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人胎盘绒毛膜来源间充质干细胞的生物学特性

中国组织工程研究与临床康复
第 15 卷第 10 期 2011–03–05 出版
March 5, 2011 Vol.15, No.10
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research
人胎盘绒毛膜来源间充质干细胞的生物学特性*★◆
张睿婷1，韩之波2 3，王涛4，孟磊2 3，刘志鹏1，李奎4，及月茹3，杨洲鑫3，李扬秋1，韩忠朝1
，，，2，3
Biological characteristics of human chorionic-derived mesenchymal stem cells
Zhang Rui-ting1, Han Zhi-bo2, 3, Wang Tao4, Meng Lei2, 3, Liu Zhi-peng1, Li Kui4, Ji Yue-ru3, Yang Zhou-xin3, Li Yang-qiu1, Han Zhong-chao1, 2, 3
Abstract
BACKGROUND: Bone marrow is major source of mesenchymal stem cells (MSCs), but the quantity and quality of MSCs in bone marrow have been shown to be gradually reduced with the increase of age. Therefore, it’s very important to find a new source of stem cells. OBJECTIVE: To study a new source of MSCs isolated from human chorionic villous and to study its biological characteristics. METHODS: Umbilical cord and amniotic membrane were isolated from clean placenta; the remaining placenta tissue underwent primary culture and subculture. Tandem repetitive sequence (TRS) analysis was used to detect whether the MSCs obtained from placenta is chorionic villous original. Cell growth pattern was detected by MTT assay. Flow cytometry was applied to analyze cell phenotype and stem cell markers. The different differential medium was used to detect its multi-directional differentiation ability. The immunomodulatory properties of these chorionic-derived cells were evaluated by coculturing the cells with peripheral blood mononuclear cells stimulated by phytohemagglutinin (PHA), and the level of interferon-γ (IFN-γ) was detected by enzyme-labeled immunosorbent assay (ELISA). RESULTS AND CONCLUSION: TRS analysis shows that these chorionic-derived cells are derived from human chorionic. They are adherent cells with typical fibroblast morphology. Flow cytometric analysis reveals that human chorionic-derived cells are consistently positive for MSCs labeled with CD73, CD29, CD44, CD90 and CD105, and negative for the hematopoietic markers CD45, CD11b and CD34. The cells can differentiate into osteoblasts and adipogenesis under different conditioned medium cultured conditions. These results proved that these cells are human chorionic-derived MSCs. The human chorionic-derived MSCs can inhibit peripheral blood mononuclear cell stimulated by PHA to secrete γ-interferon. Zhang RT, Han ZB, Wang T, Meng L, Liu ZP, Li K, Ji YR, Yang ZX, Li YQ, Han ZC. Biological characteristics of human chorionic-derived mesenchymal stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(10): 1823-1826. [https://www.wendangku.net/doc/7114890648.html, https://www.wendangku.net/doc/7114890648.html,]
School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; 2 TEDA Life Science and Technology Research Center, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300457, China; 3State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China; 4Guangzhou Health & Biotech Co., Ltd., Guangzhou 510632, Guangdong Province, China Zhang Rui-ting★, Studying for master’s degree, School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China zhangruiting66@ https://www.wendangku.net/doc/7114890648.html, Correspondence to: Han Zhong-chao, Doctor, Doctoral supervisor, School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong Province, China; TEDA Life Science and Technology Research Center, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300457, China; State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China hanzhongchao@ https://www.wendangku.net/doc/7114890648.html,
1
摘要
背景：骨髓是间充质干细胞的主要来源，但骨髓中间充质干细胞数量和质量会随着年龄的增长而逐渐降低。因此，寻找一种新的干细胞来源具有重要意义。目的：分离研究了一种新的间充质干细胞来源——人绒毛膜来源间充质干细胞，并研究其生物学特性。方法：将胎盘冲洗干净后，分离出脐带和羊膜组织，将剩余的胎盘组织进行原代和传代培养。通过短串联重复序列分析检测细胞是否来源于绒毛膜，用 MTT 法检测细胞生长方式，流式细胞仪分析细胞表型及干细胞标记，使用不同的诱导分化培养基检测其多向分化的能力。将该细胞与植物血凝素刺激的外周血单个核细胞共培养，用酶联免疫吸附试验检测上清 γ-干扰素的水平。结果与结论：短串联重复序列分析证明所得到的细胞来源于绒毛膜，这种绒毛膜来源的细胞生长呈典型的成纤维细胞形态。细胞表达常见的间充质干细胞表面标记 CD90、CD73、CD105、CD44，不表达 CD45，CD11b 和 CD34。同时，细胞也表达 Nestin 和 Sox-2。在不同的条件培养基培养状态下，细胞可向成骨、成脂方向分化。这些结果证明所得到的细胞为人绒毛膜间充质干细胞。这些绒毛膜间充质干细胞能抑制植物血凝素刺激的人外周血单个核细胞分泌 γ-干扰素。可见绒毛膜来源的间充质干细胞具有和传统的骨髓来源间充质干细胞具有相似的生物学特性。关键词：人绒毛膜间充质干细胞；生物学特性；免疫调节；诱导分化；表面标记 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.10.024 张睿婷，韩之波，王涛，孟磊，刘志鹏，李奎，及月茹，杨洲鑫，李扬秋，韩忠朝. 人胎盘绒毛膜来源间充质干细胞的生物学特性[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(10):1823-1826. [https://www.wendangku.net/doc/7114890648.html, https://www.wendangku.net/doc/7114890648.html,]
备受关注。目前研究最多的是骨髓来源间充质 0 引言间充质干细胞是一类能够自我更新，具有多向分化能力的干细胞。其最早是在骨髓中发现，后来经证实，在脂肪、骨膜、滑膜、肌肉、牙髓及脐血等多种组织中都存在这种细胞
[2-5] [1]
干细胞，但是其数量和质量随着年龄的增加而下降，而且骨髓提取干细胞是一个有创过程[6]，这一切都限制了其在组织工程中的运用。有研究表明，脐带及胎盘来源的间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞具有相同的生物学特性，而且，胎盘作为分娩后的废弃物，不存在侵入性的获取过程，且与传统骨髓间充质干细胞相比，具有更强的增殖能力[7]。因此，
。
由于其特殊的生物特性，间充质干细胞在组织工程和自身免疫、移植物抗宿主病等多个方面
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
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张睿婷，等. 人胎盘绒毛膜来源间充质干细胞的生物学特性
Supported by: Guangdong Science and Technology Department, the Cooperation Project in Industry, Education and Research of Guangdong Province and Ministry of Education of P.R. China (The Industrialization Base of Stem Cell of Guangdong Province, No. 2010B091101004) * Received: 2010-11-02 Accepted: 2010-12-06
胎盘来源的间充质干细胞具有更为广阔的应用前景。本实验分离提取人胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞，并研究其生物学特性。 1 材料和方法设计：细胞学体外观察。时间及地点：于2010-02/10在中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心完成。材料：胎盘来源于正常足月剖宫或顺产产妇，由广州汉氏联合生物科技有限公司负责采集，经母血检测HBV、 HCV、 HIV、 CMV、 EBV、梅毒均为阴性。
主要试剂：
试剂及仪器 DMEM/F12 培养基、胰酶来源 Gibco 上海 ExCell Bio 公司天津市标准科技有限公司 Sigma Peprotech 中国医药集团上海化学试剂公司乙醇油红 O 锥虫蓝 CD19-FITC、CD31-FITC、 CD34-FITC、CD11b-PE、 CD29-PE、CD44-PE、 CD45-PE、CD49d-PE、 CD73-PE、CD90-PE、 CD105-PE、CD106-PE、 CD151-PE、HLA-DR-PE、 Sox-2-PE Nestin-PE 人 γ-干扰素 ELISA 试剂盒 RD 公司上海 ExCell Bio 公司天津市化学试剂三厂生工生物工程(上海) 有限公司中国医学科学院血研所科技公司 BD 公司
其同一来源的第4代脐带间充质干细胞各送北京阅微基因技术有限公司进行STR 1×106，分析。
细胞生长曲线的测定：采用MTT法，取生长状
态良好的第4代细胞，常规消化计数后以3×103/ 孔接种于96孔板。 6孔/组，共7块板。置于37 ℃，体积分数为5% CO2饱和湿度培养箱。每日取一组，加MTT和DMSO后酶标仪上以490 nm， 595 nm为测量波长测定吸光度值并且取均数。最后以细胞生长时间为横轴，吸光度均值为纵轴，用GraphPad Prism软件拟合生长曲线。
细胞表型及干细胞标记的测定：选择培养到4
代的细胞，常规消化后，按每个样本2×105细胞分管，使用抗体标记后，用PBS重悬到400 μL。用BD公司FACSCalibur流式细胞分析仪检测。
细胞分化潜能 [7,9-10] ：取培养至3代以上间充
质干细胞，常规消化离心后制成单细胞悬液，按2×104/孔接种于24孔板。待细胞融合达70% 时更换成骨或成脂培养基(Hyclone公司)。然后每3 d换液1次。 d后Von Kossa染色检测成骨 21 情况，油红O染色检测成脂情况。
人外周血单个核细胞分离[12]：取肝素抗凝的健
1
胎牛血清二甲基亚砜地塞米松、IBMX、吲哚美辛、抗坏血酸磷酸盐、β-甘油磷酸胰岛素多聚甲醛
暨南大学医学院，广东省广州市 510632；2 中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心，天津市 300457；3 中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津市 300020；4 广州汉氏联合生物科技有限公司，广东省广州市 511400 张睿婷★，女， 1984 年生，湖南省郴州市人，汉族，暨南大学医学院在读硕士，主要从事成体干细胞方面的研究。 zhangruiting66@ https://www.wendangku.net/doc/7114890648.html, 通讯作者：韩忠朝，博士，博士生导师，暨南大学医学院，广东省广州市 510632；中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心，天津市 300457；中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津市 300020 hanzhongchao@ https://www.wendangku.net/doc/7114890648.html,
中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2011)10-01823-04 收稿日期： 2010-11-02 修回日期： 2010-12-06 (20101102009/M·L)
康人外周静脉血20 mL，用Ficoll密度梯度离心法分离得到人外周血单个核细胞。
绒毛膜间充质干细胞抑制人外周血单个核细胞 γ-干扰素分泌试验：分离的人绒毛膜间充质干细
胞以铯源照射20 Gy，以2×104/孔和5×103/孔两种浓度接种于96孔板。37 ℃，体积分数5% CO2，饱和湿度培养1 h，待细胞贴壁后每孔加入1×105人外周血单个核细胞， μL植物血凝素 2 (10 mg/L)与人绒毛膜间充质干细胞共培养。 72 h后1 600 r/min离心10 min，采集上清。 ELISA检测培养上清中γ-干扰素水平。统计学分析：采用GraphPad Prism软件完成统计处理。用t 检验方法统计。 2 结果绒毛膜来源间充质干细胞的分离培养
实验方法：
细胞的分离和培养
[7-10]
：将胎盘用无菌盐水冲
洗后，小心分离脐带和羊膜组织。将剩余的胎盘组织用无菌组织剪剪成小组织块，使用胶原酶和胰酶消化，消化后的混合液体经200目滤网过滤后接种于细胞培养瓶中，用含体积分数为 10%胎牛血清的DF12培养基于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养，待细胞生长至80% 融合时，胰酶消化细胞，按1∶3传代。
短串联重复序列(short tandem repeat, STR)分析
[11]
2.1
代分离出的细胞体外培养48 h可见贴壁，72 h 换液时可见少量散在分布的细胞集落，见图 1a。细胞呈梭形或多角形，3 d后增长速度加快，呈平行或漩涡状排列，与经典的骨髓来源的间充质干细胞类似。培养5~7 d原代细胞可铺满瓶底80%以上。原代细胞以3 d或4 d传1 代的速原度倍增。多次传代后细胞形态较为均一，见图1b。
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：第1，4代绒毛膜来源间充质干细胞以及
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经流式检测绒毛膜来源间充质干细胞表达基质细胞标记CD90、CD73、CD105，透明质酸盐受体CD44 和整合蛋白家族CD29，而上皮细胞标记CD31、造血细胞标记CD45、CD34和CD11b、HLA-DR 则为阴性。此外，绒毛膜来源间充质干细胞还表达某些多潜能转录因子，如Sox-2、Nestin。
a: Adherent cells in primary culture, spindle or polygonal cells scattered in the colony
2.5
b: Passage 4 cells, cell morphology uniformity, arranged in parallel or whirlpool
人绒毛膜间充质干细胞的分化潜能
成脂诱导的
细胞连续培养7 d，镜下可见细胞内有微小脂滴出现，随着时间的延长，脂滴逐渐增大融合，培养2周时，可见融合成团的脂滴充满整个细胞，经油红O染色可见被染成红色的脂滴，见图4a。成骨诱导后培养2周以上，细胞基质矿化物逐渐出现，形成多层小结结构，培养4 周以上，可见明显钙化结节，经Von Kossa染色后可见黑色钙质沉积，见图4b。
Figure 1
The morphology of human chorionic -derived mesenchymal stem cells (×40) 图 1 人绒毛膜间充质干细胞的形态(×40)
2.2 2.3
STR分析
通过检测发现所分离得到的细胞与其细胞的平均倍
同一来源的脐带间充质干细胞有相同的STR。人绒毛膜间充质干细胞生长曲线增时间为42.2 h(n=3)。生长曲线见图2。
0.5 0.4 Absorption 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Time (d)
a: Adipocytes stained by oil red O (×100)
b: Osteoblasts detected by Von Kossa (×40)
Figure 4 图4
Induced differentiation of human chorionic-derived mesenchymal stem cells 胎盘绒毛膜间充质干细胞的诱导分化
Figure 2 图2
The growth curve of human chorionic-derived mesenchymal stem cells 人绒毛膜间充质干细胞的生长曲线
2.6
人绒毛膜间充质干细胞抑制人外周血单个核细胞与未加入人绒毛膜间充质干细胞的人
γ-干扰素的分泌
2.4 人绒毛膜间充质干细胞的表面标记见图3。
外周血单个核细胞相比，加入 1∶20 和 1∶5 的人绒毛膜间充质干细胞均能显著抑制植物血凝素刺激的外周血单个核细胞分泌 γ-干扰素，加不同比例人绒毛膜间充质干细胞的两组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。
2 500 IPN-γ (ng/L) 2 000 1 500 1 000 500 0 PBMC MSC:PBMC 1:20 MSC:PBMC 1:5 a a
a
P < 0.05, vs. Human peripheral blood mononuclear cell
Figure 5 Secretion of interferon-γ in supernatant in each group 图 5 各组培养上清 γ-干扰素分泌情况
Figure 3
The phenotype and stem cell markers of human chorionic-derived mesenchymal stem cells 图 3 人绒毛膜间充质干细胞表型及干细胞标记
3
讨论胎盘作为一个新的获取间充质干细胞来源，与骨髓
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相比，具有来源充足、免疫原性低、病毒污染率较低，且无社会伦理争议等方面的优点。 Fukuchi等[9]从成熟胎盘小叶中得到间充质干细胞，可表达数种干细胞标志性基因及组织特异性基因。 Bailo等[10]从成熟胎盘的羊膜及绒毛膜分离出间充质干细胞样细胞，体外扩增后成功植入新生大鼠和猪体内，未见任何不良反应。 STR分析技术是目前常用于检测细胞系交叉污染，也可以区分不同个体， 16基因座的系统配对概率可以达到1/10 。在本次实验中，利用贴壁法成功的从人类胎盘组织中分离出贴壁细胞，由于胎盘组织包括来源于胎儿的羊膜、绒毛膜以及来源于母体的底蜕膜。用同一胎儿来源的脐带间充质干细胞做对照，证实分离得到的细胞来源于胎儿绒毛膜。考虑到国际上对于间充质干细胞的鉴定仍具争议，实验采用了目前认可度较高的ISCT(国际细胞治疗协会) 间充质干细胞委员会制定的一系列标准
[13] 17
[5] [6]
[7]
[8]
[9] [10] [11]
。流式细胞仪
分析鉴定显示，细胞表达黏附分子和基质细胞标记 CD73、CD90、CD105，整合蛋白家族CD29，以及透明质酸盐受体CD44，不表达造血细胞标记CD11b、CD34、 CD45和HLA-DR。不仅如此，一些神经干细胞标记如 Sox-2、Nestin也可见表达。在分离和培养后的细胞定向诱导成骨细胞和脂肪细胞时，成骨细胞能分泌碱性磷酸酶，并且形成钙结节，油红O染色后可见到细胞的胞浆中充满了大小不等的脂滴。以上的实验结果均证明，从胎盘绒毛膜分离得到可传代和具有多向分化能力的间充质干细胞。并且所得细胞传代稳定，细胞较为均一，数量丰富，能够作为一种大量扩增的新的间充质干细胞种群。很多体外实验证实，间充质干细胞能抑制T细胞的增殖，抑制外周血单个核细胞γ-干扰素的分泌[14-15]。实验选择人绒毛膜间充质干细胞与人外周血单个核细胞共同培养后检测其上清中的γ-干扰素含量来检测其免疫调节作用。结果显示，经体外扩增的人绒毛膜间充质干细胞与人外周血单个核细胞共同培养后，能明显抑制外周血单个核细胞γ-干扰素的分泌，并且在人绒毛膜间充质干细胞∶人外周血单个核细胞为1∶20时其抑制效果也未见明显减低。作者认为可能在1∶20已经达到最大抑制效果所致，对于最佳抑制浓度比，今后可以做更进一步的研究。实验从人类胎盘成功分离出大量间充质干细胞，并且证明为绒毛膜胎儿来源间充质干细胞，表达多种干细胞表型，具有多向诱导分化和增殖潜能。实验对于进一步研究胎盘绒毛膜来源的间充质干细胞具有重要意义，并且有可能作为组织工程中理想的种子细胞。 4 参考文献
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来自本文课题的更多信息-基金资助：课题受广东省科技厅省部产学研结合示范基
地项目(广东省干细胞产业化基地，项目编号： 2010B091101004)支持。
作者贡献：实验设计为第一、二、十作者，实验实施为
第一、二、三、四、五作者，实验评估为第七、八作者，资料收集为第六作者。第一、二作者成文，第九、十作者审校，所有作者对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济
组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理批准：本文所有血样及标本，供者均完全知情同意
用于实验研究。
本文创新性：第一作者于 2010-08 检索 Pubmed 数据
库和 CNKI(清华同方)中国期刊全文数据库，检索关键词： Human placenta; Chorion; Mesenchymal stromal cells 和人绒毛膜间充质干细胞；生物学特性；免疫调节。与国内外同类型研究相比，本课题首次引入了 STR 基因微卫星分析技术用以鉴定间充质干细胞的来源，并且将绒毛膜间充质干细胞与人类单个核细胞共培养后，检测上清 γ-干扰素的含量初步研究了其免疫调节作用。
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110004
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脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定【摘要】目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞，接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后，进行细胞形态学观察，绘制细胞生长曲线，分析细胞周期，检测细胞表面抗原。结果采用Percoll(1.073 g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀，梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期，至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%～70%细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定，可作为组织工程的种子细胞。【关键词】脐血;间充质干细胞;细胞周期;免疫细胞化学 Abstract: Objective Isolation and cultivation of mesenchymal stem cells (MSCs) in human umbilical cord in vitro, and determine their biological properties. Methods The mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from human umbilical cord blood in sterile condition, and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After the adherent mononuclear cells were obtained, the shape of cells were observed by microscope, then the cell growth curve, the cell cycle and the cell surface antigens were obtained by immunocytochemistry and flow cytometry methods. Results MSCs obtained by Percoll (1.073 g/mL) were similar in size, spindle-shaped or star-shaped fibroblasts-liked cells. Cell growth curve analysis indicated that MSCs were in the exponential stage after 5d and in the stationary stages after 9d. Flow cytometry analysis showed that the CD29 and CD44 positive cells were about 50%～70%. Conclusions The human umbilical cord derived mesenchymal stem cells were grown stably in vitro and can be used as the seed-cells in tissue engineering. Key words:human umbilical cord blood; mesenchymal stem cells; cell cycle; immunocytochemistry 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞来源。寻找来源丰富并不受伦理学制约的间充质干细胞成为近年来的研究热点[1]。脐血(umbilical cord blood, UCB)在胚胎娩出后，与胎盘一起存在的医疗废物。与骨髓相比，UCB来源更丰富，取材方便，具有肿瘤和微生物污染机会少等优点。有人认为脐血中也存在间充质干细胞(Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)。如果从脐血中培养出MSCs，与胚胎干细胞相比，应用和研究则不受伦理的制约，蕴藏着巨大的临床应用价值[2,3]。本研究将探讨人UCB-MSCs体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面，分析UCB-MSCs 作为间充质干细胞来源的可行性。

脐带间充质干细胞综述(转)

脐带间充质干细胞概述医学实验班70080103 王雪彤脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构,其外被羊膜,内含2条脐动脉、1条脐静脉,在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织———华尔通氏胶(Whartonps Jelly) ,从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 。 1人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的形貌分析: 倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长, 为形态相对均一的梭形细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长,低密度时较扁平, 密度增加趋于融合时细胞变细长。扫描电镜下观察呈长条状纤维样, 细胞膜表面不光滑, 有小结节状物, 细胞无明显突起,细胞间无网络状连接。透射电镜观察核大, 不规则, 核仁明显, 常染色质多, 异染色质少, 胞浆少。胞质内细胞器较少, 以粗面内质网和线粒体为主, 内有大量游离核糖体, 部分细胞可见内质网肿胀。 ——植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(×200) 例如三代细胞的形态学特征——人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1，2；并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3；细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。图1图

2图3 图4 2人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的生物学特性： HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞,是别于两者之间的一类新的多能间充质细胞,它们之间既有联系又有差异。根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会( the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the Internation2 al Society for Cellular Therapy)制定的最低标准, 脐带间充质干细胞（MSCs）需满足以下条件: 1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长; 2 )MSCs表达CD105, CD73和CD90,不表达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA2DR; 3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。和其他来源的 MSCs一样HUMSCs呈长条梭形贴壁生长,表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44 及HLA2ABC ,不表达CD34、CD45、CD31等造血干细胞标记或CD33、CD14、CD56及HLA2DR、2DA、2DP、2DQ ,体外诱导培养能向多种成体细胞分化。比照这些条件,表明华尔通氏胶来源的间质细胞具有MSCs特性。HUMSCs还表达原始干细胞标记,如白血病抑制因子受体通路、胚胎干细胞特异基因Ⅰ及端粒逆转录酶及Nanog、STAT3、AP、Oct24、BMP4、PAX6、ADAM12、Nestin、HLA2Ⅰ。另外, HUMSCs低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40 和CD40 l等。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制,并抑制T细胞的增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性,表明其为一类免疫缺陷细胞,异基因移植不会发生免疫排斥反应。 3脐带间充质干细胞(UMSCs)的移植治疗作用: 骨髓MSCs用于改善心、脑功能的机制主要在于其分泌SDF一1和VEGF 等局部细胞因子, 诱导微血管的生成, 改善缺血组织微环境。UMSCs表达SDF 一1和VEGF, 提示了UMSCs治疗心脑梗塞、脊髓损伤的可能。 1)UMSCs对脑损伤的治疗作用外源性UMSCs对脑组织的修复机理可能涉及到诱导内源性VEGF表达, 局部微血管增生, 抑制细胞凋亡等。利用液压冲击脑损伤模型, 证明

间充质干细胞在人胎盘组织中的染色定位

间充质干细胞在人胎盘组织中的染色定位本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！【摘要】目的探索间充质干细胞(mscs)在人胎盘组织中的分布规律。方法取正常剖宫产之足月健康产妇的新鲜胎盘组织,按中央带、中间带、边缘带、绒毛板层、中间层和基底板层分为9组:aa、ab、ac、ba、bb、bc、ca、cb、cc。连续切片,以抗cd166、抗cd44、抗cd29分别做免疫荧光和免疫组化染色。显微镜下观察阳性细胞分布区域,采用彩色病理图像分析系统进行图像分析。结果cd166、cd44、cd29阳性表达细胞的分布情况较一致,主要集中于血管内皮下及血管附近间质内。胎盘中央带中间层(ab)阳性细胞较集中,阳性表达的强度较强,其od值与其它组差异有统计学意义(p伦理委员会批准,获取临床正常剖宫产之足月健康产妇的新鲜胎盘组织,所选择的胎盘脐带附着点均在胎盘中央或稍偏位,大小及重量在正常范围内。方法分组将胎盘组织分为中央带即脐带附着处(a)、

边缘带即距脐带附着点最远处(c)和中间带即两者之间中点处(b)3大组,每组从胎儿面向母体面再分为绒毛板层(a)、中间层(b)和底板层(c)3小组。冰冻切片取aa、ab、ac、ba、bb、bc、ca、cb、cc 9处新鲜组织,大小为1cm×1cm×,以oct包埋于冻台上,速冻后切5μm薄片,贴附于载玻片。石蜡切片取前述9处组织,大小为1cm×1cm×,中性福尔马林液中固定24h,梯度酒精溶液脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋后切5μm薄片,贴附于涂布多聚赖氨酸的玻片。染色免疫组化染色(sabc法) 切片置60℃烘箱内过夜,取出后以二甲苯脱蜡,梯度酒精洗去二甲苯、水化,pbs 冲洗3min×3次,置枸橼酸钠溶液中微波加热以修复抗原,自然冷却后以pbs冲洗3min×3次,滴加抗体(cd29、cd44,阴性对照滴加pbs),室温1h,pbs冲洗3min×3次,滴加免疫反应增效剂,dab显色3～10min,充分水洗,苏木素复染5s,盐酸酒精分化1s,流水促蓝,梯度酒精脱水,二甲苯透明后以中性树胶封片,置显微镜下观察。免疫荧光染色将冰冻切片稍稍风干后即滴加ι抗(cd166,浓度为1∶400,阴性对照滴加pbs),置37℃水浴箱中1h,pbs冲洗3min×3次,洗去多余抗体,滴加fitc

脐带干细胞综述

脐带间充质干细胞的研究进展间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC S ）是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞[1-5]，MSC S 由于它的自我更新和多项分化潜能，而具有巨大的治疗价值 ,日益受到关注。MSC S 有以下特点：(1)多向分化潜能，在适当的诱导条件下可分化为肌细胞[2]、成骨细胞[3、4]、脂肪细胞、神经细胞[9]、肝细胞[6]、心肌细胞[10]和表皮细胞[11, 12]；(2)通过分泌可溶性因子和转分化促进创面愈合；(3) 免疫调控功能，骨髓源（bone marrow ）MSC S 表达MHC-I类分子，不表达MHC-II 类分子，不表达CD80、CD86、CD40等协同刺激分子，体外抑制混合淋巴细胞反应，体内诱导免疫耐受[11, 15]，在预防和治疗移植物抗宿主病、诱导器官移植免疫耐受等领域有较好的应用前景；(4)连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程和细胞替代治疗。1974年Friedenstein [16] 首先证明了骨髓中存在MSC S ，以后的研究证明MSC S 不仅存在于骨髓中，也存在于其他一些组织与器官的间质中：如外周血[17]，脐血[5]，松质骨[1, 18]，脂肪组织[1]，滑膜[18]和脐带。在所有这些来源中，脐血(umbilical cord blood)和脐带(umbilical cord)是MSC S 最理想的来源，因为它们可以通过非侵入性手段容易获得，并且病毒污染的风险低，还可冷冻保存后行自体移植。然而，脐血MSC的培养成功率不高[19, 23-24]，Shetty 的研究认为只有6%，而脐带MSC的培养成功率可达100%[25]。另外从脐血中分离MSC S ，就浪费了其中的造血干/祖细胞(hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells,HSCs/HPCs) [26, 27]，因此，脐带MSC S (umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC S )就成为重要来源。一．概述人脐带约40 g, 它的长度约60–65 cm, 足月脐带的平均直径约1.5 cm[28, 29]。脐带被覆着鳞状上皮，叫脐带上皮，是单层或复层结构，这层上皮由羊膜延续过来[30, 31]。脐带的内部是两根动脉和一根静脉，血管之间是粘液样的结缔组织，叫做沃顿胶质，充当血管外膜的功能。脐带中无毛细血管和淋巴系统。沃顿胶质的网状系统是糖蛋白微纤维和胶原纤维。沃顿胶质中最多的葡萄糖胺聚糖是透明质酸，它是包绕在成纤维样细胞和胶原纤维周围的并维持脐带形状的水合凝胶，使脐带免受挤压。沃顿胶质的基质细胞是成纤维样细胞[32]，这种中间丝蛋白表达于间充质来源的细胞如成纤维细胞的，而不表达于平滑肌细胞。共表达波形蛋白和索蛋白提示这些细胞本质上肌纤维母细胞。脐带基质细胞也是一种具有多能干细胞特点的细胞，具有多项分化潜能，其形态和生物学特点与骨髓源性MSC S 相似[5, 20, 21, 38, 46]，但脐带MSC S 更原始，是介于成体干细胞和胚胎干细胞之间的一种干细胞，表达Oct-4, Sox-2和Nanog等多

脐带血间充质干细胞体外分离_纯化及培养

脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养陈镭1,惠国桢2,栾文忠1,苗宗宁3,王玲3,陆华3,吴智远2,芦奕2 (1.天津医科大学,天津,300070; 2.江苏省无锡市第三人民医院细胞实验室,江苏无锡,214019; 3.苏大学附属第一医院神经外科,江苏苏州,215006) 摘要:目的研究脐带血(HUCB)中含有的间充质干细胞(M S Cs)体外分离、纯化及培养条件,探究其作为种子细胞应用于实验和临床的可行性。方法无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esen cult T M 作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层,用流式细胞仪检测M SCs 表面抗原。结果来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达M SCs 相关的抗原(CD 29、CD 44、CD 166),但不表达造血细胞抗原(CD 34、CD 45),这与源于骨髓的M SCs 一致。结论脐带血来源的M SCs 能在体外培养、扩增,而用于满足实验和临床的需要。关键词:脐带血;间充质干细胞;体外培养中图分类号:R 329 2 文献标识码:A 文章编号:1672 2353(2004)01 0012 03 THE ISOLATION PURIFICATION AND CULTURE OF HUCA MSCs CHEN Lei,HUI Guo zen,RUAN Wen zong,MIAO Zong ning,WANG Ling, LU HUA,W U Zhi yuan,LU Li (1.T ianj in M edical Univer sity ,T ianj in,300070;2.Cell Dep ar tment,T hir d H osp ital of W ux i ,W ux i ,Jiangsu ,2140001;3.Dep ar tment of Neurosur gery ,First A f f iliated H osp ital of Suz hou University ,Suz hou,Jiangsu ,215006) ABSTRAC T Objective:To investig ate the isolation,purification and culture of hum an umbil ical cord blood(HUCB)mesenchymal stem cells(M SCs)in vitro,and to observe the feasibility of using M SCs as seed cells in experiment and clinic.Methods:HUCB w ere collected from full term deliveries scheduled for cesarean section,all specimens w as obtained sterilely w ith preservative free heparin,the cord blood mononuclear cell w as isolated by lymphocyte separation medium,and puri fied and culture with M esencult T M medium and acidic environment to produce adherent layer,the surface antig en ex pression of MSCs was detected by flow cytometry.Results:The UCB derived mononuclear cells,when set in culture,gave rise to adherent cells,w hich ex hibited either an osteo clast or mesenchym al like phenoty pe,cells w ith the M SCs displayed a fibroblast like morpholog y and ex pressed several MSCs related antigens (CD 29,CD 44,CD 166),but did not ex press haematopoi etic cells antigens(CD 34,CD 45),which w as identical to human bone marrow derived M SCs.C on clusion:M SCs in H UCB can culture and expand in vitro,which could be regarded as an alternative source of MSCs for experimental and clinical needs. KEY WORDS umbilical cord blood;mesenchymal stem cells;culture in v itro 脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞和间充质干细胞(mesenchy mal stem 收稿日期:2003-12-16 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271325)、江苏省自然科学基金资助项目(BK2001170)作者简介:陈镭(1965-),男,天津市人,在读博士研究生。 12 实用临床医药杂志 Journal of Clinical M edicine in Practice 2004年第8卷第1期

干细胞生物特性及其应用

子抗体相关性研究[J ]1中国男科学杂志,2006,20(2):57～591 [7]　Berger RE 1Eti ol ogy manifestati ons ang therapy of therapy of acute ep i 2 didy m itis:Pr os pective study of 50cases [J ]1J U r ol ogy,1979,750:754～7611 [8]　Hales RB ,D ie mer T,Hales KH 1Role of cyt okine in tesicular functi on [J ]1Endocrine,1999,10(1):201～2071 [9]　朱应武,卢芳国,伍参荣等1解脲脲原体感染对精子质量的影响 [J ]1实用预防医学,2003,12(10):931～9331 [10]史海军,常永超1支原体感染与男性不育症患者精液质量状况分析[J ]1中国皮肤性病学杂志,2005,19(6):358～3591 [11]Nunez CR,Caballer o P,Redondo C,et al 1U reap las ma U realyticum re 2 duces motility and induces me mbrane alterati ons in human s per mat o 2z oa [J ]1Hum Rep r od,1998,13(10):2756～27611 [12]林成楚,许恩赐,汪志伟等1解脲脲原体感染与精子凋亡的关系 [J ]1中国人兽共患病杂志,2005,21(4):3661 [13]ZiniA,FischerMA,Sharir S,et al 1Prevalence of abnor mal s per m P NA denaturati on in fertile and infertile men [J ]1U r ol ogy,2002,60(6):1069～72 [14]徐　晨1解脲支原体引起男性不育的机理研究I 1精子形态学观察[J ]1男性学杂志,1992,6(2):661 [15]徐　晨,王一飞1支原体与男性不育的研究进展[J ]1男性学杂志,1992,6(1):541 [16]石建莉,鲁梅格,王一飞1溶脲脲原体与人精子膜蛋白交叉反应性抗原的研究[J ]1生殖与避孕,2003,23(3):153～1571 [17]Desil Va 1Patticja A Q 1Localizati on of endogenous activity of phos pho 2 li pases A and C in ureap las ma urealyticum [J ]1Jchn M icr obi ol,1991,29:14981 [18]胡　涛,王海燕,高美华1沙眼衣原体、溶脲脲原体感染致精浆 T NF 2a,Il 26升高在男女不育发病中的意义[J ]1生殖与避孕,1999,19(2):80～841 [19]王光荣,周曾娣,郭争鸣1精子凋亡与男性不育关系的初探[J ]1 中华男科学,2002,8(1):25～271 [20]Dousset B,Hussenet F 1Cyt olines in the human se men 1A ne w ap 2 p r oach t o male fertility [J ]1Presse Med,1997,26(1):24～291[21]Forrest VJ,Kang YH,Mcclain DE,et al .Oxidative stress 2induced ap 2 op t osis p revented by Tr ol ox [J ]1Free Radic B i olMed,1994,16(6):675～6841 [22]Halli w ell B,Gutteridge Jm,Role of free radicals and cataiytic metal 2 li ons in human disease:an overvie w methods [J ]1Enzy mol ogy,1990,186(1):1～31 [23]杨　欣,王　琦1溶脲脲原体感染与精液不液化症的相关性研究 [J ]1中国男科学杂志,1998,12(4):222～2241 [24]逯　越,陈国卫1解脲脲原体感染对附睾上皮分泌功能影响的研究[J ]1解剖学研究,2003,25(4):277～2781 [25]马春杰,唐立新,蒋　敏1供精者解脲脲原体感染与精液参数的相关性研究[J ]1广东医学,2006,27(1):59～611 [26]W ang Y,L iang CL,W u JQ,et al 1Do U reap las ma urealyticum infec 2 ti ons in the genital tract affect se men quality [J ].A sian J Andr ol,2006,8(5):562～568. [27]ReichartM,Levi B ,Kahane I,et al 1Dual energy metabotis m 2depend 2 ent effect of ureap las ma urealyticum infecti on on s per m activity [J ]1J Andr ol,2001,22(3):404～4121 (收稿日期:2008210206) 作者简介:余文静,泸州医学院2006级研究生 △　通讯作者:李著华(指导老师) 干细胞生物特性及其应用余文静　综述,李著华△ 　审校(泸州医学院病理生理教研室,四川泸州646000) 【摘要】　近年来人们对干细胞的认识逐渐增加,当知道干细胞具有独特的分化潜能,能治愈组织难以自愈的创伤,能治疗临床上难以治愈的疾病,甚至可以使人返老还童,让青春永驻时,人们便开始企盼着干细胞时代的到来。本文就干细胞近年来在其生物学特性及应用方面进展做一综述。【关键词】　干细胞;生物特性;应用【中图分类号】　R 392-33 【文献标识码】　A 【文章编号】　167227193(2009)0120094203 近年来人们对干细胞的认识逐渐增加,当知道干细胞具有独特的分化潜能,能治愈组织难以自愈的创伤,能治疗临床上难以治愈的疾病,甚至可以使人返老还童,让青春永驻时,人们便开始企盼着于细胞时代的到来。本文就干细胞近年来在其生物学特性及应用方面进展做一综述。 1　干细胞的概念干细胞是一种具有自我复制功能和多分化潜能的早期未分化细胞,医学界称之为“万用细胞”。按照干细胞的分化潜能,分化层次及其所具有的功能,大致可分为三种类型:胚胎干细胞、组织干细胞和专能干细胞。胚胎干细胞又称全能干细胞,是从哺乳动物包括人的早期胚胎分离培养出来的。其分化潜能大、增殖能力强,既是胚胎发育的基础,又是机体各种细胞最早的祖先,由它可形成完整的生物个体,如早期的卵裂球细胞、胚泡中的内细胞群中的细胞、早期生殖嵴的胚芽细胞等。从某种意义上说受精卵也可视为特殊的全能干细胞。胚胎干 ? 49?

人脐带间充质干细胞操作规范

人脐带间充质干细胞操作规范一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min; 2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1# 培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min; 5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿); 6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿; 7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动); 11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25% 胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min; 13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即得到P0代脐带间充质干细胞;

胎盘间充质干细胞的分离和培养

胎盘间充质干细胞得分离,原代与继代培养及鉴定刘亭 2016、7。21 目录前言 (2) 1分离制备PMSC组织得选取 (3) 2脐带,胎盘MSC得分离与纯化 (5) 2、1胎盘组织得获取,存储与清洗 (5) 2—2 脐带,胎盘MSC得分离及纯化方法 (6) 3 原代培养与继代培养 (10) 3-1培养基 (10) 3-2培养密度 (11) 3—3培养条件 (11) 3—4换液 (11) 3-5 传代培养 (12) 3-6细胞形态与生长速度 (12) 3-7 MSC得冻存与复苏: (12) 4细胞表面抗原检测 (13) 5生长曲线 (13) 6细胞周期 (13) 7分化潜能 (13) 参考文献 (13) 附件1不同实验室从脐带血,脐带与胎盘等各组织中分离MSC得方法 (15) 脐带血 (15) 脐带 (15) 羊膜 (17) 绒毛膜 (18) 蜕膜层 (18) 胎盘 (19) 整体灌注法 (20) 附件2 背景知识 (20) 附件3 PMSC实验所需试剂 (21)

前言干细胞(Stem cell,SC)就是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或两个以上其它品系得细胞。在一定得条件下,干细胞能够分化成为多种成熟细胞类型。按照来源与分化潜能不同,干细胞可分为胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)与成体干细胞(Adult stem cell,ASC)两类。胚胎干细胞来源于早期得胚泡与胚胎内层得细胞群,并且具有向3个胚层细胞分化得能力。但就是胚胎干细胞应用时产生得免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及得伦理问题等影响并制约了临床应用。成体干细胞形成于原肠胚形成后得胎儿与成体组织,早期研究认为,成体干细胞主要分化为其来源组织得细胞类型。然而,近几年来得很多研究表明,成体干细胞具有能够分化成为除来源以外得其她胚层组织得能力。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)又称为基质干细胞,就是属于成体干细胞得一种,最早从骨髓中分离而来、MSC就是由早期中胚层发育而来得非造血成体干细胞,该细胞在体外可以贴壁生长,并呈现梭状。胞质丰富,细胞核呈圆形,1-3个核仁、在适当得条件下可以大量扩增,并转化为间充质祖细胞,进而分化成包括三个胚层得各种组织细胞,如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等。 MSC具有低得免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节与造血支持等功能,而且易于外源基因导入表达,就是基因治疗中重要得载体细胞。此外,一些研究学者还发现,MSC具有类似免疫抑制剂作用,可抑制T淋巴细胞在混合淋巴细胞中得免疫反应,并同时抑制T细胞得异基因增殖反应、所以,MSC在治疗组织缺损、器官退行性疾病、肿瘤及免疫疾病具有相当广泛得应用前景。近年来MSC已逐步成为干细胞研究得热点(张慧娟等,2014)、目前所报道得间充质干细胞主要来源于骨髓,采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便,但供者取骨髓需要经历一个比较痛苦得手术,并在取材过程中及取材后会有很高得感染机会;由于人体骨髓中间充质干细胞得含量极其稀少,每105-106个单个核细胞中大约只有1个;而且随着年龄得增加,骨髓中间充质干细胞得数量、增殖与分化能力均显著下降,使其在研究与应用尤其就是临床应用中受到限制。其她组织中,如动员得外周血、乳牙、脐带、脐血也存在间充质干细胞,然而,从这些组织中获得得细胞数量较为有限。以上因素,都限制了间充质干细胞

人脐血间充质干细胞来源的外泌体_分离鉴定及生物学特性_张娟

中国组织工程研究第18卷第37期 2014–09–03出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5955www.CRTER .org 张娟，女，1988年生，河北省玉田县人，汉族，内蒙古医科大学免疫学在读硕士，医师，主要从事干细胞的基础与临床应用研究。通讯作者：王彩生，硕士，主任医师，内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031 并列通讯作者：魏来，博士，教授，北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.37.009 [https://www.wendangku.net/doc/7114890648.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)37-05955-06 稿件接受：2014-07-31 Zhang Juan, Studying for master’s degree, Physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wang Cai-sheng, Master, Chief physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wei Lai, M.D., Professor, Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China Accepted: 2014-07-31 人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性张娟1，刘峰2，张薇2，丛旭2，王彩生1， 3，魏来2(1内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；2北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044；3呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031) 文章亮点： 1 研究发现间充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细胞间进行信息传递，进而通过某种机制发挥组织损伤修复作用。外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，含有来源细胞的膜蛋白成分，可以选择性地将含有的蛋白质、RNA 等递送至受体细胞，调节细胞间的信号传导。故可将间充质干细胞来源的外泌体开发成为一种既具有间充质干细胞的作用特点，又能规避其不良分化和肿瘤形成缺陷的新型治疗手段。因此，通过间充质干细胞来源的外泌体促进组织损伤修复是今后具有重要探讨价值的研究方向。 2 分离提取及鉴定外泌体是进行深入研究的基础，实验主要通过超滤及差速离心法分离出外泌体，通过透射电镜及流式鉴定相结合来鉴定，为后续的外泌体功能研究奠定基础。 3偏倚或不足：人脐血间充质干细胞源性外泌体生物学功能及相关机制还需要进一步分析；人脐血间充质干细胞的外泌体最终要移入体内研究，所以尚需建立动物模型。关键词：干细胞；脐带脐血干细胞；外泌体；人脐血间充质干细胞；分离鉴定；活性主题词：胎血；间质干细胞；外泌体；膜蛋白质类摘要背景：外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，越来越多的研究表明，间充质干细胞可能通过旁分泌外泌体而发挥对组织损伤的修复作用，目前人脐血间充质干细胞来源的外泌体分离鉴定尚未见报道。目的：分离纯化人脐血间充质干细胞来源的外泌体，并鉴定其生物学特性。方法：收集人脐血间充质干细胞培养上清，采用超滤及梯度离心法分离并纯化外泌体，通过透射电镜观察其形态，流式细胞术检测其表面标志 CD63、CD81、CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。结果与结论：人脐血来源的间充质干细胞能够分泌外泌体，电镜下呈椭圆或碟状的囊泡结构，直径40-100 nm 。外泌体表达其共性表达标志CD63、CD81及间充质干细胞表面黏附分子CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。结果表明采用超滤及梯度离心法可以成功从间充质干细胞培养上清中分离纯化外泌体，间充质干细胞分泌的外泌体具有外泌体的胞膜蛋白组分。张娟，刘峰，张薇，丛旭，王彩生，魏来. 人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性[J].中国组织工程研究，2014，18(37):5955-5960. Exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells: isolation, identification and biological characteristics Zhang Juan 1, Liu Feng 2, Zhang Wei 2, Cong Xu 2, Wang Cai-sheng 1, 3, Wei Lai 2 (1Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2 Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China; 3the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China) Abstract BACKGROUND: Exosomes are membrane vesicles secreted by mesenchymal stem cells. Increasing studies have shown that mesenchymal stem cells can secrete exosomes via paracrine function to play a role in tissue injury. However, reports on how to isolate and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells are few. OBJECTIVE: To extract, purify and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells. METHODS: The cell culture supernatant of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells was collected. Exosome was extracted and purified with ultrafiltration and gradient centrifugation methods. The morphology of exosome was observed by transmission electronic microscope, and the expressions of CD63, CD81, CD90, CD73, CD105, CD29, and CD166 in exosome of mesenchymal stem cells were analyzed by fluorescent activated cell sorting. RESULTS AND CONCLUSION: Mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood secreted exosome

脐带间充质干细胞(MSCS)抗衰老的临床实验

脐带间充质干细胞（MSCS）抗衰老的临床实验作者：Simon Sun Isa Li 【摘要】目的：观察脐带间充质干细胞对人体衰老的影响和安全性，对比观察脐带间充质干细胞对衰老的逆转现象。方法：抽取20名健康人作为志愿者，进行脐带间充质干细胞静脉回输（其中男性6人，女性14人，年龄为50-80岁），实验组10名志愿者进行静脉滴注3个疗程脐带间充质干细胞，对照组滴注生理盐水。实验组和对照组志愿者均为双盲实验，疗程结束后3个月、6个月、12个月的对比观察。结论：治疗组有效率为90%，从外表、内分泌、精神状态、体能、睡眠均表现出有效性。 Abstract: Objective: To observe the effect and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) on human aging. Methods: a total of 20 healthy volunteers, of umbilical cord mesenchymal stem cells reinfusion (6 males, 14 females, aged 50-80 years old), the experimental group of 10 volunteers were intravenous infusion of 3 cycles of umbilical cord mesenchymal stem cells, the control group of normal saline drip. The experimental group and the control group were double blind experiment, 3 months after the end of treatment, and the observation of 6 months and 12 months. Conclusion: the effective rate of the treatment group was 90%, which was effective from the appearance, endocrine, mental state, physical fitness and sleep. 对抗衰老延长寿命是人类的梦想，但以往的方法以失败见终，究其原因均是不能针对衰老的根本原因所致。而人类衰老的原因一是衰老的细胞不能被代替，正常的新陈代谢因为干细胞的补充不足所致。随着干细胞和研究的发展，以及进行临床治疗中所带来的抗衰老表现，提示脐带间充质干细胞会对衰老的过程产生正影响，具有良好的市场应用价值。本实验就是采取双盲实验的方法来进行对证，验证MSCS对衰老的逆转影响。脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应