高效超保真DNA聚合酶使用说明书
生物DNA连接酶,聚合酶RNA聚合酶,连接酶DNA解旋酶
限制性核酸内切酶（以下简称限制酶）：限制酶主要存在于微生物（细菌、霉菌等）中。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。例如，从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A 之间将这段序列切开。目前已经发现了200多种限制酶，它们的切点各不相同。苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。在基因工程中起作用。 DNA连接酶：主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键，起连接作用，在基因工程中起作用。 DNA聚合酶：催化脱氧核苷酸之间的聚合反应。主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起做用。 DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。 DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。 RNA聚合酶（又称RNA复制酶、RNA合成酶）的催化活性：RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。真核生物RNA聚合酶：真核生物的转录机制要复杂得多，有三种细胞核内的RNA聚合酶：RNA 聚合酶I转录rRNA，RNA聚合酶II转录mRNA，RNA聚合酶III转录tRNA和其它小分子RNA。在RNA复制和转录中起作用。 反转录酶：属RNA指导的DNA聚合酶，具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指导的DNA聚合酶。在分子生物学技术中，作为重要的工具酶被广泛用于建立基因文库、获得目的基因等工作。在基因工程中起作用。
常用DNA酶的总结.
1. T4DNA连接酶: 本酶催化相邻DNA链的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯键结合的反应，（将已有的两个DNA片段连接成为一条DNA链的酶，常用于基因工程，将目的基因连在质粒载体上，作用于两脱氧核糖核苷酸间的磷酸二脂键），需ATP作辅酶。本酶不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接，也可以催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。 T4DNA连接酶可连接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。无论是T4DNA连接酶，还是大肠杆菌DNA 连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。T4 DNA连接酶常用于催化双链DNA平末端或互补粘性末端之间的连接反应，也能催化双链RNA 5'-磷酸末端和3'-羟基末端间的连接。还可以修复双链DNA、RNA 或DNA/RNA杂交双链中的单链切口。以上反应均需消耗ATP。 粘末端的连接反应: 插入片段和载体的摩尔浓度比特别重要，此比例在2-6之间最好，低于2:1就会导致较低的连接效率，高于6:1则会导致多个插入。摩尔比请按载体与插入片段 DNA浓度及分子大小来计算。 平滑末端的连接反应：平滑末端的连接反应与突出末端相比反应较慢(其Km值约为突出末端的100倍)。进行平滑末端的连接反应时，可提高DNA浓度，将使用酶量增加到突出末端量的2～5倍左右。 与粘粒或噬菌体进行连接反应：可使载体和插入DNA的摩尔比调整为1:1，同时增大DNA浓度以便取得良好效果。 (0.05-0.1 μg／ul以上)。 反应温度：该酶的最适温度为37℃，由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在16℃下进行。若反应1-2小时左右的话也可在室温下进行反应。 抑制剂：T4 DNA连接酶要求Mg 2+，因此螯合Mg 2+的EDTA 的存在会阻碍反应。将溶解于含有高浓度EDTA缓冲液中的 DNA准备作为样品使用时，最好先用灭菌蒸馏水或TE缓冲液进行置换。 2. T4 DNA聚合酶： T4DNAPolymerase，即T4DNA聚合酶，是一种模板依赖的DNA聚合酶，可以依赖于DNA模板对5' 端突出末端进行补平；同时可对3' 端突出末端进行削平。也可以在结合有引物的单链DNA模板上，从5'→3'方向催化DNA合成反应。 特点：T4DNAPolymerase由于同时具有5'→3' DNA聚合酶活性和
DNA聚合酶和DNA连接酶的比较
DNA聚合酶和DNA连接酶的比较 “红细胞”专题复习 山东省青岛市第九中学辛建福 红细胞不仅在动物体内起着非常重要的生理作用，还作为生物科学某些领域研究的好材料, 且课本涉及的地方有多处。因此，有关红细胞知识点常成为高考命题的切入点。现将有关的考点归纳总结如下：
考点1.组成细胞的分子 例1.“朴雪”乳酸亚铁口服液可以有效地治疗人类缺铁性贫血症，这是因为其中的Fe2+进入人体后能（） A.调节血液的酸碱平衡 B.调节血液的渗透压 C.构成中的血红蛋白 D.促使更多红细胞的产生 解析:此题考查红细胞内血红蛋白特有的无机盐组成和无机盐的生理作用。某些无机盐可以用来构造细胞内某些复杂化合物的重要组成部分，如Fe2+进入人体后构成血红蛋白的主要成分，Mg2+是叶绿素分子必需的成分。故答案选C。 答案: C 考点2.细胞的基本结构 例2.若从成熟的红细胞上获取细胞膜，可用来处理细胞的试剂是（） A.10%盐酸 B.蛋白酶 C.磷脂酶 D.清水 解析:此题考查成熟红细胞膜的化学物质组成和分离出纯细胞膜的方法。获取细胞膜就是让其破裂，让内部物质释放出。10%盐酸浓度高，使红细胞皱缩甚至杀死；脂类和蛋白质是细胞膜的主要组成物质，故蛋白酶、磷脂酶均使膜结构遭破坏；清水使细胞渗透吸水胀破，内部物质流出只剩细胞膜。故选D。
答案: D 例3.人的红细胞和精子的寿命都很短，这一事实体现了（） A.环境因素的影响 B.功能对寿命的决定 C.核质相互依存的关系 D.遗传因素的作用 解析:此题考查红细胞的寿命和细胞的完整性。细胞的各个部分不是彼此孤立的，而是互相紧密联系、协调一致的，实际上一个细胞就是一个有机的统一整体，细胞只有保持完整性，才能够正常地完成各项生命活动。例如人体成熟的红细胞、人工去核的细胞和丢弃大部分细胞质的精子细胞，一般不能存活多久，有力地说明细胞完整性的重要意义。故答案选C。 答案：C 考点3.细胞的生命历程 例4．青蛙红细胞的分裂方式是（） A.二分裂 B.无丝分裂 C.有丝分裂 D.减数分裂 解析:此题考查非哺乳类动物红细胞的结构和蛙的红细胞独特的分裂方式。无丝分裂的特点是在分裂开过程中核膜、核仁并不消失，也无染色体变化和纺锤体丝出现，它是真核细胞的一种分裂方式，如蛙的红细胞分裂方式就是这样。二分裂是指单细胞生物（如细菌）一种常见的繁殖方式，进行分裂生殖时，先是核逐渐延长，然后逐渐分成两个新个体。虽然两者都要“一分为二”，但分裂的机理和本质有所不同。人和哺乳动物
T4 DNA 连接酶
T4 DNA Ligase即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需A TP作为辅助因子。同时T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA 或DNA/RNA杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。 用途：T4 DNA Ligase常用于DNA片段和载体、linker或adaptor等的连接。也可以用于缺刻修复及Ligase 介导的RNA检测。 来源：本T4 DNA Ligase由大肠杆菌表达，表达基因的来源为T4嗜菌体。 活性定义：One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of lambda DNA in 30 min at 16℃in 20 μl of the assay mixture containing 50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml BSA and a 5'-DNA termini concentration of 0.12 μM(300 μg/ml)。200U等于1个Weiss unit，以Weiss unit计，本产品共1000单位。 纯度：不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，满足常规连接反应要求。 酶储存溶液：20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA and 50%(v/v)glycerol。 10X Ligation Buffer：400 mM Tris, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM A TP。 失活或抑制：65℃孵育10分钟可以导致T4 DNA Ligase失活；NaCl或KCl浓度大于200mM时强烈抑制T4 DNA Ligase。 包装清单： 产品编号产品名称包装 D7008-1 T4 DNA Ligase(1000U/μl) 200,000U D7008-2 10X Ligation Buffer 1.5ml －说明书1份 保存条件： -20℃保存。 注意事项： 对于普通的转化大肠杆菌的操作，不必对连接产物进行纯化，连接产物可以直接用于转化。但用电转方法转化大肠杆菌时，通常宜先用DNA纯化试剂盒或酚氯仿抽提方法等纯化DNA，然后再进行电转。 需进行平端连接或快速连接时，推荐使用碧云天的快速DNA连接试剂盒(D7002/D7003)。T4 DNA Ligase 可以进行平端连接，但效率较低。 普通的连接反应不必进行凝胶电泳观察。如果需要对于连接产物进行凝胶电泳观察，推荐先在65℃孵育10分钟使T4 DNA Ligase失活，以避免T4 DNA Ligase和DNA结合导致的条带位置迁移(band shift)。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。