叶绿素的提取及理化性质的鉴定精编版
叶绿素的提取及理化性
质的鉴定
文件编码（008-TTIG-UTITD-GKBTT-PUUTI-WYTUI-8256）
植物生理学实验
叶绿体色素的提取分离及其理化性质
姓名
学号
系别
班级
实验日期
同组姓名
摘要：为探究植物叶绿素理化性质，根据不同的叶绿体色素分子结构不同，在有机溶剂中的溶解性和吸附剂上的吸附性差异，本实验在提取菠菜叶片叶绿体色素（叶绿素和类胡萝卜素）后，利用纸层析法将不同的色素分离的方法，对植物叶绿素的理化性质进行观察与检验。
一、实验原理及实验目的
实验原理：
1、提取: 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。
2、分离: 当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。
3、理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。
分子吸收光能后，从基态转变到激发态。叶绿素分子有两种单线激发态，对应两个主要的光吸收区。
分子在激发态停留的时间不超过数纳秒（10-9秒）
由激发态回到基态的过程称为衰变（Decay)。
叶绿素a：C
55H
72
O
5
N
4
Mg，MW=
叶绿素b：C
55H
70
O
6
N
4
Mg，MW=
胡萝卜素：C
40H
56
， MW=
叶黄素：C
40H
56
O
2
， MW=
实验目的：
以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素;以纸层析法分离其成分;鉴定叶绿体色素的理化性质.
二、实验材料和方法
1、实验材料：菠菜
2、实验用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光
镜、量筒、烧杯、试管等
3、实验试剂：丙酮、碳酸钙、层析液（石油醚：丙酮=25：3)，20%KOH-
甲醇、乙醚、1%HCl、醋酸铜
三、实验步骤
1、叶绿体色素的提取
（1）取新鲜菠菜叶片2克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵;
（2）加入少许石英砂和CaCO
,再加入无水丙酮10ml,研磨成匀浆,再加丙
3
酮15ml;
（3）用漏斗滤去残渣,得叶绿体色素提取液(置于暗处).
2、纸层析分离叶绿体色素
（1）层析样纸制备,将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条,将一端剪成中央留约1cm×的窄条;
（2）点样,用细玻璃棒蘸取叶绿体色素提取液点于层析纸的窄条上端中央部,用吹风机吹干后在原处重复点样7-8次;
（3）展层,在层析缸中加入3-5ml层析推动液,然后将已点样的层析纸插入缸的侧壁槽内,调节纸条使窄条1/2部分浸入推动液中,盖好盖子,于阴暗处展层约10min,即可在层析纸上分辨出4种不同的清楚色层;
3、叶绿体理化性质的观察
荧光现象的观察：取浓的叶绿体色素提取液化3ml,在透射光和反射光下观察叶绿体色素提取液的颜色。
皂化作用：在观察过荧光现象的叶绿体色素提取液中加入2ml的20%KOH-甲醇溶液,充分混匀.吹打5分钟;沿试管壁缓慢加入3ml乙醚+4ml的蒸馏水,边滴加边摇动,直至看到溶液逐渐分为两层为止. 对照不加KOH-甲醇溶液。
叶绿素分子中Mg2+的取代作用：取2只试管,分别加入2ml叶绿体色素提取液,第1只作为对照,第2只加入数滴5%HCl,摇匀,观察溶液颜色变化.当溶液变褐后,再加入少量醋酸铜粉末,并微加热.与对照比较,观察溶液颜色变化,并解释原因。
四、实验结果与讨论
1、纸层析分离叶绿体色素实验中,用铅笔在层析纸上指出4种色层的轮廓,并注明色层的名称和颜色。
2、观察荧光现象的实验中,在透射光和反射光下观察叶绿体色素提取液的
颜色.说明颜色有何不同并解释原因。
答：现象：在透射光下叶绿素提取液为蓝绿色，在反射光下为红色。
原因：叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色；反射光呈蓝绿色是因为叶绿素对蓝绿色光的吸收很少，而对于其他颜色光的吸收很多，所以会呈现出蓝绿色的反射光。
3、皂化反应中,说明上下各层液所含色素种类。
答：试管中溶液出现明显的分层现象，上层显黄色，下层显绿色，底部有明显的乳白色沉淀。原因：上层溶液溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素，下层溶液溶有皂化的叶绿素a和叶绿素b及少量的叶黄素。底部的乳白色沉淀是叶绿体色素提取液中某些成分与碱发生了化学反应的产物。
4、叶绿体色素提取液中分别加入5%HCl和醋酸铜粉末,观察溶液颜色变化,并解释原因。
答：现象：加入5%HCl后溶液变为棕褐色，加入醋酸铜粉末并微微加热后溶液由褐绿色慢慢变深，最后变为墨绿色。
原因：在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素。
5、研磨提取色素时加入CaCO3有什么作用
答：在研磨过程中，会产生有机酸，电离出氢离子，会取代叶绿素中的镁离子，形成去
镁叶绿素，无色，加碳酸钙就是为了和有机酸作用，减少氢离子，防止叶绿素被破坏。
6、哪些条件会影响实验结果
答：（1）色素的提取与分离过程中由于见光情况比较严重，导致实验最后的结果有误差。
（2）研磨绿叶至细而匀的程度和研磨过程的速度；
参考文献：
王英典，刘宁.植物生物学实验指导.北京：高等教育出版社.（第2版）