]、马尔尼菲青霉[14]、白念珠菌、热带念珠菌[15]、新生隐球菌等的原位杂交技术均有相关报道。但以原位杂交技术诊断真菌感染性皮肤肉芽肿初诊患者尚未见相关报道。部分原因是因为患者的病原真菌来源广泛，而可供方便使用的原位杂交探针有限。
2.2.3显微切割联合PCR技术显微切割技术避免了污染菌的干扰，提高了PCR检测结果的针对性。显微切割联合PCR技术是应用于真菌感染性皮肤肉芽肿病变病原学诊断的一种有应用前景的新技术。其缺点是如果组织病理切片中未发现病原菌则无法实行。赵作涛等[16]报告1例肝移植后播散性隐球菌病患者，出现鼻部、躯干四肢结节破溃皮损；将皮损组织病理切片中的菌体切割采集，提取DNA后做PCR扩增并测序。鉴定结果与培养菌落分子鉴定结果一致，为新生隐球菌grubii变种。
3血清学检查
检测真菌抗原的方法主要有：新生隐球菌循环荚膜抗原测定、真菌1.3-β-D葡聚糖试验（G试验）、半乳甘露聚糖试验（GM试验）、甘露聚糖检测等。真菌抗原检测方法多用于侵袭性真菌感染的早期诊断。检测机体血清中抗体的方法有一定滞后性和由交叉抗原引起的假阳性，可用于检测申克孢子丝菌、着色真菌、马尔尼菲青霉、荚膜组织胞浆菌等。原发性皮肤真菌感染性肉芽肿尚未见依据血清学实验诊断的报道。皮肤真菌感染性损害作为系统性真菌感染的皮肤表现时，血清学试验有较大参考意义[16-17]。
4各种方法的综合应用
直接镜检和真菌培养可检测真菌是否存在，组织病理检查可在形态上明确病原体与机体的相互作用。这3类方法是检查肉芽肿病变内病原真菌的基本手段，特别在首报病例的诊断中其作用无可替代。真菌培养、组织病理检查与分子、血清学技术结合应用能作出更加可靠的诊断[9，18]。
真菌感染性皮肤肉芽肿病变的病原学诊断对临床及学科发展均具有重要意义。传统的直接镜检、培养鉴定、组织病理方法目前在临床工作中仍占重要地位，特别在少见、新发、特殊致病菌的诊断方面发挥不可替代的作用，结合PCR技术、显微切割加PCR技术可有效认定新致病菌种。对病原真菌蛋白表达及分子特征的进一步研究是开发特异性抗体标记、DNA探针、PCR引物、基因芯片的前提。免疫组化、原位杂交、血清学等技术是快速诊断真菌感染的重要技术，目前与临床应用需求还有一定距离。在临床科研工作中，可以综合应用多种方法并互相验证。
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真菌感染性皮肤肉芽肿病变病原学诊断进展
作者：张瑞峰， 冉玉平， ZHANG Rui-feng， RAN Yu-ping
作者单位：张瑞峰,ZHANG Rui-feng(广西皮肤病防治研究所,广西,南宁,530000)， 冉玉平,RAN Yu-ping(四川大学华西医院皮肤性病科,四川,成都,610041)
刊名：
临床皮肤科杂志
英文刊名：JOURNAL OF CLINICAL DERMATOLOGY
年，卷(期)：2012,41(8)
参考文献(18条)
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引用本文格式：张瑞峰.冉玉平.ZHANG Rui-feng.RAN Yu-ping真菌感染性皮肤肉芽肿病变病原学诊断进展[期刊论文]-临床皮肤科杂志 2012(8)