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RLM_RACE法扩增獐茅液泡膜Na_H_逆向转运蛋白基因5_cDNA末端序列

RLM_RACE法扩增獐茅液泡膜Na_H_逆向转运蛋白基因5_cDNA末端序列

西北植物学报,2007,27(5):0859-0863

Acta Bot.Boreal. Occident.Sin.

文章编号:1000 4025(2007)05 0903 05*

RLM RACE法扩增獐茅液泡膜Na+/H+逆向

转运蛋白基因5 cDNA末端序列

王景艳1,张高华2,苏 乔2,安利佳2,刘兆普1*

(1南京农业大学资源与环境科学学院,南京210095;2大连理工大学生物科学与工程系,辽宁大连116024)

摘 要:根据已获得的盐生植物獐茅(A elur op us littor al is var.sinensis Debeaux)液泡膜N a+/H+逆向转运蛋白(N a+/H+antipor ter)基因部分cDN A片段,设计2条特异引物(G SP1、GSP2),采用RL M RA CE(RN A lig ase medi ated rapid amplificat ion of5 and3 cD NA ends)法获得了其5 cDN A末端序列,并找出了转录起始位点。该片段长816bp,与芦苇液泡膜N a+/H+逆向转运蛋白基因序列同源性最高达91%,与拟南芥、盐角草、水稻、大麦、小麦的同源性分别为81%、82%、86%、87%和81%,为该基因全长的克隆及启动子的研究奠定了基础。与其它测定基因转录起始位点的方法相比,R LM R ACE方法更快捷、简便、准确。

关键词:獐茅;Na+/H+逆向转运蛋白;RL M RA CE;5 cD NA末端;转录起始位点

中图分类号:Q785文献标识码:A

Amplification of5 cDNA end of Aeluropus littoralis Tonoplast

Na+/H+Antiporter by RLM RACE

WANG Jing y an1,ZH AN G Gao hua2,SU Qiao2,AN Li jia2,LIU Zhao pu1* (1College of Resources and En viron men tal S cien ce,Nanjing Agricultural U niver sity,Nanjing210095,China;2Departm ent of Bio

s cien ce an d Biotechnology,Dalian University of Techn ology,Dalian,Liaoning116024,China)

Abstract:RLM RACE is a new technique o f amplify ing gene ends.Based on par t o f know n cDNA sequence, tw o specific PCR prim ers w ere desig ned.The5 cDN A ends of Na+/H+antipo rter g ene on the to noplast of Aelur op us littoralis w ere cloned by RLM RACE and the transcription initiatio n site w as detected.The am plified frag ment w as816bp in leng th and the nucleotide sequence analysis show ed91%similarity to the to no plast Na+/H+antiporter gene o f P hr agm ites austr alis(PcN H X1),81%to Ar abidop sis thaliana(At NH X1),82%to S alicor nia eur op aea(SeNH X1),86%to Ory z a sativa(OsN H X1),87%to H ord eum vul gare(H vNH X1)and81%to T r iticum aestiv um(TaNH X1).T he result pro vided foundation for cloning the full sequence and study ing the prom oter of the g ene.RLM RACE(RNA ligase m ediated rapid am plifi cation of5 and3 cDNA ends)is m ore rapid and simple comparing w ith the com mon metho ds for determ i ning g ene transcription initiation sites.

Key w ords:Aelurop us littoralis;Na+/H+antiporter;RLM RACE;5 cDNA end;transcription initiation site

Na+/H+逆向转运蛋白驱动Na+/H+跨膜运输,调节细胞内的pH值、细胞体积以及Na+浓度,在植物耐盐性方面起着重要作用[1]。獐茅(A elur o p us littor alis var.sinensis Debeaux)是一种生长于

*收稿日期:2006 10 19;修改稿收到日期:2007 04 03

基金项目:国家海洋863计划(2003AA627040);辽宁省科技基金(2001101001)

作者简介:王景艳(1982-),女(汉族),硕士研究生,主要从事植物耐盐分子生物学。E mail:jyw ang129@http://www.wendangku.net/doc/7cf7fdd776eeaeaad1f3300b.html *通讯作者:刘兆普,教授。E mail:sea@http://www.wendangku.net/doc/7cf7fdd776eeaeaad1f3300b.html

海滨盐滩的单子叶禾本科盐生植物,也是盐碱地区的一种优良牧草。但是目前对于獐茅耐盐机理研究甚少,尤其是分子生物学方面的研究还是一片空白。本研究采用RLM RACE法,快速分离了其液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的5 末端序列,同时确定了其转录起始位点,为进一步研究该基因的功能及其调控机制奠定了基础,也为研究獐茅的耐盐机制提供了理论依据。

确定基因转录起始位点是研究其表达调控机制的前提。一般常用测定基因转录起始位点的方法主要有3种:核酸酶S1作图法(S1 m apping)、RNase 作图法(RNase m apping)和引物延伸法[2],但3种方法都要经过杂交和测序来确定基因转录起始位点,且需要在实验之前明确待检基因的DNA序列,较为繁琐。而本实验所采用的RLM RACE法利用小牛肠磷酸激酶(CIP)可与无5 端帽子结构的m R NA5 端磷酸基团作用的原理,从而消除不完整的mRNA和其它RNA的干扰,而完整m RNA由于帽子结构的保护不会受到影响。然后通过烟草酸焦磷酸酶(TA P)处理全长mRNA,使之去除帽子结构,暴露磷酸基,从而在T4RNA连接酶作用下,将锚定接头连接到完整的mRNA5 端,反转录产物在基因特异引物与锚定引物的作用下进行PCR扩增,获得包括转录起始位点在内的完整cDNA,测序后在得到基因5 端序列的同时也确定了其转录起始位点。因此,RLM RA CE法无论在确定转录起始位点方面,还是在获得完整的m RNA序列方面,都要优于其它的方法,而且更加准确、简便、快捷。

1 材料和方法

1.1 材料的采集与培养

实验材料獐茅(A elur op us littor alis v ar.sinen sis Debeaux)采自辽宁省大连市营城子海滨盐田,在温室中用珍珠岩盆栽培养,H o ag land营养液浇灌,营养繁殖,待植株成活后选择健康植株进行实验。根据本实验室已克隆的獐茅液泡膜N a+/H+逆向运输蛋白的部分基因片段自行设计引物,并由TaKaRa(大连)公司合成,RACE试剂盒购于In v itro gen公司。

1.2 獐茅叶片总RNA的提取

用含400m mol/L NaCl的H o ag land营养液处理獐茅24h,T rizol法提取植株叶片总RNA,DEPC 处理水溶解RNA沉淀。1.3 5 末端的获得

5 RACE按照Invitrogen公司的GeneRacer 试剂盒说明操作。取3 L(约5 g)RNA,先用小牛肠磷酸激酶(calf intestinal pho sphatase,CIP)处理,使不完整的mRNA及其它RNA去磷酸化,再用烟草酸焦磷酸酶(to bacco acid pyr ophosphatase, T AP)处理,使完整m RNA脱帽,暴露出5 端磷酸基之后,再加入250ng的RNA接头以T4RNA连接酶连接。每次处理后以酚/氯仿抽提。以此RNA 作为模板,在反转录酶(AM V)作用下,用带有3 RA CE Adapter的Olig odT引物进行反转录合成cDNA,反应条件为45 60m in,85 15m in,4 保存。根据已知獐茅部分cDNA片段设计5 反向特异性引物GSP1(5 GCACAACTGACGT GGCAT CATT C 3 )和巢式引物GSP2(5 CAAGAAAATC CCCAACCTCCAGTG 3 )。

取以上合成的cDNA1 L为模板,以GeneRa cer TM5 Primer和GSP1引物进行PCR扩增,接着以GeneRacer TM5 Nested Primer和GSP2引物进行巢式PCR扩增。第一次PCR反应条件为94 2 m in,94 30s,72 1min,5个循环;94 30s, 70 1m in,5个循环;94 30s,60 45s,72 1 m in,25个循环;最后72 延伸10m in。巢式PCR 反应条件为94 2m in;94 30s,65 30s,68 2min,20个循环;68 延伸10min。将得到的PCR 片段纯化、回收,TA克隆法进行克隆,将菌液送至上海申能博彩生物公司测序。

1.4 5 末端序列分析

通过BlastN完成獐茅5 末端序列与其它物种的同源性进行比较,采用T reev iew和M eg a3软件完成其系统进化树。

2 结果与分析

2.1 PC R结果及序列分析

PCR扩增得到约800bp左右的片段,命名为A lNH X1,经巢式PCR后,产物的特异性有所提高(图1,图2)。测序后发现该片段产物长816bp,包括5 非编码区387个核苷酸,翻译起始密码子A TG 和N端143个氨基酸编码序列(图3)。所取3个克隆的测序结果显示,5 非编码区均相同,故根据RLM RACE原理推测转录起始位点可能只有1个,即为序列的第1个碱基a,符合转录起始位点为a或g的特征[3]。

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RLM_RACE法扩增獐茅液泡膜Na_H_逆向转运蛋白基因5_cDNA末端序列

图1 第一次PCR 电泳结果

图2 巢式PCR 电泳结果

M.DL 2000DNA marker;P.PCR 产物

M.DL2000DNA m ark er;P.PCR 产物

Fig.1 T he fir st PCR products

Fig.2 T he nested PCR pro ducts

M.DL2000DNA marker;P.PCR product

M.DL2000DNA m ark er;P.PCR

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product

图3 獐茅液泡膜Na +/H +逆向转运蛋白基因(A lN H X 1)5 cD NA 末端核苷酸及氨基酸序列

序列中小写字母表示5 非编码区,首位小写字母是转录起始位点(右上角用*标出),加框部分(AT G)是起始密码子

Fig.3 N ucleotide sequences and deduced amino acid sequences fo r A lN H X 15 cDN A end fr om A elur op us littor alis

T he sequen ce in the low er cas e w as 5 U TR,the first small letter (a)w as the tran scription initiation site and

the tran slation s tart code w as boxed(ATG)

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5期 王景艳,等:R LM RA CE 法扩增獐茅液泡膜N a +/H +逆向转运蛋白基因5 cDN A 末端序列

2.2 序列同源性分析

通过BlastN 比较发现,该片段与芦苇液泡膜Na +

/H +

逆向转运蛋白基因(PcNH X 1,登录号:AB211145,下同)序列同源性最高,达到91%,而与拟南芥(AtNH X 1,AF056190)、盐角草(SeNH X 1,AY131235)、水稻(OsN H X 1,AY324877)、大麦(H vNH X 1,AB089197)、小麦(TaNH X 1,AY461512)的液泡膜Na +/H +逆向转运蛋白基因序列同源性分

别为81%、82%、86%、87%和81%。液泡膜Na +/H +逆向转运蛋白在细胞液泡膜上执行将Na +区隔到液泡的功能,系统发育树分析后发现,AlNH X 1与

PcNH X 1、OsN H X 1及H vNH X 1关系较近,AlN H X 1与质膜Na +/H +逆向转运蛋白基因序列如拟南芥(A tSOS 1,AF256224)、水稻(OsSOS 1,AY785147)、小麦(TaSOS 1,AY326952)的同源关系较远(图4),它们在质膜上执行Na +外排的功能[13]

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图4 獐茅A lN H X 1的系统发育树

图上数字表示两分支的同源性,数字越大表示同源性越高

F ig.4 T he phylog enetic t ree of A lN H X 1

Th e numbers mean the similarity betw een tw o embranchmen ts ,the more hig her

of the numb er,the m ore similarity of them

3 讨 论

随着分子生物学技术的发展,基因表达调控机制的研究已成为当代分子生物学研究的热点,而基因转录起始位点的确定是研究其启动子的前提。Na +/H +逆向转运蛋白是目前研究较为深入的耐盐基因之一,耐盐植物Na +/H +逆向转运蛋白的克隆为作物耐盐基因工程提供了优良的基因来源。目前

已经在许多盐生植物和非盐生植物中发现了N a +

/H +逆向运输蛋白活性[4 12],但是关于该基因启动子方面的研究只在拟南芥中报道过[13],盐生植物的Na +

/H +

逆向转运蛋白基因表达调控方面的研究还未见报道。本实验采用RLM RA CE 法快速、准确地克隆了盐生植物獐茅液泡膜Na +/H +逆向转运蛋白基因的5 末端序列,并找到了转录起始位点,为以后的全长克隆及其启动子的研究奠定了基础。

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2.中文期刊文献著录格式:

序号 全部作者(括号中注明姓名的中文) 论文题目 期刊名称(英文亦可用拉丁文,斜体并在括号 中注明中文期刊名) 发表年份 卷(期) 页码(in Chinese).

例如:

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3.教材、实验指导、论文集和专著按以下格式著录:

序号 全部作者 书名 出版地 出版社名 出版年份 页码。 例如:

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未注明事项请继续沿用 西北植物学报 参考文献的传统著录格式。E mail:x bzw xb@v http://www.wendangku.net/doc/7cf7fdd776eeaeaad1f3300b.html

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