MSP与BSP
BSP和MSP区别：
1）检测的内容不完全相同
BSP引物不包括CpG位点，在CpG位点的上下游，扩增后通过测序检测改位置的甲基化状态(测序如果CG不变则为甲基化，如果CG变为TG则为非甲基化）
MSP/USP是根据修饰后甲基化和非甲基化的引物不同扩增出不同的条带而判断是否为甲基化(只扩增出MSP条带表明为甲基化，如果扩增出USP则表明为非甲基化）
2）MSP原理：甲基化特异性PCR(MSP)其原理为：双链DNA变性解链后，在HSO3-作用下发生C→U转化，C若已有甲基化则无此改变；甲基化修饰只发生于5′→3′方向C-G相联结构的C上，因此在HSO3-作用后，DNA CpG岛若无甲基化，则序列中的改变为C→U，CG→UG，若有甲基化则为C→U，CG→CG，用不同的引物做PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛甲基化。从理论上说，DNA发生甲基化的MSP产物的序列与原序列比较，变化为C→T，CG→CG，相应其互补链的改变为G→A，CG→CG。然后根据目的基因修饰前后的改变，相应设计M和U引物，有时我们需要设计两轮引物！BSP法原理：用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶则不变。基因组DNA经亚硫酸盐处理后，设计BSP引物扩增目的片段，此时尿嘧啶（U）全部转化为胸腺嘧啶（T），最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。
3)一般用BSP找到甲基化位点，然后根据甲基化位点设计MSP引物，摸索条件以得到最优检测甲基化的方法。
BSP因为涉及测序，其结果准确但要求克隆时所挑克隆较多等原因，操作繁琐，不易大批量操作。MSP则可以检测大量标本并用于检测。详细参见https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/forums/topic/5371-differences-between-msp-and-bsp/
引物和探针你可以查文献看别人设计好的，然后再找公司合成，也可以自己设计
1、ABI Methyl primer Express DNA甲基化引物设计软件使用
ABI Methyl primer Express DNA甲基化引物设计软件使用- 丁香园论坛=甲基化引物设计#14159723
2、甲基化的一些旧贴总结整理
较全的甲基化（MSP)原理及问题总结，希望对大家有帮助！- 丁香园论坛=荧光定量方法测甲基化#9184927
3、荧光探针设计软件操作说明
荧光探针设计软件操作说明- 丁香园论坛=甲基化探针设计#6763407
关于DNA甲基化引物设计除了常用的在线设计工具
MethPrimer : https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/methprimer/index1.html
BiSearch Web Server: http://bisearch.enzim.hu/
ABI公司还给我们提供了另外一个选择：Methyl primer Express，并且这个工具还是免费的。下载地址：
https://https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID= 602121&tab=Overview
需要在网站上免费注册，才能下载。软件的下载和安装，就不啰嗦了。
打开软件，主界面就是一个简单的框框，可以通过File → Import Sequence导入doc或者txt的序列文件，也可以用Edit → Paste 或者直接Ctrl + V粘贴已经拷贝的序列。
这里以hMLH1基因为例，在UCSC Genome Browser中获得该基因CpG岛序列。粘贴到上述对话框中，在Sequence Features菜单中，Renumber Sequence对输入的序列进行重新排布，可以去除序列中的空白区域。Enter Sequence Name输入序列名称等信息。
点击Design Primers → Find CpG Islands。
弹出对话框
点击No，使用默认值进行搜索。选择Yes，弹出CpG Islands选项，可对其进行自定义。
完成后，一路Next，默认是按预测出来的CpG岛设计。在对话框中用橘黄色标识出来。如果有特殊的要求，可以用鼠标选择感兴趣的区域，然后再Next。
在弹出的对话框中提供了简单的选择区域的信息，在对话框下方，选择你所需要的引物类型，包括MSP（methylation-specific PCR）和BSP（Bisulfite sequencing）。以MSP为例，选择Design MSP Primers，单击Next。
同样，点击No，使用默认值进行搜索。选择Yes，在MSP Primers选项卡中，可对其进行自定义。有人认为该软件得到的引物Tm值偏低，可以在此处将Tm值略微提高。在该选项卡的下方，有一个搜索的选项，将滑块移向最右侧，速度最快，精确性最低；滑块在最左侧表示速度最慢，但精确性最高。不同的选择得到的引物确实有比较大的差异。反正我每次都让它慢慢来，不差那几分钟时间。
等计算机一阵狂算之后，得到了一系列引物（下图1处）。越靠近横轴的，分值越高。单击你需要的引物（反白显示），在下图2处会显示引物的详细信息。也可以选择MSP Primer
Report（下图3处）获得详细的引物报告。
对于获得的引物，可以在methBLAST（http://medgen.ugent.be/methBLAST/）中验证其特异性如何。也可以用Oligo6等软件来评价所设计引物的质量。
常见问题
MSP原理：甲基化特异性PCR(MSP)其原理为：双链DNA变性解链后，在HSO3-作用下发生C→U转化，C若已有甲基化则无此改变；甲基化修饰只发生于5′→3′方向C-G相联结构的C上，因此在HSO3-作用后，DNA CpG岛若无甲基化，则序列中的改变为C→U，CG→UG，若有甲基化则为C→U，CG→CG，用不同的引物做PCR，即可检测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛甲基化。从理论上说，DNA发生甲基化的MSP产物的序列与原序列比较，变化为C→T，CG→CG，相应其互补链的改变为G→A，CG→CG。然后根据目的基因修饰前后的改变，相应设计M和U引物，有时我们需要设计两轮引物！
试验中的对照体系能保证MSP反应体系可靠性，MSP阳性对照选取的方法有以下几种：（1）查文献找目的序列MSP阳性的细胞，用其修饰后DNA做阳性对照。（2）购买商品化的MSP阳性对照，但较昂贵。（3）自制MSP阳性对照：用CpG甲基化酶(M.SssI)处理胎盘DNA做阳性对照。因为CpG甲基化酶M.SssI能识别并甲基化CpG识中所有C,使其与MSP方法所理想的DNA状态一致，可模拟生物基因组的修饰模式，故可用来做阳性对照。方法如下：先用CpG甲基化酶（NEB公司）在37℃下处理胎盘组织DNA 1h,再经亚硫酸氢钠修饰后，即可做阳性对照用于优化MSP的反应。
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/6835405_1.html（甲基化方法步骤）
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/2978030_1.html(石蜡组织DNA甲基化检测)
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/6231811_1.html(阳性对照)
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/2323309_1.html(修饰过程中是否糖原可以不用)
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/3903803_1.html(第二轮模板稀释)
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/1235538_1.html(试剂的配置)
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/2334872_1.html（试剂的处理）
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/5659323_1.html（手工修饰和试剂盒修饰的差异)
常见问题
MSP结果分析- 丁香园论坛
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/4718692_1.html（MSP产物弥散）
MSP结果不稳定，重复性很差
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/post/view?bid=67&id=9295899&sty=1（本人做的总结）
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/5611270_1.html（个人觉得很好，对重复性差的解释）
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/6926977_1.html（血清DNA提取MSP的讨论，个人觉得不错）
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/4848372_1.html（甲基化模板的提取）
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/6287354_1.html（Chemicon公司的CpGenome甲基化试剂盒做MSP的问题）
回复：【求助】dNTPs 与dNTP的区别- 丁香园论坛（甲基化中dNTPs 与dNTP的使用注意区别）
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/3692507_1.html（甲基化中SssI酶哪里买）
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/1558243_1.html（甲基化与部分甲基化的区别）
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/5651969_1.html（DNA甲基化攻略）
MSP引物相关问题
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/1883483_1.html（引物探讨）
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/post/view?bid=87&id=6169630&sty=3&keywords=%BC%D7%BB
%F9%BB%AF%BC%EC%B2%E2(肿瘤基因甲基化引物总结)
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/63 05920_1.html（甲基化中W，U，M三对引物问题）
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/2334872_1.html(引物设计)
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/728637_1.html（引物设计）
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/5654850_1.html（甲基化荧光定量PCR引物问题）
https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,/bbs/actions/archive/post/6363601_1.html（引物设计网站）
案例分析1:
?我最近在做的课题涉及到基因甲基化的检测，用到了MSP方法。但是目前初步试验了
几次结果不是很理想。现在我先提取的正常人外周血淋巴细胞DNA，然后做亚硫酸氢钠修饰，提纯之后跑PCR，没有成功。我想可能在修饰这一步不是很成功。想请教一下，修饰过程中有哪些需要注意的。比如各个试剂需要什么样的要求，pH调节需要精确到什么程度，反应温度和时间需要注意哪些问题，提纯和冷乙醇沉淀有什么注意点。
这里附上我的protocol，望指点。不胜感激！
1.约1μg DNA溶于45μL灭菌去离子水，加入3mol/L NaOH溶液5μL，混匀，37℃水
浴孵育20min。
2.加入新鲜配置的10mmol/L、pH5.0 对苯二酚30μL和3mol/L、pH5.0 NaHSO3 520μL，
混匀，100μL石蜡油覆盖，55℃水浴避光孵育16hr。
3.按照Wizard DNA Clean-Up System试剂盒protocol纯化DNA，溶于45μL灭菌去
离子水。
4.加入3mol/L NaOH溶液5μL，混匀，37℃水浴孵育20min。
5.加入5μL 3mol/L NaAc（4℃、pH 5.2），冷乙醇（－20℃、100%）100μL，混匀，
－20℃过夜。
6.20000g、4℃离心30min，弃上清，加入70% 冷乙醇（－20℃）200μL，20000g、
4℃离心10min，吸去上清，并重复一次，注意将溶液充分吸干。
7.所得DNA沉淀充分吹干，溶于40μL灭菌去离子水，直接行PCR。
?你好.我也在作MSP,客观说这种方法比较难作.我现在也没有作成功,不过我们可以互相
交流共同进步嘛.我看了你的操作过程,首先感觉在加3mol/L NaOH后进行变性的温度可以适当提高,我看过国外的文献, 建议作42℃水浴孵育20min.因为这一步如果不能完全将双链变成单链,下一步的修饰就很困难.你可以试一下.其次,我看了其他人的帖子才知道,经过NaOH处理后的DNA很脆,所以混匀动作一定要轻柔,不能将DNA链弄断,如果链断裂也是P不出来的.最后我也有问题要请教你:
1 我是用2微克DNA来进行处理的,这样的好处是虽然回收率不一定高可是得到的
DNA还是可以满足PCR对模板量的需求,同时我想知道和你的1微克相比我的DNA较多是否导致处理不完全?
2 我的对苯二酚没有调PH值,不知你是用什么来调节其PH值的?
3 纯化回收后再加NaOH37℃水浴孵育20min的目的是什么?
4 提取DNA时对冰乙醇的温度有要求吗?我都是在4℃冰箱保存的.
5 你的PCR扩增用哪个公司的引物?是普通合成还是特殊要求的?
对了,你的操作过程中没有加糖原来促进DNA沉淀,我是用10mg/ml的，加入量为1ul.
然后－20℃过夜。我的邮箱：gmcqiangchen@https://www.wendangku.net/doc/7715141338.html,愿意的话可以发邮件交流。祝我们大家实验顺利！
?琼脂糖包埋可以减少DNA的降解和丢失，而且操作简单。
?你好，我之前一直在做MSP的实验。有时实验效果会差点，但是没试过做不出来。我
自己的经验是：
1。NaHSO3的pH必须严格调到5.0。我们实验室是用pH计测的，应该算是比较准的。
pH对实验结果的影响比较大。
2。DNA变性要彻底。我在NaOH处理之前，用枪头对样品反复吹打，并用沸水煮2min，然后NaOH 42℃40min。一般来说，我是不会去避免DNA断裂的，私下以为一定程度的断裂反而有利于变性完全。很多文献在DNA变性处理这一步前也是先用酶切处理的。
3。bisulfite处理一步，先加hydroquinone再加NaHSO3。为了避免反应过度造成假阳性以及DNA断裂，我是用50℃处理。试过14～16h都ok。
4。DNA乙醇沉淀一步我是-20℃过夜沉淀的，没有另外加助沉剂，用14000rpm收集沉淀。最后用TE溶解。
5。很多时候，MSP不成功是由于PCR失败。设计一对适合工作的MSP引物并不容易。我们实验室有时对一个基因要设计3、4对引物才能得到比较好的实验结果。所以验证自己的MSP是否成功，有一对肯定可以工作的引物是最重要的。同时设置一个阴性对照，就是用根据未修饰序列设计的引物做PCR，一般情况下也可以扩出东西，起码说明回收的东西里面有可以进行PCR的DNA，以及可以看出bisulfite处理的效果。
最近按照fallinqlove战友的指导，实验终于有了进展。就上面大家提到的问题，说说自己的体会吧。
1.修饰前DNA是否需要打断。我曾经问过国外一个实验室的老板，他说无须事先酶
切，～2微克的DNA/50微升体系，修饰16小时是可以的。当然，理论上先酶切或是反复抽吸打断DNA似乎有利于修饰完全。
2.修饰前NaOH的处理其实37度15分钟就已经够了。文献报道这一步所用的温度和
时间版本较多，但是37度15分钟似乎是底线，实际上也够了。有人高温再迅速冰却，理论上更好啦，因为目的只是解链。
3.pH的问题。跟战友讨论过，对苯二酚和醋酸铵无须调节pH了，亚硫酸氢钠还是要
调节到5.0的。以前我用精密试纸，现在用电子pH计，事实上两者似乎差异较大。前者主观判断上可能有差异，后者就是标准液要小心。总之pH调节准确很关键。
4.反应时间。我现在用的55度16小时，修饰是可以成功的。请教过别人，一个经验
较为丰富的博士后说，55度12小时以上就可以了。其实文献报道的版本也不尽一致，个人认为温度50-55，时间12-16也许都是可行的。时间过短修饰可能不完全（尤其是DNA量～2微克/50微升体系的时候），过长的话甲基化的C也可能开始变了。
5.修饰提纯之后加NaOH貌似是脱硫用的，然后冷乙醇沉淀。我现在用-70度3小时，
个人认为足够了。而且这样做省时一些。-20度过夜也是可以的。
6.至于糖原，我没有加。有战友认为这个很重要，也有实验成功的战友说其实根本不需
要加。在坛子上见到过一个回复，说糖原其实并不能促进沉淀，只是相当于一种指示剂，在DNA量小的情况下冷乙醇沉淀之后不易见到，加了糖原之后可见沉淀，这样吸取上清的时候就不会把微量的DNA给扔掉。
7.PCR我使用了hot start酶，特异性好一些。国外那个教授告诉我他们只是用munual
的hot start，也可以。这一点战友们讨论也较多，经验不一。有人说普通酶普通PCR 效果也可以，有人则说必须金牌酶热启动。我觉得跟大家所扩增的片断也是有很大关系的，究竟用什么方式的PCR和相应的酶，还得自己摸索看看。我现在用的TaKaRa的hot start酶，感觉还行，而且也不贵。引物我是上海申能博彩合成的。
8.所用的普通试剂都是4度保存的，对苯二酚和亚硫酸氢钠现配现用。整个操作过程尽
量避免所有不必要的振荡，减少单链DNA的损失。
下一步我要挑战更难的。提取血清DNA做MSP。有经验的战友出个面啊，呵呵。
回收率我没有计算过，总是觉得整个实验中DNA太宝贵了，修饰提纯之后是不跑胶的，冷乙醇沉淀之后也不测OD值。1微克DNA做到最后溶解在40微升水里面，PCR体系25微升，其中DNA加5微升，目标条带是比较清晰的。
事实上提纯之后没有加NaOH和冷乙醇处理之前跑胶并不需要。战友说过，此时DNA是单链状态。
二聚体似乎不可避免，并且后面也会有浅浅的拖带，但是都比较淡。有拖带是说明不了有目标条带的，一定要有marker标记，找到你的目标条带才行。
案例分析2:
我是刚做msp的新手，按照手工修饰dna的方案，处理dna后，进行pcr扩增，全是弥散从未有条带，像是dna降解的样子，在两条染料之间是一片红色，退火温度一直在调整，所有的pcr成分也是在调整连非特异条带都没有。真不知是啥原因？用内参扩增却有条带，但是也是有弥散的一片在一块，只是夹有目的基因，真不知是啥原因这一片红色的东西。
我也碰到过弥散,不过调整温度,引物浓度,增加DMSO之后就出现带了,你可以试试加点佐剂看看
DMSO的用量各反应体系不同，我常用5％的。
DMSO 通常经验性地用于提高PCR 扩增的效率,但是过量的DMSO 可以显著降低特异序列的扩增效率,尤其是导致非特异性扩增。DMSO作用机制是由于这些有机溶剂在DNA 的水溶液中通过脱水(dehydrution) 作用导致DNA 结构的不稳定性,从而功能性的降低G+ C 富集区的熔点及解链温度提高了扩增效率。每10 %的二甲基亚降低熔点及解链温度5.5～6 ℃。
某些实验中在6 % 的DMSO 存在时,开始出现非特异条带,同时特异扩增产物减少。可通过增加模板- 引物的比例消除非特异条带。而通常提高复性温度只能部分减少非特异产物,不能避免非特异扩增。
对于DMSO 浓度过高时又同时使T aq酶变性失活降低扩增效率.可增加T aq 酶用量来消除. 再加一个：甜菜碱(Betain) 化学名为甘氨酸三甲内盐,它有两大优点, (1) 可增加Taq 酶的稳定性,防止其因温度升高而变性;(2) 降低双螺旋DNA 的稳定性,使二级结构易打开,从而促进高GC 含量基因的扩增。而且只有甜菜碱的浓度达到一定值时才能发挥作用[9 ,10 ,11 ] 。有报道是终浓度1.11～2.15M。
有机溶剂对Taq聚合酶活力的影响
物质浓度活力（%）
乙醇 <3% 100
10% 110
尿素 <0.5mol/L 100
1.0mol/L 118
1.5mol/L 107
DMSO <1% 100
10% 53
20% 11
二甲基甲酰胺 <5% 100
10% 82
20% 17
甲酰胺 <10% 100
15% 86
20% 39
SDS 0.001% 105
0.01% 10
0.1% <0.1%
?我用降落加巢式PCR的方法扩增MSP，有弥散带及非特异性条带，但目的条带清晰可
见，我想如果降落加巢式PCR，再用上DMSO，可能效果会不错。
?我觉得MSP最重要的是模本和引物，PCR 条件虽然重要但不是最关键的，如果模本
和引物没问题那你这么长时间至少也应该做出来点模糊的目的带了。我做MSP时体系和循环条件都和普通PCR 一样，也没加―佐料‖或用巢式，效果也还行。建议你先换个经典的（文献重复较多的）引物做一下。
如果你用的是石蜡标本，那最好先换新鲜组织做一做，石蜡太不好做了。
?最近这段日子一直在做MSP,又得到了一些经验.结论和上面有一位说得相似,引物是最
重要的
最近对之前难扩的引物重新设计了一下,结果效果好很多,有些位点先前的引物很难出来,又加这个又加那个的才有弱弱的条带,而且效果不稳定.用新的位点一下子就出来了,而且温度范围很宽,特异度也高.
之前用DMSO是考虑到GC含量高(有70%),将其拉下来,并且用特异性产物优势扩增去抑制其他的,但换引物以后普通的体系也出来了.
另外添加剂的使用效果在原先就有目的条带但不是很特异或者比较弱的情况下使用效果比较好,完全没有产物时比较渺茫.
所以建议xdjms可以考虑更换引物
还有就是模板的质量也很重要,在同样的引物和条件下,用我师兄修饰的模板结果明显比我好太多,我俩唯一的区别就在于他是用Qiagen的试剂盒提得DNA而我用的是国产的.
至于修饰过程我的结论是怎么折腾都没大问题.我和同伴曾经进口和国产的试剂都用过,试剂没有用新配的,算错过亚硫酸氢钠的量,忘记和加多了氢鲲,忘了加石蜡油,孵育时用了温度差好大的坏水浴锅,忘记倒滤过液就洗脱等等,总之什么错误都犯了一遍,不过最后我做了比较发现扩增条带没什么大区别.真是奇迹!所以不用太担心修饰中的问题,不过还是劝各位小心为妙,呵呵.
Sssi酶使用方法，20ul 反应体系的建立：
ddH2O:12ul
2ul NEBuffer（10×）
DNA 1ug（我的5ul）
SAM 0.5ul
酶1u（0.5ul）
混匀，37度4小时
The differences I see in MSP and BSP come from the primer design where MSP primers are designed with CpG(better in the 3' end) to make them more specific.
BSP on the other hand, primers are designed to encompass the CpG without
including them in the design of the primers.
That is right-- for BSP, you want NO CpGs in your primers, and convert all non-CpG Cs into Ts in the forward primers (you figure out the reverse). BSP should amplify all converted strands regardless of methylation status, then it's the sequencing that
matters
MSP has it advantages in that it is far more quicker than BSP in terms of hands-on lab time.
案例分析3:
请问做MSP对DNA进行修饰后,乙醇沉淀过程不用糖原可以吗?我现在还缺少此种试剂,又着急试验!
可以的，醋酸钠，冰乙醇就是沉淀用的，糖原起促进的作用
定量后
1/10体积醋酸钠，2倍体积冰无水乙醇
可以得
后用70%乙醇洗涤
真空干燥后可以看的到胶冻状的DNA
一般来说是看不到DNA的，因为量实在太微弱，胶冻状的应该是低温下的盐结晶，这是推测了。
不过，按MSP处理DNA的过程中微克量级的水平，要肉眼看到DNA是不可能的，这点应该是肯定的。
谢谢各位的热心帮助！我已经用一周的时间做了一次MSP，熟悉了MSP的实验操作，
但郁闷的是，我的甲基化引物和非甲基化引物均无扩增条带，请大家帮我分析一下：1、1ugDNA 经修饰后，测得的OD260为0.042,DNA浓度为0.042ug/ul,DNA的回收率为
58.8％;
2、PCR反应用的是热启动酶（Eppondrof),我是第一次使用此酶，不知有什么该注意
的？
3、PCR的引物为多篇文献都使用的引物，用MethPrimer分析后可完全匹配，产物长
度为115bp;
4、PCR的条件为95度15分（预变性）；62度（M）30秒，60度（U) 30秒; 72度1
分;72度5分(last cycle);共40个循环
5、用２％琼脂糖电泳检测
下面我该如何调整实验呢？这次修饰的DNA已经被我用完了！
我也在做MSP，刚开始的时候也跟你的一样，甲基化引物和非甲基化引物均无扩增条带。我总以为是修饰方面出现了问题，所以重新修饰过了好几次，但每一次还是老样子。
后来我就把时间转到优化PCR上来了，早二天终于摸出来了一个基因的条件，现在正在摸第二个基因的条件了
我想问你的是，你的PCR产物在跑胶后是不是能见到很亮的引物二聚体呢？还是什么东西都没有呢？（当然这个跑胶的时间应该是在30分钟左右啦，胶的浓度是2%）如果是引物二聚体很亮的话，建议减少引物的量，特别重要的是提高退火温度（我发现我们的这种引物的Tm值，我们通过公式计算的与公司提供的差距有比较大，建议以公式计算的为准）
如果是什么都没有的话，那就只有降退火温度同时增加循环数了啦
再就是，当你提高退火温度以后建议把退火时间延长，我现在用的都是45s
你的72度延伸的时间没必要1分钟吧，我用的也是45s
案例分析4:
请教各位，我做的是胃癌细胞MSP，DNA修饰完后直接跑M和U引物。有很多非特异性的带，我的M是71bp，U是162bp。模板用的3微升，buffer里面有混得Mg离子，没有另外加Mg离子。PCR条件:94度4min 94度40s 63度45s 72度60s 72度7min。我没有用热启动酶。我感觉U在162bp处有目的条带，但是M在71bp处不明显，不知是不是引物二聚体。胃癌组织做MSP，有时U也可以出带，是因为癌组织中有正常组织的contamination。但是细胞系的U也会出带吗？有点不好理解啊。请各位帮帮忙，我下一步是该降退火温度还是升啊？我后来试过64度，带更加模糊。
1.从我做的来看,M和U都可能有条带,解决的办法是稀释模板,10或者100倍稀释.看M和U 的条带亮度差异.
2.用无Mg离子的BUFFER.效果应该好些.
3.71bp和引物二聚体不能区分.可以做个空模板(加水)对照,看是否有引物二聚体生成.
案例分析5:
我做MSP时，亚硫酸氢钠相当难溶，不知是什么原因，是不是要先加NaOH才能溶，要是如此，加多少较合适？另外是不是亚硫酸氢钠和对苯二酚一定要用进口试剂？谢谢各位了!
1. 3 M Sodium bisulfite
2.方法
Methods
1. Take 1 mg of DNA and add double-distilled water to 50 mL in a 1.5-mL tube.
2. Add
3.5 mL of 3 M NaOH (final concentration of 0.2 M), and incubate at 37°C or
10 min.
3. Freshly prepare 10 mM hydroquinone, and add 35mL of it to the tube.
4. Freshly prepare 3 M sodium bisulfite, adjust to pH
5.0 by adding 3 M NaOH,
add 520 mL of it to the tube, mix well, overlay with mineral oil, and incubate at
50°C for 16 h or longer.
5. Put the tube on ice, add 5 mL of Wizard DNA purification resin (or similar DNA
purification resin), mix, and incubate at room temperature for 10 min, spin at
5000g for 10 s at room temperature, discard the supernatant.
6. Put 1 mL of 70% ethanol, mix by Vortex, spin at 5000g for 10 s, and discard the
supernatant. Do this two more times, and remove the supernatant completely.
7. Add 50 mL of TE, mix well, incubate at 50°C for 5 min, spin at 12,000g for 1 min,
and transfer the supernatant to a fresh 1.5-mL tube.
8. Add 5.5 mL of 3 M NaOH, mix, and incubate at room temperature for 5 min.
9. Add 10 mL of 5 M NH4OAc and mix (for neutralization).
10. Add 1 mL of 5 M NaCl and 200 mL of 100% ethanol, mix well, keep the tube at
–20°C for 1 h. Spin at 12 000g, at 4°C for 5 min, discard the supernatant, rinse
the pellet with 70% ethanol, dry the pellet, and dissolve in 20–50 mL of TE, and
store at –20°C.
3.对苯二酚最好是进口的
4.可以用一般的，但效果要差一些
案例分析6:
有做过MSP的战友知道DNA修饰试剂盒和DNA纯化试剂盒有什么差别嘛？另外，做MSP一定要用进口试剂盒嘛，国产的有没有，到哪里买，效果怎样？有哪位知
道CpGenome DNA Modification Kit (Sereological公司)的价格，谢谢！
DNA修饰可以不买试剂盒，试剂挺简单，操作上也没有什么难度
2）纯化试剂盒是在修饰之后，进行脱盐用的，里面主要是树脂或其他一些可以结合DNA
的东西，然后将DNA从上面洗脱。
关于甲基化的修饰部分，本版又很多方法，我的方法是根据Hermann(1996年)的方法,通过自己做有一些改进,但目前还没有特别理想的结果,我可以将其贴出,供您参考,希望你有什么心得,及时和我交流.实验做得很郁闷!!
我的方法,有待改进:
一亚硫酸氢钠修饰DNA：
1: 取基因组DNA 2μg，灭菌双蒸水稀释至50μl。
2:加入新鲜配制的3M NaOH 5.5μl（终浓度0.3M），37oC水浴10min，使DNA变性为单链。3:依次加入新鲜配制的10mM氢醌（对苯二酚）30μl和3M亚硫酸氢钠520μl，颠倒、轻柔混匀后，覆盖100μl石蜡油防止液体挥发，避光50oC水浴16h。
二修饰后DNA纯化：
1:预热灭菌双蒸水至80oC。
2:使用Promega DNA Clean Up (A7280)纯化试剂盒纯化DNA，操作根据说明书。
3:无菌水50μl洗脱DNA，离心12000rpm，1min。
4:加入3M NaOH 5.5μl（终浓度0.3M），室温5min，终止修饰。
5:加入10 M 乙酸铵23μl,中和，以3倍体积的冰无水乙醇，-20oC沉淀4小时。
6:4oC离心，12000rpm，15min，收集沉淀，晾干。
7:无菌水重悬，-20oC冻存。
我的意见供参考:
1:如果银子多,我认为还是买试剂盒好,因为配制亚硫酸氢钠很麻烦,且亚硫酸氢钠和氢捆均
需现用现配,我每次做都要提前1小时开始干活.
2:亚硫酸氢钠有很多种,文献及各位战友似乎用的都不一样,我和他们买的也不甚一样,所以
没有结果也不知道是哪一步出的问题.
3:买DNA 提取试剂盒时请注意里面是否有RNA 酶及蛋白酶K,我的试剂盒里没有,结果第一次结果出来,RNA 污染严重,紫外分光光度仪测定DNA 浓度不准,影响了后面的操作,后来又定的RNA酶和蛋白酶K.
4:另外提醒:在提取DNA 时请根据自己的细胞数决定裂解液的使用,否则裂解不完全,影响DNA 的收获.我做第二次时因为贪心,细胞收集的太多,结果裂解不充分.未裂解的沉淀堵塞
了离心柱的膜孔,收获很少.
案例分析7:
我做MSP有一段时间了，刚开始做P16时几个细胞系都有阳性结果（条带位置正确），现在回头再做时怎么也做不出来，好郁闷啊！而另一个基因确比较稳定。请教各位高手原因！会不会之前的结果是假阳性？怎么能判断结果是否假阳性呢？怎样防止假阳性的发生？
发现很多人都反映MSP重复性不太好，其实这种PCR还是很稳定的，至少不会比普通PCR 差。
如果出现某个基因以前能正确扩增而现在扩增不出来的情况，我觉得认为先不要去怀疑现在的PCR体系或条件，而应当首先考虑现在所用的MSP模板是不是出了问题。这是因为：
（1）MSP模板的准备涉及DNA的变性、亚硫酸氢化修饰、脱盐、脱硫和纯化等许多步骤，而在每一步中不论是操作的不当或试剂的质量问题都会导致DNA修饰的失败。
（2）经过修饰后的DNA模板本身会变得很不稳定，容易降解，因些对待这类模板的要求应和RNA一样，如少量分装、低温保存、避免反复冻融等。据文献报道，亚硫酸氢化修饰的模板若在-25度下保存，至少三个月内是稳定的，但如果在4度保存，一周左右便开始降解。
至少您提到可能出现的假阳性结果，对MSP来说来确实是比较普遍的。因为这类引物本身就在富含GC的区域设计，很容易出现3‘端与其它序列错配的现象。要判断是否有假阳性结果，当然是设立阴性对照了。如果有与待检组织相应的正常组织的DNA最好，如果没有就用外周血淋巴细胞DNA也可以。
虽然在理论上可以通过优化PCR体系和条件来要防止假阳性发生，但实际上效果有限，还不如再重新设计一下。
案例分析8:
关于MSP重复性不好的问题
1、亚硫酸盐修饰不完全也是原因之一，实际上亚硫酸盐的修饰不可能达到百分之百，那么
哪怕只有百分之一的差异，都会影响重复性。何况百分之九九也是很难达到的……如果大家做BSP的重复性，可能更能发现这一点。如果模板修饰不完全，就可能出现重复性不好，既假阴性的结果。所以在引物设计上最好M和U引物的退火温度有差异，这样可以尽量减少假阴性的结果，提高重复性。
那么修饰不完全是怎么造成的呢？
个人认为，1.主要是修饰的亚硫酸盐浓度和时间不够，没有充分修饰；2.本身模板DNA 没有去蛋白干净，蛋白在甲基化位点结合处有残留。建议，在抽提模板时充分消化，合理把握修饰的浓度和时间。
个人认为甲基化之所以难，有俩个原因：
1.引物设计不合理，如果修饰不完全，假阴性很容易出现，导致重复性不好。
2.修饰后的模板不稳定，就会出现刚开始能P出很好的条带，但过几个月后，目的M条
带不出现，或反而出现U条带。
2、关于重复性不好,我也来谈谈我的看法吧:
1.修饰后稀释模板最好不要用水,最好能用TE啊,这样可以有助于放置时间长一点啊.
2.可以将修饰后的模板分装啊,修饰完就每个管中放5μl吧（如果你每次扩Ｕ和Ｍ正好用量是２μl，正好可以做一次啊）把分装后的标本放在－７０冰箱里面啊.每次实验拿一管啊
3.关于引物的退火温度,U和M我们都是用的一样的退火温度啊,主要是觉得方便啊,可以一起反应啊,不然用两个退火温度,除非你们实验室有两台PCR仪器啊,否则你是把体系
配好了放冰箱等时间呢,还是过会等一个反应完了再配另一个呢,这是不是牵涉到模板的
反复冻溶呢
一、亚硫酸氢钠修饰过程中可能出现的问题及应对措施
亚硫酸氢钠修饰DNA的目的是将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化为尿嘧啶，而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不变。影响此过程的主要因素有修饰试剂的浓度、反应温度、反应环境的pH值及反应时间。其中任何一个环节出现问题都将导致
MSP扩增失败，体会如下：
(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3．0～3．9 mol/L为好，其pH值必须用NaOH
精确调整至5．0；
(2)修饰时间应掌握在10～16 h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿
嘧啶且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底；
(3)反应温度应控制在50～55℃(若用国产恒温水浴箱建议温度设定在53℃为好)；
(4)DNA模板量应控制在<2ug为宜。
只要遵循以上几点基本上能保证99％未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。但是，此修饰过程中模板DNA有约96％已经降解。当DNA样品较少时(如石蜡包埋组织、血清DNA)，在纯化回收时可加人适量鲑鱼精DNA或糖原(约1 g)作为载体，有利于DNA沉淀(加入载体后轻轻晃动Ependof管可见絮状DNA富集现象) 。
二、甲基化特异PCR可能出现的问题与对策
1．引物因素分析MSP的引物设计的质量是扩增成败的关键性因素。
MSP的引物设计与普通的PCR引物设计不同，MSP的引物设计原理是：模板DNA 在经过亚硫酸盐处理后，发生甲基化的基因启动子区域CpG岛内CpG位点5 一端胞嘧啶保持不变；而未发生甲基化的CpG岛内CpG位点5 一端胞嘧啶转化为尿嘧啶，即C—U。针对修饰前后的序列差异用MethPrimer软件设计甲基化与未甲基引物，进行PCR扩增。MSP的引物序列中至少含有1个以上CpG位点，最好是含有多个CpG位点，这样可保证引物的特异性，同时可以提高DNA启动子甲基化碱基的检出率。MSP的引物必须按亚硫酸氢钠处理后的DNA序列设计，同时也应该尽可能与普通PCR的引物设计原则相符合。按MSP的要求，任意DNA 序列在做MSP扩增时，至少要合成2对引物，即甲基化引物与未甲基化引物。在MSP的未甲基化引物序列中前导引物不含鸟嘌呤碱基，反向引物不含胞嘧啶碱基。
初涉及MSP者最好用文献引物进行研究。如果是为了筛选新的甲基化的抑癌基因
而文献中无法找到的相应MSP引物，可用在线MethPrimer软件在线设计引物，网址为http：／／www．urogene．org／methprimer／index1．html。根据软件提示可以找到所需要的MSP引物。但MSP所遇到的困难是，要扩增的是启动子或部分第一外显子序列，其CG含量相对较高，MSP扩增难度加大，因此设计好的引物最好用引物软件如Primer5．0从理论上推测其扩增效率，对于扩增效率<30％的引物要进行优化，方法是：在核心启动子区域前后反复调整甲基化前导引物扩增起始点，以期使引物扩增效率增高，降低扩增难度，从而提高PCR产量。
2．MSP的反应体系问题MSP的反应体系的成分与普通PCR一样，反应体系的优化也与普通类似，反应体系的优化与普通PCR的反应体系中最大的区别是DNA模板不同。经过修饰后的模板为单链状态，MSP的DNA模板在抽提后应检测其纯度和含量，其纯度要求A260／A280在1．8～2．0之间；其含量要准确检测，否则在亚硫酸盐处理时因DNA模板加的太多而导致DNA处理不完全而导致MSP扩增失败；而加的DNA模板太少则一方面浪费试剂，另一方面会因为目的片段太少导致MSP假阴性。Mg―浓度一般在2．0～2．5 mmoL／L为宜，过低过高都不利于扩增。此外，PCR的缓冲液及T aq酶的来源也很重要，一般的PCR缓冲液常常会导致结果不稳定，不同来源的T aq酶也会影响结果的重复性。我们建议用T aka—ra 公司针对富含CG等复杂二级结构模板的TaKaRa IAT aq with GC Buffer效果较好。而一旦选用某一厂家Taq酶后，不要轻易更换，以免MSP因重新优化而引起的时间和成本的浪费。
3．MSP的反应温度分析MSP扩增的结果有3种情况：(1)产物电泳为阴性；(2)
产物电泳出现多条非特异性条带(含目的基因条带)；(3)产物电泳为阳性(仅目的基因条带)。出现前2种情况时，可在保证反应体系和引物没有问题的情况下，通过调整MSP的反应温度而得到目的基因带。方法如下：PCR反应中，Tm的高低与CG 含量呈正相关。因甲基化与未甲基化引物序列差异，在扩增过程中可能会出现PCR 偏性。我们建议，提高预变性温度(一般应>95。C，10 rain)和变性温度(>95℃，1 min)，退火温度以60℃作梯度或70℃作降落PCR。
总之，在MSP全过程中，影响结果的因素较普通PCR要多得多，只要对实验过程每一步认真控制可完全提高MSP的准确度和精密度。
对于该文章的一些观点，我也提出一些意见和大家讨论。
(1)亚硫酸氢钠的浓度最好控制在3．0～3．9 mol/L为好。（我们实验室就答亚硫酸盐就大于这个浓度）
(2)修饰时间应掌握在10～16 h，修饰时间过长会导致甲基化胞嘧啶也会转化成尿嘧啶且DNA模板破坏加剧，而时间过短会导致修饰不彻底。（这点我深有体会，因为如上所述，我当时也怀疑4h可能修饰不完全，分别就做了6h,12h,16h.确实发现修饰时间过长，模板破坏加剧，可能不倒2个星期就降解了，当时P处M的，后来居然只能P出U.
(4)DNA模板量应控制在<2 g为宜。(这个我想大家应该都理解，主要是为了修饰完全）
甲基化特异性PCR全程易出现的问题与控制措施.pdf(136.58k) 在线查看
案例分析9:
完全甲基化和部分甲基化有何区别?
完全甲基化就是DNA两条链上甲基化修饰了，该位点就不能被相应的限制性酶切断了，而部分甲基化就只有一条链被甲基化，不可被限制，但还可修饰。还有一种状态就是非甲基化，两条链都未被修饰，可被限制。
案例分析10:
我在外文文献上找到如下两对引物,并在pubmed上找到我要研究的基因的原序列,为了检测这两对引物能不能用,我把原序列中除了CG这样连在一起的C外,其他单个的c都转换成T,然后将下面两对引物在改过的基因序列中搜索,结果只有甲基化引物对能在改过的序列中找到,(其中的antisense是在把这个引物翻译成其互补链,再倒过来写找到的),用作非甲基化的引物对在原序列及转换成甲基化后的序列中都找不到.
请教:1,我这样检测引物的方法有没有问题?
2.在原序列中找不到非甲基化的引物对,是不是说明这对非甲基化的引物不能用?
非甲基化引物中的T有的是源序列中的T，有的是修饰后的T，你知道怎么区别吗？如果区别不开，那你找就太费事了。
你在园内search，有在线甲基化引物设计站点，以及转换修饰后的序列。
给你修饰后的序列：上面为源序列，下面为修饰后的序列：
1 CTGCTGGNCCGGGTGCTAGGNCCCTGACTGCCCGGGGCCGGGGGTGCGGGGCCC GCTGAG
:||:||||:++||||:|||||:::|||:||::++|||:++||||||++|||::++:||||
1 TTGTTGGNTCGGGTGTTAGGNTTTTGATTGTTCGGGGTCGGGGGTGCGGGGTTCGT TGAG
61 CCCGCGCCCACCTGGAACTCGCGCTGGCTGGCGAGCGCTGCGCGCAGNCCCAGT TCCCAC
::++++:::|::|||||:|++++:|||:|||++||++:||++++:|||:::||||:::|:
61 TTCGCGTTTATTTGGAATTCGCGTTGGTTGGCGAGCGTTGCGCGTAGNTTTAGTTTTT AT
121 ACCCGCCTCTCCCTCCACACTTCCCCGCAAGCAGAGGGAGCCGGCTCTGGCTTCG GCCAG
|::++::|:|:::|::|:|:||:::++:|||:||||||||:++|:|:|||:||++|::||
121 ATTCGTTTTTTTTTTTATATTTTTTCGTAAGTAGAGGGAGTCGGTTTTGGTTTCGGTTAG 181 CCCAGAGAGGGGCCCCCACAGCGCAGTGGCGGGCTGAAGGGCTCCTCCAGCACG GNCAGA
:::|||||||||:::::|:||++:|||||++||:|||||||:|::|::||:|++||:|||
181 TTTAGAGAGGGGTTTTTATAGCGTAGTGGCGGGTTGAAGGGTTTTTTTAGTACGGNTA GA
241 ATGGACGCCAAGGNCGAGGAGGCGCCGAGAGCGAGCGAGGGCTGCTAGCACGTT GTCACC
|||||++::|||||++||||||++:++||||++||++||||:||:|||:|++||||:|::
241 ATGGACGTTAAGGNCGAGGAGGCGTCGAGAGCGAGCGAGGGTTGTTAGTACGTTGT TATT
301 TCGCATTCTGAACCACAGACTCTCCAACTCTCCGGNGCTTTTCGCCCACTCGGTCCC TCA
|++:|||:||||::|:|||:|:|::||:|:|:++|||:||||++:::|:|++||:::|:|
301 TCGTATTTTGAATTATAGATTTTTTAATTTTTCGGNGTTTTTCGTTTATTCGGTTTTTTA 361 GAACACGAAGGGCTCTCTCATCCTGTCACTAAAACGATTAGCTGTCCGGAGACACGG AAA
|||:|++|||||:|:|:|:||::|||:|:|||||++|||||:|||:++||||:|++||||
361 GAATACGAAGGGTTTTTTTATTTTGTTATTAAAACGATTAGTTGTTCGGAGATACGGAA A
还有，你的甲基化引物找到了，你的非甲基化引物也因该找到了，因为他们通常在同一位置（我看你的引物也在同一位置），只是长短不一致。
我现在有了源序列和修饰后的序列,也有了这个基因的启动子的位置(序列),那么下一步是不是用源序列来找野生型的引物,而用修饰后的序列来找甲基化和未甲基化的引物?怎么找?能不能帮帮我?
设计三对引物：一对是野生型，一对是甲基化引物，一对非甲基化引物。野生型引物用来监测PCR反应体系的正确性。甲基化引物和非甲基化引物用来区别特异序列的CpG中C的甲基化状态，即是甲基化或是非甲基化。扩增出来的片断可以直接sequencing，也可以导入载体，做进一步分析。
设计引物的要点:除了一般的要求外，MSP需要特殊要求：1。甲基化引物、非甲基化引物、野生型引物Tm差异不能太大，一般小于2℃。2。甲基化引物和非甲基化引物带有至少一
COPD精准医学
精准医学的气道性疾病生物学标记物 COPD是一类复杂的临床实体性疾病。以往对它的诊断相关概念认识局限，现在人们已经清晰认识到COPD是一类有着临床和生物学异质性的疾病进展过程，并与其他的气道性疾病如慢性哮喘间有重叠。正因如此，对现有的标准化治疗实践，产生的全身性反应因人而异。新的临床指南已经意识到这一点，并加入了诊断和管理方案的症状和危险因素，来改进这方面的不足。然而，随着更深入地认识COPD有关的病理生理学，我们已经发现了许多新的生理的、细胞的、蛋白组学的和遗传学标记物。有些已经被用于独立预测某些特定的临床病型，这一点是传统的肺损害检测方法还无法做到的。这些预测性生物学标记物的应用前景无限，可用于对各种患者群体进行分层，从而改变我们的医疗方式。我们应该要致力于精准医学的发展，来完善诊断和治疗方案，从而管理和改进这类疾病的临床结果。 介绍 COPD是一类世界性的，威胁社会和健康管理目标的疾病。它的影响在未来数年还将上升，这不仅仅是对于发达国家，发展中国家也难以幸免。这部分是由于持续暴露于COPD的危险因素，部分是因为人口的老龄化。在美国，COPD不仅在导致30天内再入院的原因中排名第三，也是致死的第三大原因[1]。到2030年，在美国每年会有9,000,000人因COPD 死亡，而直接和间接的医保费用将近36,000,000,000美元[2]。 1959年的CIBA论坛[3]和1965年的Aspen肺部会议首次推广chronic obstructive pulmonary disease这个集合名词[4]，此后的四十年里，我们对肺气肿和慢性支气管炎的病理生理学的认识已经有了很大的变化。然而，尽管我们对它发展的复杂多样的机制有了更好的了解，我们很大程度上仍需依赖基础的肺功能阈值，来诊断和管理这类变异性疾病[5]。 现在，随着研究有了更新、更先进的生物学数据库，我们可以更好理解和定义处于各种疾病阶段的特定的患者类型。因此，治疗的手段不再是以往接受的“一种模式适应所有”，我们正迈入一个裁缝医学的时代。这是模式的变迁，在呼吸领域，也许能说明这一点最好的例子就是实质性疾病的靶向治疗，如用特定的酪氨酸激酶抑制剂来治疗非小细胞肺癌，或是用ivacaftor作囊性纤维化跨膜电导调节器(CFTR)增效剂，来治疗发生了G551D突变的囊性纤维化患者。 当我们对这些单基因突变案例的管理，已经极大地转向靶向治疗，我们必须牢记，多基因疾病如COPD，存在显著的基因、表型、环境间的交互作用，且很难明确界定。本文中提到的要真正的靶向治疗的实现，是一个雄心勃勃、且会愈加复杂的目标。 近来，许多团队都尝试用多变量统计分析的方法，来进一步完善和定义怎样将COPD 的多种类别，划分到对应的表型的亚型。然而，当我们尝试将分得的COPD亚型，和可能有意义的临床指标，如症状、治疗效果、恶化率、死亡情况联系起来时，存在脱节。 在这篇文章中，我们将关注COPD诊断的复杂性，以及随后的生物学标记物引导的治疗潜在的靶点和含义，致力于管理和改进这类疾病的临床结果的靶向治疗。 伴随诊断的发展 除了靶向治疗，伴随诊断也越来越多地被应用：即专门的生物学标记物，它们可传递临床生物学信息，来识别有应答的患者亚群。如果我们能理解是什么在掌控疾病进展的机制，我们就能去鉴别那些掌控的关键因素，不仅可用于伴随诊断，也能用于药物的发展——实现这一点的关键则是健全的、基础的科学研究。应用伴随诊断益处良多——不仅对患者，对健康医疗系统、制药行业均有裨益。
Cell：使用靶向转录的抑制剂-成为治疗脆性X综合征的新途径
Cell：使用靶向转录的抑制剂，成为治疗脆 性X综合征的新途径 订阅号APExBIO 脆性X综合征（FXS）是智力障碍和自闭症的主要遗传因素。FXS是由脆弱X智力迟钝蛋白（FMRP）的功能丧失引起的，其抑制目标转录本的翻译。 FMRP的大多数良好表征的目标转录物是突触蛋白，但靶向这些蛋白质尚未提供有效的治疗。在这里，来自美国洛克菲勒大学的研究团队研究了一组编码转录调节因子，特别是染色质相关蛋白的FMRP靶标。发现小鼠中FMRP的缺失引起染色质调节的广泛变化和异常的基因表达。为了确定靶向表观遗传因子是否能逆转与病症相关的表型，作者聚焦于Brd4，FMRP靶向的一种BET蛋白和染色质读者“reader”。
抑制Brd4（JQ1/CX-4945）减轻了与FXS相关的许多表型。总之， FMRP的缺失导致显著的表观遗传学错配，通过表观遗传调节因子如Brd4来靶向转录可能为FXS提供新的治疗方法。该论文发表于《Cell》。 作者发现FMRP的靶标除了与突触功能相关的转录本之外，还有一些不成比例的编码染色质和转录调节因子的直接FMRP靶标。即FMRP除了调节突触蛋白外还调节染色质相关蛋白。 FMRP抑制翻译，其缺失可以增加靶蛋白的水平。相对于野生型（WT），在Fmr1敲除（KO）小鼠培养的皮质神经元中，包括Brd4，MLL1和p300在内的几种染色质相关FMRP靶标增加；“活性”染色质相关组蛋白修饰也被检测到强大的增加，包括H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3），H3赖氨酸27乙酰化（H3K27ac），H4赖氨酸8和16乙酰化（H4K8ac和H4K16ac）。相比之下，与“抑制性”染色质相关的H3K27me3没有变化。 组蛋白修饰的广泛变化意味着转录也可能被错配。使用RNA测序发现KO神经元中基因表达的强烈变化。还发现在FXS错配基因和自闭症易感性基因之间存在非常明显的重叠，特别是对FXS上调基因。值得注意的是，抑制剂JQ1[其抑制溴和末端结构域（BET）蛋白质，包括FMRP靶标Brd4]会干扰这些基因的表达。此外，作为FMRP
嗜酸粒细胞增多表型COPD患者的临床特征初探
嗜酸粒细胞增多表型COPD患者的临床特征初探 发表时间：2017-06-28T15:18:17.400Z 来源：《医师在线》2017年5月上第9期作者：李佐霖洪旭初 [导读] 探索嗜酸粒细胞增多表型慢性阻塞性肺疾病患者稳定期的临床特征，为COPD分型提供依据。 福建中医药大学附属人民医院福建福州 350004 摘要：目的探索嗜酸粒细胞增多表型慢性阻塞性肺疾病患者稳定期的临床特征，为COPD分型提供依据。方法选择福建省人民医院呼吸内科2015年10月——2016年10月门诊就诊的COPD稳定期的患者，将诱导痰嗜酸粒细胞（Eos）≥3%的患者分为嗜酸粒细胞增多组（增多组），＜3%的为非嗜酸粒细胞增多组（非增多组），收集两组的血嗜酸性粒细胞百分数、肺功能（FEV1、FVC、FEV1占预计值%、FEV1/FVC%）、FeNO水平、生活质量评分（CAT评分)，并进行对比分析。结果共纳入56例COPD稳定期患者，增多组血Eos%高于非增多组，增多组FEV1、FVC、FEV1占预计值%、FEV1/FVC%、FeNO水平高于非增多组，CAT评分低于非增多组。结论嗜酸粒细胞增多表型的COPD患者肺功能及临床症状优于非增多的COPD患者。 关键词：慢性阻塞性肺疾病；稳定期；嗜酸粒细胞 慢性阻塞性肺疾病是一种异质性疾病，表现为不同的病理生理和临床特征，COPD表型的识别有利于个体化治疗。本文初步探讨Eos 增多型的COPD患者稳定期的临床特征，为COPD分型提供依据。 1 资料与方法 1.1 研究资料 选择福建省人民医院呼吸内科2015年10月——2016年10月门诊就诊的COPD稳定期患者。纳入标准：(1)年龄大于等于40岁；（2）符合GLOD2015诊断标准[4]（吸入支气管舒张剂后FEV1/FVC%<70%，即明确存在持续气流受限，除外其他疾病后可确诊慢阻肺）；（3）过去的4周临床稳定（患者咳嗽、咳痰和气短等症状稳定或症状轻微）。排除标准：(1)过去4周内有急性加重；（2）过去4周内有口服或静脉糖皮质激素治疗；（3）有哮喘病史、过敏性鼻炎等其他过敏性疾病；（4）伴有原发性肺血管疾病、支气管扩张、肺结核、弥漫性泛细支气管炎和闭塞性细支气管炎等其他呼吸系统疾病者；（5）患者有任何的精神或生理的障碍以致无法完成肺功能试验；（6）对诱导痰不能耐受或产生不良反应者。 1.2 方法 进入该研究的对象的基线资料将被收集，包括年龄、性别、BMI、吸烟史等，对研究对象进行诱导痰检测，将诱导痰Eos≥3%分为嗜酸粒细胞增多组，＜3%为非嗜酸粒细胞增多组，收集两组的血嗜酸性粒细胞百分数，FeNO水平，肺功能（FEV1、FVC、FEV1占预计值%、FEV1/FVC%），慢阻肺患者自我评估测试问卷（CAT)，并进行对比分析。本研究经过我院医学伦理委员会通过，研究对象均签署知情同意书。 1.3 统计学处理 计量资料符合正态分布表示为（?X±SD）,非正态分布表示为M（IQR）,计数资料表示为n（n%）。正态计量资料组间比较采用两独立样本t检验，非正态分布资料采用秩和检验。计数资料采用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义，采用SPSS 20.0统计学软件。 2 结果 2.1 两组患者临床资料比较 共纳入56例COPD稳定期患者，增多组血Eos%高于非增多组，增多组FEV1、FVC、FEV1占预计值%、FEV1/FVC%、FeNO水平高于非增多组，CAT评分低于非增多组。 增多组的血Eos%、FEV1、FVC、FEV1占预计值%、FEV1/FVC%、FeNO均大于非增多组，差异有统计学意义，增多组CAT评分均低于非增多组，差异有统计学意义。 3 讨论 慢阻肺是一种慢性炎症性疾病，参与这种炎症反应的主要细胞以肺泡巨噬细胞、中性粒细胞和CD8+T细胞为主。但越来越多研究表明，部分COPD患者表现为嗜酸性气道炎症，且该表型患者对激素治疗的反应较好，但对该表型的临床特征研究较少。 嗜酸粒细胞能释放各种细胞因子和颗粒蛋白，破坏气道结构，增加氧化应激，引起气道高反应。诱导痰嗜酸粒细胞是直接反应嗜酸性气道炎症的生物标志物，正常人痰Eos＜1.1%，痰Eos≥3%为能够反应哮喘和COPD患者对糖皮质激素治疗效果好的截断值。本研究中慢阻肺稳定期患者有26.7%诱导痰表现Eos增多，与文献报道的10-40%相似。 FeNO是一种反应气道嗜酸性细胞炎症的检测手段，常常应用于哮喘病人。研究认为，与痰Eos正常的COPD患者相比，痰Eos增高的COPD患者的FeNO水平显著增高，且FeNO与痰Eos呈正相关，r分别为0.485和0.32，FeNO分别以23.5ppb和24ppb为截断值的敏感性和特异性最高。本试验发现增多组FeNO明显高于非增多组，与文献报道相似，因此FeNO对Eos型COPD患者的诊断、监测炎症情况具有重要的参考价值。 嗜酸粒细胞是预测激素治疗反应的生物标志物。以Eos指导急性加重期口服和吸入糖皮质激素治疗，可明显减少急性加重和住院次数。Pascoe S等人发现COPD患者经ICS治疗后，血Eos≥2%组的急性加重减少率明显高于Eos＜2%组（29%vs10%），且基线水平Eos为2-4%、4-6%、≥6%的患者急性加重次数减少率分别为24%、32%、42%。此外，Eos增多患者经ICS长期治疗后FEV1下降速率较非增多的慢，生活质量改善明显。目前研究认为全身和吸入激素治疗对COPD的嗜酸性气道炎症的影响不同，全身性激素治疗后气道嗜酸性炎症明显减少，而吸入治疗对气道炎症相对不敏感，可能为吸入激素在远端小气道的作用量小，而全身性激素不仅对小气道可能产生效果，还可以抑制骨髓产生嗜酸粒细胞。因此，Eos可作为COPD患者应用激素治疗的参考指标。 综上所述，嗜酸粒细胞增多表型的COPD患者肺功能及临床症状优于非增多的COPD患者。虽然Eos增多型的COPD患者逐渐被认识，
两例脆性X综合征系谱分析和遗传咨询
两例脆性X综合征系谱分析和遗传咨询 【摘要】目的探讨脆性X综合征先证者临床表现，探讨系谱遗传特点，对家系成员进行遗传咨询，避免或减少患儿出生。方法通过临床检查与细胞遗传学检查相结合的方法筛查和诊断患者，通过家系调查并绘制系谱图进行系谱分析、遗传咨询和生殖干预。结果脆性X综合征在临床表现、细胞遗传学特点及遗传规律上均有独特之处，为临床遗传咨询、生殖干预提供了重要参考价值。结论系谱分析提示脆性X综合征表现为X连锁隐性遗传方式；对患者及携带者进行生殖干预对减少患儿出生意义重大。 【关键词】脆性X综合征临床表现细胞遗传学检查系谱分析遗传咨询 脆性x综合征(fragileXchromosome,FraX)是由于X染色体畸变导致的以智能低下为主要表现的染色体病。本文就脆性x综合征的临床特点、细胞遗传学特征以及遗传规津进行分析，以期为临床上早期诊断、遗传咨询和生殖干预提供参考依据。 1对象与方法 1.1对象2个脆性x综合征家系共计38名成员，首先根据临床表现筛查，再经细胞遗传学方法确诊患者5例；2名先证者皆为男性。 1．2细胞遗传学检查采用缺乏叶酸199培养基，低浓度小牛血清，低细胞密度，大剂量5－氟尿嘧啶核苷（Ｆudr）进行外周血淋巴细胞培养，诱导脆性X表达，制作染色体标本，Giemas染色，于镜下计数脆性X染色体所占比例〔至少计数100个细胞），脆性X阳性表达率≥
4％即可诊断为FraX。 2结果 2例FraX先证者临床表现及细胞遗传学结果。 3讨论 3.1FraX的临床特点脆性X综合征是最常见的遗传性智力低下性疾病之一，是导致人类智力低下的第二位重要的染色体病，仅次于先天愚型，临床上以男性发病为主，核型为46，Fra（X）Y。在人群中，男性中的FraX频率为1/1000，男性发病率为1/1250；女性中FraX 频率为1/700（约70%无症状，30%轻、中度智力障碍），因此，FraX 基因的总频率为1/850。患者的主要症状是中重度智力低下，头大、长脸、方额、下颌大而突起、大耳朵、大睾丸，有语言障碍，性情孤僻等。有些女性FraX携带者可有轻或中度智力障碍，一般认为是由于该女性携带者的两条X染色体中，正常X染色体随机失活，有异常的X染色体具有活性的结果。 3.2FraX的遗传特点详细调查并追踪家系1，结合基因分析，发现先证者Ⅲ2的致病基因来自母亲Ⅱ3，Ⅱ3的致病基因来自其父Ⅰ1。Ⅱ3和Ⅰ1均无异常表现，其中Ⅰ1称为表型正常的男性传递者，他所具有的FraX基因只是处于前突变阶段，前突变不会致病，但有发展成全突变基因的潜能。Ⅰ1的女儿Ⅱ3获得了该基因，表型仍然正常，但Ⅱ3在胚胎发育和卵细胞发育过程中，使前突变发展成了全突变，因而传递给儿子时儿子便发病，传递给女儿时女儿便为女性携带者，追踪Ⅲ3个体也为携带者。家系1的分析结果表明FraX具有独特的遗传方
copd表型
孙永昌：COPD表型研究进展 来自于：医学论坛网2011-08-02有901次阅读分享 (5) 编辑:练晶军 作者：首都医科大学附属北京同仁医院呼吸科孙永昌李然 慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以气流受限为特征的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展。COPD在临床表现、疾病进展、对治疗的反应性等方面均存在明显的异质性，近年来有学者试图通过不同的表型（phenotypes）对COPD的异质性进行描述和研究，美国学者还就此撰写了共识报告，提出表型是COPD研究的未来方向。通常所说的表型是指某一生物体特定的外观或组成部分，主要受生物的基因型和环境影响。在医学中分型（phenotyping）的最终目标是为了发现具有独特预后或治疗特征的病人组别。对COPD表型进行研究，可使我们更深入地认识COPD的异质性，并由此制定出具有针对性的治疗方案，改善疾病预后。本文就目前该方面的研究进展做简要综述。 一、临床表型 研究提示，COPD部分临床特征可预测疾病急性加重，并且可能与患者病残率和死亡率相关。伯格（Burgel）等在对322例患者8种临床特征（年龄、吸烟指数、FEV1、BMI、急性加重频率、呼吸困难评分和合并症等）分析的基础上,将患者划分为4种临床表型。研究发现患者临床特征在同一表型中具有一致性，但在同一类慢性阻塞性肺病全球创议（GOLD）分级中存在显著差异，提示以上变量可能代表独立的COPD表型，而以FEV1为基础的GOLD分级不能区分不同的临床表型。 年龄和性别 娜娜尼亚（Nanania ）等人比较了老年患者（≥65岁）与年轻患者疾病严重度及合并症发生率。结果显示，老年患者与年轻患者一秒钟用力呼气容积（FEV1）%无显著差异，但CT显示，老年患者气体滞留和肺气肿百分比较高、6分钟步行距离和静息血氧饱和度较低。而年轻COPD患者呼吸困难症状较重、生活质量较差、重度急性加重频率较高。老年COPD 患者合并症（冠心病、高血压、骨质疏松、外周血管病）风险较高。
关于脆性X染色体综合征
关于脆性X染色体综合征 概述： 一个八岁的男孩有类似多动症以及轻度智力障碍，母亲家族男性有智障发病史，男孩被检出下颌骨宽大，尖耳朵，并且睾丸肥大。男孩母亲基因可能存在同义突变。判断男孩患有脆性X染色体综合征，一种X连锁不完全显性遗传病。 该病致病基因存在哪几种突变形式？ 分析及陈述： I．男孩出现下颌骨宽大，尖耳朵，睾丸肥大并且伴有智力障碍，同时母亲家族男性存在遗传智障状况，判定男孩为脆性X染色体综合征。 II．脆性X染色体综合征（Martin-Bell综合征），此为一种单基因遗传病，发病率仅次于Down综合征。 III．脆性X智力低下基因1(fragile X mental retardation gene1，FMR-1)位于X染色体的长臂远端Xq27.3区的脆性部位，含17个外显子和16个内含子，全长38kb。在基因的5'非翻译区存在一段数目可变的(CGG)n重复序列，其上游250bp处存在-CpG岛。正常人群FMR-1基因(CGG)n重复次数在5～50之间。 FMR-1基因内(CGG)n重复序列的不稳定性扩增及CpG岛的异常甲基化是导致脆性X染色体综合征的分子机制。 回答：该病致病基因存在三种动态突变和非动态突变。 1．FMR-Ⅰ基因的前突变(premutation)：MR-Ⅰ基因(CGG)n 结构中n 拷贝数扩增至53～230时，携带者虽然表型正常，但在传代过程中易发生进一步的扩增，使后代的CGG重复数大为增加，并有异常表型出现。智力水平正常。2．FMR-Ⅰ基因的全突变(full mutation)：前突变状态(CGG)53～230次扩增至＞230次时，100%男性携带者表现为典型的脆性X 综合征，53%的女性携带者表现出轻重程度不等的智力低下，此时称为全突变。与智力低下直接相关。3．FMR-Ⅰ基因的回复突变：处于前突变或全突变状态的FMR-Ⅰ基因的CGG结构在传代过程中其拷贝数目会发生一定范围的缩减，称为FMR-Ⅰ基因的回复突变。多发于父源性传递。 4．FMR - 1 基因的非动态突变：指 FM R - 1基因还可发生碱基置换和缺失型突变,这些突变携带者和FMR - 1基因动态突变的临床表现相同, 但缺乏 X 位点脆性特征。 参考文献： 1.《脆性X综合征的FMR-1基因》（张海芸、高锦声）—《中国优生与遗传杂志》（2000-03） 2.《小儿内科学》孙锟 (2009-07) 3.《分子遗传学研究的新焦点—动态突变与脆性X综合征》傅四东（1993.0 4.17） 1453107 王锐
COPD的诊疗
慢性阻塞性肺疾病诊疗规范 （2011年版） 慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，以下简称COPD）是常见的呼吸系统疾病，严重危害患者的身心健康。对COPD患者进行规范化诊疗，可阻抑病情发展，延缓急性加重，改善生活质量，降低致残率和病死率，减轻疾病负担。 一、定义 COPD是一种具有气流受限特征的可以预防和治疗的疾病。其气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与肺脏对吸入烟草烟雾等有害气体或颗粒的异常炎症反应有关。COPD主要累及肺脏，但也可引起全身（或称肺外）的不良效应。肺功能检查对明确是否存在气流受限有重要意义。在吸入支气管舒张剂后，如果一秒钟用力呼气容积占用力肺活量的百分比（FEV1/FVC%）<70%，则表明存在不完全可逆的气流受限。 二、危险因素 COPD 发病是遗传与环境致病因素共同作用的结果。 （一）遗传因素。 某些遗传因素可增加COPD发病的危险性。已知的遗传因素为α1-抗胰蛋白酶缺乏。欧美研究显示，重度α1-抗胰蛋白酶缺乏与肺气肿形成有关。我国人群中α1-抗胰蛋白酶
缺乏在肺气肿发病中的作用尚待明确。基因多态性在COPD 的发病中有一定作用。 （二）环境因素。 1.吸烟：吸烟是发生COPD最常见的危险因素。吸烟者呼吸道症状、肺功能受损程度以及患病后病死率均明显高于非吸烟者。被动吸烟亦可引起COPD的发生。 2.职业性粉尘和化学物质：当吸入职业性粉尘，有机、无机粉尘，化学剂和其他有害烟雾的浓度过大或接触时间过长，可引起COPD的发生。 3.室内、室外空气污染：在通风欠佳的居所中采用生物燃料烹饪和取暖所致的室内空气污染是COPD发生的危险因素之一。室外空气污染与COPD发病的关系尚待明确。 4.感染：儿童期严重的呼吸道感染与成年后肺功能的下降及呼吸道症状有关。既往肺结核病史与40岁以上成人气流受限相关。 5.社会经济状况：COPD发病与社会经济状况相关。这可能与低社会经济阶层存在室内、室外空气污染暴露，居住环境拥挤，营养不良等状况有关。 三、发病机制 烟草烟雾等慢性刺激物作用于肺部，使肺部出现异常炎症反应。COPD可累及气道、肺实质和肺血管，表现为出现以中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞浸润为主的慢性炎症反应。
COPD治疗新进展(优质参考)
论预防谈“三早” COPD早期防治要点 北京大学第三医院姚婉贞我国流行病学调查数据显示，在40岁以上成年人中，慢性阻塞性肺疾病（COPD）总患病率高达8.2%。20世纪70年代，我国COPD 的治疗重点是慢性肺源性心脏病；20世纪80年代，收治的多位慢性呼吸衰竭患者；20世纪90年代，虽然我国COPD防治工作已经移至急性加重期和稳定期，但仍比较落后。 美国胸科学会/欧洲呼吸学会（ATM/ERS）的COPD指南以及全球慢性阻塞性肺疾病防治创议（GOLD）均指出，COPD是一种可防可治的疾病。因此，研究者对COPD的关注焦点逐渐意向如何早防、早治，尽可能通过早期干预延缓肺功能下降，改变COPD临床进程。 COPD早期预防 COPD的一级预防 戒烟可以显著延缓COPD患者肺功能下降速率，这已在多项研究中得到验证，因此，戒烟是COPD患者治疗的基石。 针对职业接触、室内外空气污染等外源性因素，可以通过加强宣传教育和自我约束、厂矿安全管理已经政府干预控制尽量避免，这需要政府、企业和民众共同参与和努力。 COPD的二级预防 早发现：勿忽视咳嗽
咳嗽COPD典型临床表现为慢性咳嗽、咳痰及活动后气短，但由于个体差异，部分患者在咳嗽、咳痰症状发生时间可先于气流受限多年，而部分患者在出现明显气流受限前并无慢性咳嗽咳痰病史，甚至部分患者无任何症状。 对于北京市延庆地区农民COPD流行病学调查发现，无症状COPD患者占COPD患者的42%，占整个调查人群的3.8%；COPD 患者多为60岁以上老年人，常将COPD症状（如活动后气短）归结为正常衰老，直至因急性发作或呼吸困难严重影响日常生活时才就诊；超过90%的COPD患者正在或曾经吸烟，且常忽视咳嗽、咳痰、活动后气短等COPD早期症状，认为这是吸烟者常见表现，甚至错误地认为吸烟可促进排痰。 因此，有必要在全民中加强COPD宣传教育，告知吸烟者及早发现COPD早期信号，以便及早发现COPD早期信号，以便及时就医。 早诊断：重视肺功能检查早诊断是早治疗前提。我国COPD 流行病学调查结果显示，仅35.1%的COPD患者曾被“诊断”为“肺气肿、支气管炎或COPD”等，仅6.5%的COPD患者接受肺功能检测。这表明，我国COPD存在严重诊断不足。 由于肺功能检查是诊断COPD金标准，因此有必要在各级医院（尤其是基层医院）普及肺功能检查。对于存在COPD危险因素接触史的成年人，也有必要通过普查、重点筛查和定期健康体检及早进
COPD中文指南(2011新版)
慢性阻塞性肺疾病诊疗规范2011版 慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，以下简称COPD）是常见的呼吸系统疾病，严重危害患者的身心健康。对COPD患者进行规范化诊疗，可阻抑病情发展，延缓急性加重，改善生活质量，降低致残率和病死率，减轻疾病负担。 一、定义 COPD是一种具有气流受限特征的可以预防和治疗的疾病。其气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与肺脏对吸入烟草烟雾等有害气体或颗粒的异常炎症反应有关。COPD主要累及肺脏，但也可引起全身（或称肺外）的不良效应。肺功能检查对明确是否存在气流受限有重要意义。在吸入支气管舒张剂后，如果一秒 /FVC%）<70%，则表明存在不完全钟用力呼气容积占用力肺活量的百分比（FEV 1 可逆的气流受限。 二、危险因素 COPD 发病是遗传与环境致病因素共同作用的结果。 （一）遗传因素。 -抗胰蛋白某些遗传因素可增加COPD发病的危险性。已知的遗传因素为α 1 -抗胰蛋白酶缺乏与肺气肿形成有关。我国人群酶缺乏。欧美研究显示，重度α 1 -抗胰蛋白酶缺乏在肺气肿发病中的作用尚待明确。基因多态性在COPD的中α 1 发病中有一定作用。 （二）环境因素。 1.吸烟：吸烟是发生COPD最常见的危险因素。吸烟者呼吸道症状、肺功能受损程度以及患病后病死率均明显高于非吸烟者。被动吸烟亦可引起COPD的发生。 2.职业性粉尘和化学物质：当吸入职业性粉尘，有机、无机粉尘，化学剂和其他有害烟雾的浓度过大或接触时间过长，可引起COPD的发生。 3.室内、室外空气污染：在通风欠佳的居所中采用生物燃料烹饪和取暖所致的室内空气污染是COPD发生的危险因素之一。室外空气污染与COPD发病的关系尚待明确。
copd表型
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以气流受限为特征的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性发展。COPD在临床表现、疾病进展、对治疗的反应性等方面均存在明显的异质性，近年来有学者试图通过不同的表型（phenotypes）对COPD的异质性进行描述和研究，美国学者还就此撰写了共识报告，提出表型是COPD研究的未来方向。通常所说的表型是指某一生物体特定的外观或组成部分，主要受生物的基因型和环境影响。在医学中分型（phenotyping）的最终目标是为了发现具有独特预后或治疗特征的病人组别。对COPD表型进行研究，可使我们更深入地认识COPD的异质性，并由此制定出具有针对性的治疗方案，改善疾病预后。 一、临床表型 研究提示，COPD部分临床特征可预测疾病急性加重，并且可能与患者病残率和死亡率相关。伯格（Burgel）等在对322例患者8种临床特征（年龄、吸烟指数、FEV1、BMI、急性加重频率、呼吸困难评分和合并症等）分析的基础上,将患者划分为4种临床表型。研究发现患者临床特征在同一表型中具有一致性，但在同一类慢性阻塞性肺病全球创议（GOLD）分级中存在显著差异，提示以上变量可能代表独立的COPD表型，而以FEV1为基础的GOLD分级不能区分不同的临床表型。 年龄和性别 娜娜尼亚（Nanania ）等人比较了老年患者（≥65岁）与年轻患者疾病严重度及合并症发生率。结果显示，老年患者与年轻患者一秒钟用力呼气容积（FEV1）%无显著差异，但CT显示，老年患者气体滞留和肺气肿百分比较高、6分钟步行距离和静息血氧饱和度较
低。而年轻COPD患者呼吸困难症状较重、生活质量较差、重度急性加重频率较高。老年COPD患者合并症（冠心病、高血压、骨质疏松、外周血管病）风险较高。 性别亦与COPD临床表现相关。COPD基因研究显示，无论GOLD分级高低，女性患者症状较重、急性加重及合并症（胃食管反流和阻塞性睡眠呼吸暂停）发生率较高。并且女性患者生活质量较差，较易出现抑郁、焦虑且对烟草毒性作用敏感。邦（Bon）等的研究发现，在FEV1相近时，男性患者肺气肿改变较女性显著。 BODE指数 研究发现，BODE指数[包括体质指数（BMI）、气流阻塞程度、呼吸困难及运动耐力]对COPD患者死亡风险的预测价值优于FEV1。原因不明的体重下降是COPD患者死亡率增加的独立预测因子。一项法国研究显示，在4088例慢性支气管炎或肺气肿患者中，23%的男性和30%的女性存在营养不良（BMI<20），且BMI与气流受限程度显著相关。 呼吸困难为影响患者生活质量的主要症状，一项日本研究发现，呼吸困难程度与患者5年生存率显著相关（P < 0.001）。 临床症状 慢性咳嗽和咯痰是COPD主要症状，与肺功能加速下降以及呼吸道感染危险性增加相关。然而，具有这种慢性支气管炎症状的COPD患者，其临床与放射学表现有何特征，尚不明确。 一项比较了有无慢性支气管炎患者的临床和影像资料的COPD基因研究发现，慢支组吸烟量较大、生活质量（SGRQ评分）较差、呼吸困难评分和疾病综合评分（BODE指数）均较高，加重次数较多。肺部CT显示，慢支组肺气肿程度低于对照组，但反映COPD严重度的指标FEV1无显著差异。结果提示，通过评估COPD患者中的慢性支气管炎症状可能检出一个频繁加重和入院且预后较差的高危组别。 急性加重 急性加重是COPD病程中的重要事件。赫斯特（Hurst）等的最新研究结果证实，“频繁发作COPD”是一种独特的疾病表型，并指出，询问患者既往急性加重频率是预测以后COPD加重频率最便捷和准确方法之一。 该研究意义在于，医师可以早期干预中度COPD患者中的频繁加重型，而对非频繁加重的重度COPD患者不一定采取以减少急性加重为目的的干预措施。