诱变实验

WH-2的微波诱变育种

1.微波诱变原理：

微波作为一种高频电磁波，能刺激水、蛋白质、核苷酸、脂肪和碳水化合物等极性分子快速震动。在2450MHz频率作用下，水分子能在1s内来回震动2.45×108次。这种震动引起摩擦，使得单孢子悬液内DNA分子间强烈摩擦，孢子内DNA分子氢键和碱基堆积化学力受损，引起DNA结构发生变化，从而发生遗传变异；微波具有传导作用和极强的穿透力，在引起细胞壁分子间强烈震动和摩擦时，改变其通透性，使细胞内含物迅速向胞外渗透。在试验中，究竟是微波辐射直接作用于微生物DNA引起变异，还是其穿透力使细胞壁通透性增加，导致核质变换而引起突变，目前尚不明了，有待进一步研究。

2.确定诱变时所用的适宜出发菌的浓度

准备器材：生长至对数期WH-2菌液、生理盐水、6个小瓶、7个滚管、1ml注射器8支、5ml注射器6支、冰、水浴锅（80度）。

实验方法：1.分别称取0.075g琼脂加入到7个滚管中，再将按40ml培养基的量加的储液A,B,C,F,葡萄糖和水的溶液分别吸取4.8ml加入到7个滚管中，压盖。

2.分别吸取9ml生理盐水加入到6个小瓶中，压盖。

3.对小瓶和滚管除氧，除氧结束后分别向滚管中用注射器加入0.1ml的D液。

4.对小瓶，滚管和注射器灭菌。

5.灭菌结束后，将滚管放入水浴锅中保温。将小瓶、注射器和储液E放到无菌操作台内，打开紫外灯20分钟。

6.杀菌结束后，关掉紫外灯打开风机和照明灯，放入WH-2菌种。给6个小瓶分别标上10-1 ~10-6，然后用5ml注射器吸取1ml菌液加入到10-1 中摇匀，再从10-1 中吸取1ml加入到10-2 中摇匀，以此类推配好10-1 ~10-6 浓度的菌悬液。

7.在给滚管接菌前，待从水浴锅中取出的滚管温度不烫手时先吸取0.1ml储液E注入滚管，然后再接入0.2ml的菌液，摇匀后。再水平转几圈，除掉气泡，使培养基均匀摊开，迅速放到冰上快速滚动。以此类推做好10-1 ~10-6 浓度的菌悬液的滚管，贴上标签后放入培养箱中37度培养2天。

8.观察不同浓度的菌的生长状况。

结果：滚管中的菌落数随着军浓度的减小而减少，到10-6 几乎不生长。10-5菌落的分散度较好，因此后续的诱变实验拟以10-5浓度的菌悬液作为出发菌的浓度。

3.确定最佳的微波诱变时间

准备器材：生长至对数期WH-2菌液、生理盐水、11个小瓶、1个大瓶、8个滚管、1ml 注射器9支、5ml注射器6支、冰、水浴锅（80度）、微波炉。

实验方法：1.分别称取0.075g琼脂加入到8个滚管中，再将按45ml培养基的量加的储液A,B,C,F,CMC和水的溶液分别吸取4.8ml加入到8个滚管中，压盖。

2.分别吸取9ml生理盐水加入到4个小瓶中，再吸取45ml生理盐水加入到大瓶中，压盖，另外的7个小瓶直接压盖。

3.对小瓶、大瓶和滚管除氧，除氧结束后分别向滚管中用注射器加入0.1ml的D液。

4.对小瓶，大瓶，滚管和注射器灭菌。

5.灭菌结束后，将滚管放入水浴锅中保温。将小瓶、注射器和储液E放到无菌操作台内，打开紫外灯20分钟。

6.杀菌结束后，关掉紫外灯打开风机和照明灯，放入WH-2菌种。给4个小瓶分别标上10-1 ~10-4，大瓶标上10-5 ，然后用5ml注射器吸取1ml菌液加入到10-1 中摇匀，再从10-1 中吸取1ml加入到10-2 中摇匀，以此类推将菌液稀释到10-4 ，再吸取5ml的10-4 的菌悬液加入到大瓶中，制好50ml 10-5的菌悬液。最后分别吸取5ml的10-5的菌悬液加入到7个空的小瓶中做为诱变菌。

7.将小瓶侵入盛冰水混合物的烧杯中，放到微波炉中开中低火分别诱变30s、60s、90s、120s、150s、180s、300s。诱变结束后标记后立即放入冰箱中。

8.诱变结束后，在给滚管接菌前，待从水浴锅中取出的滚管温度不烫手时先吸取0.1ml 储液E注入滚管，然后再接入0.2ml的没经过诱变的菌悬液，摇匀后。再水平转几圈，除掉气泡，使培养基均匀摊开，迅速放到冰上快速滚动。以此类推做好诱变时间为30s、60s、90s、120s、150s、180s、300s浓度的菌悬液的滚管，贴上标签后放入培养箱中37度培养2天。

9.培养结束后，计算不同诱变时间菌的致死率。致死率=（对照菌落数-诱变菌落数）/对照菌落数。计算不同诱变时间菌正突变率。正突变率=[（透明圈直径/菌落直径）大于对照（透明圈直径/菌落直径）的个数]/诱变菌落数。选择致死率适合时正突变率最大的。

结果：待测。

环境管理体系审核方法简易版

The Daily Operation Mode, It Includes All The Implementation Items, And Acts To Regulate Individual Actions, Regulate Or Limit All Their Behaviors, And Finally Simplify Management Process. 编订：XXXXXXXX 20XX年XX月XX日 环境管理体系审核方法简 易版

环境管理体系审核方法简易版 温馨提示：本操作规程文件应用在日常的规则或运作模式中，包含所有的执行事项，并作用于规范个体行动，规范或限制其所有行为，最终实现简化管理过程，提高管理效率。文档下载完成后可以直接编辑，请根据自己的需求进行套用。 环境管理体系审核是指组织内部对环境管 理体系的审核，是组织的自我检查与评判。内 审的过程应有程序控制，定期开展。内审应判 断对环境管理体系是否符合预定安排，是否符 合ISO14001标准要求。环境管理体系是否得到 了正确实施和保持，并将审核结果向管理者汇 报。 环境管理体系审核对象是环境管理体系， 一次完整的内审应全面完整地覆盖组织的所有 现场及活动，覆盖ISO14001环境管理体系标准 所有要素，并包括组织的重要环境因素受控情 况，目标批标的实现程度等内容。

环境管理体系审核应保证其客观性、系统性和文件化的要求，应按审核程序执行。内审的程序应对以下内容进行规定： A、审核的范围，可包括审核的地理区域、部门或体系要素； B、审核的频次，应根据组织自身的管理状况和外部机构要求确定； C、审核的方法，一般可包括检查文件及记录，观察现场及*作，与相关人员面谈等； D、审核组的要求和职责，如审核组长及组员的能力与职责等； E、审核报告及结果的要求和报送办法等。在开展每次审核前应制定审核计划（方案），包括人员与时间的安排。审核的内容应立足于所涉及活动的环境重性和以前审核的结果。

环境管理体系的建立过程正式版

Guide operators to deal with the process of things, and require them to be familiar with the details of safety technology and be able to complete things after special training.环境管理体系的建立过程 正式版

环境管理体系的建立过程正式版 下载提示：此操作规程资料适用于指导操作人员处理某件事情的流程和主要的行动方向，并要求参加施工的人员，熟知本工种的安全技术细节和经过专门训练，合格的情况下完成列表中的每个操作事项。文档可以直接使用，也可根据实际需要修订后使用。 随着可持续发展战略在全球的实施，环境保护正朝着污染预防的方向发展。这要求组织以主动自觉的方式从其管理职能上推动生命周期的环境管理，将环境保护贯穿渗透到组织的基本活动过程中，以促进组织环境表现的持续改进。实践表明，为实现这一目的，在组织中需要一种系统的结构化管理机制。环境管理体系正是这样一个有效的方法工具。建立环境管理体系，必须以ISO14001标准为规范、 ISO14004标准为指南，并结合国家的法律法规和环境标准。需要特别指出的是：

ISO14001是用于对组织所拥有的环境管理体系进行认证、注册和自我声明的规范标准。因而其对环境管理体系的规定和表述，更侧重于从审核认证或自我声明的角度对环境管理体系的建立和实施提出基本要求。相反，GB/T24004-ISO14004则是一个拟用于对环境管理体系进行认证、注册或自我声明的标准。它作为一个组织由于自身环境管理的需要而自愿选用的支持工具，为组织的环境管理体系的建立、实施及改善提供了具体而广泛的指导。在各类组织的实际应用中，不同的组织所建立的环境管理体系，其特定形式，具体内容等有可能并不完全相同，这取决于组织及其活动，产品或服务过程的具体特点和复杂

大肠杆菌实验

大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化 一、实验目的 1）掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2）学习和掌握质粒DNA的转化和筛选方法及操作步骤。 二、实验原理 本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温实现转化。由于所用pBS质粒带有长那霉素抗性基因。因此可以通过长那霉素抗性来筛选转化子。如果受体细胞没有转入pBS，则在含长那霉素的培养基上不能生长。能在长那霉素培养基上生长的受体细胞肯定已经导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳酶切等进一步鉴定。 三、仪器及试剂 仪器：恒温摇床、CO2细胞培养箱、台式高速冷冻离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、移液枪、Eppendrof管。 试剂：LB培养基(在950mL水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl、用1mol/L NaOH调制pH=7.2.加入至1L，121℃高压灭菌20min) 长那霉素储存液：100mg/mL 含长那霉素的LB固体培养基：(1L LB液体培养基中加入20g琼脂粉，将配好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却至60℃左右，加入长那霉素储存液，使其终浓度为50μg/mL。摇匀后铺板，每皿倒15mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净) 1mol/L CaCl2储存液质粒DNA10ng/Μl 四、实验步骤 1 感受态细胞的制备 1）从LB平板上挑选新活化的E.coli DH 5α单菌株，接种于3~5mL LB液体培养基中，37℃下震荡过夜培养，12h左右，直至对数生长后期。

2）将该菌悬浮液以1:50的比例接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h至OD600为0.5左右。 3）将5mL培养液转入4个1.5mL离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下，5000rpm离心5min。 4）弃去上清液，用预冷的1mL 0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15~20min后，40℃下5000rpm离心5min。 2 铺平板 将配好灭菌的LB固体培养基加热融化，待冷却至60℃左右后，加入长那霉素储存液，使其终温度为50μg/mL，摇匀后铺板，每皿倒约15mL。室温放置过夜至冷凝水挥发干净。 3 感受态细胞的转化 1）取100μl感受态细胞悬浮液，加入5μLpBS质粒DNA溶液，轻轻摇匀，冰上放置30min。 2）42℃水浴热激70s，热激后迅速置于冰上冷却3~5min。 3）向管中加入400μl LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃震荡培养1h。使细菌恢复到正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 4）将上述菌液摇匀，取200μl涂布于含长那霉素的筛选平板上，正面放置0.5h。待菌液完全被吸收后倒置培养皿，37℃培养16~24h， 5）对照实验： 对照组1：以同体积的无菌二次水代替DNA溶液，其他操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2：以同体积的无菌二次水代替DNA溶液，取5μl菌液，稀释100万倍，涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 五、实验数据记录处理 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，各培养皿中的菌落数如下表所示：

实验六 环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应

环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应 生05 边晔 2010030026 周四班同组成员：徐竞 实验时间 2012年11月22日 一、实验目的 1.了解物理因素、化学因素及生物因素抑制或杀死微生物的作用及其试验方法。 2.了解紫外线诱变原理，并初步掌握紫外线诱变育种的方法。 3.练习单菌落划线分离微生物。 二、实验原理 在自然界中，微生物分布极其广泛，几乎无处不在，微生物的生长发育受着环境因素的影响。而不同的微生物及微生物不同的生理状态受环境因素影响的程度也不同，有的环境因素是微生物生长繁殖所必需的条件，有的表现为抑制作用，有的表现为杀菌作用。 温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。微生物群体生长、繁殖最快的温度为其最适生长温度，但它并不等于积累某一代谢产物的最适温度。粘质沙雷氏菌能产生红色或紫红色色素，菌落表面颜色随着色素量的增加呈现出由橙黄到深红色逐渐加深的变化趋势。 常用的化学消毒剂主要包括重金属及其盐类、有机溶剂(酚、醇、醛等)、卤族元素及其化合物和表面活性剂等。根据是杀死还是抑制微生物，可分为致死剂和抑制剂。常用的3个指标：最低抑制浓度（MIC）、半致死剂量和最低致死剂量。 许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊代谢产物如抗生素，具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用。不同抗生素的抗菌谱是不同的，某些抗生素只对少数细菌有抗菌作用。产黄青霉分泌青霉素抑制细菌细胞壁的合成。青霉素主要抗G＋细菌。链霉素作用于核糖核酸30S亚基，所以链霉素只作用原核生物。链霉素以抗G－细菌为主。 紫外线具有杀菌作用主要是因为它诱导形成胸腺嘧啶二聚体来破坏DNA的结构，使其不能正常行使功能。另外，空气在紫外线照射下产生臭氧(O3)，也有一定杀菌作用。紫外线杀菌力最强的波长是226-256nm部分。紫外线透过物质能力很差，所以只适用于空气及物体表面的灭菌，它距离照射物以不超过1.2米为宜。紫外线对于人体也有伤害作用。 紫外线对细菌生长的影响是随着紫外线对微生物照射剂量、时间及距离的不同，对微生物的生理活动也相应地产生不同的效果：剂量高、时间长、距离短就易杀死它们，剂量低、时间短、距离长时就会有少量个体残存下来，其中一些个体的遗传特性发生了变异。 我们可以利用这种特性来进行灭菌或菌种选育工作。紫外诱变最有效的波长仅仅是在253～265nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254nm。 三、实验仪器、材料和用具 紫外照射箱，37℃、33℃、30℃、25℃培养箱 25个淀粉培养基平板 在一边已长成一直线状菌落的产黄青霉，泾阳链霉菌平板各1个 培养18小时的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌菌液，粘质赛氏杆菌的平板 无菌的小圆滤纸片、接种环、涂布棒、黑纸、标签纸、酒精灯、记号笔、打火机、

大肠杆菌生化实验

细菌常用生理生化反应实验结果观察 一结果观察 １葡萄糖发酵实验 直接观察试管, 试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌. 左边为恶臭假单胞菌，有气泡并变为黄色；右边为大肠杆菌, ２V. P. 反应和甲基红试验: 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌. VP，图为右边为大肠杆菌，溶液变红，为阳性菌。 ３吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.

左边为大肠杆菌，出现红色阳性菌；右边为产气杆菌，颜色不变，阴 性菌。 ４硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液，如过溶液变红说明有亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性菌，如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂，如果变蓝，说明此菌为阴性菌；如果不变色，说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌． 右下方恶臭假单胞菌，加入革里斯试剂A、B后不变色，再加入二苯 胺试剂后变蓝，为阴性菌；左上方大肠杆菌为红色。 ５柠檬酸盐实验 直接观察斜面，斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌，不变者为阴性菌．

左边产生蓝色，产气杆菌阳性；右边为大肠杆菌，阴性。 ６明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌． 左边为大肠杆菌，出现透明圈，阳性；右边为枯草杆菌，阴性菌。 7 淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌．

实验十二细菌常用生理生化反应实验结果观察.

实验十二细菌常用生理生化反应实验结果观察 结果观察 1 葡萄糖发酵实验直接观察试管，试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌，不变者为阴性菌 左边为恶臭假单胞菌，有气泡并变为黄色；右边为大肠杆菌 2 V. P.反应和甲基红试验： 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中，在一管中滴入2-3滴甲基红试剂，溶液 变红的为甲基红阳性菌，不变的为甲基红阴性菌?在另一管中加入V. P.试剂，在37C保温15 分钟，变红者为阳性菌，不变者为阴性菌. VP，图为右边为大肠杆菌，溶液变红，为阳性菌。 3吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚，振荡，静置分层，加入2-4滴吲哚试剂，在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌，不变者为阴性菌?

左边为大肠杆菌，出现红色阳性菌；右边为产气杆菌，颜色不变，阴 性菌。 4硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液，如过溶液变红说明有亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性菌，如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂，如果变蓝，说明此菌为阴性菌；如果不变色，说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌. 右下方恶臭假单胞菌，加入革里斯试剂A、B后不变色，再加入二苯 胺试剂后变蓝，为阴性菌；左上方大肠杆菌为红色。 5柠檬酸盐实验 直接观察斜面，斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌，不变者为阴性菌.

左边产生蓝色，产气杆菌阳性；右边为大肠杆菌，阴性。 6明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌. 左边为大肠杆菌，出现透明圈，阳性；右边为枯草杆菌，阴性菌。 7淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液，并铺满平板，菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌，没有透明圈的菌为阴性菌.

大肠杆菌

大肠杆菌的培养和分离 ——基础知识和操作过程梳理一、大肠杆菌 细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。 大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。 二、培养基配置 微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤： 1．称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。 2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3．调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。

环境管理体系建立过程

环境管理体系建立过程 各类企事业单位、公司、政府机关，无论是它们的结合体或部份(以下统称为组织)，无论是何种文化背景和所有制性质，无论它们处于何种环境表现水平和环境管理水平，都可按ISO14001标准的规范要求实施适用于组织自身的环境管理体系(以下简称为EMS)。EMS是个动态的，需不断发展和完善的体系，建立程序与其运作模式没有本质的区别，都遵循著名的"策划-实施-检查-改进"管理循环理论(简称PDCA循环)，通常可分解为如下六个阶段和过程。 一、领导决策与准备：EMS是组织全面管理体系的组成部分，环境保护对于组织具有深远的战略意义，EMS的建立与实施需要投入人、财、物等各种资源，因此，必须首先得到最高管理者(层)的明确承诺和支持。最高管理者应任命环境管理者代表，授权其负责建立和维护体系，并向其汇报体系情况。组织应组建一支精干的EMS工作组，在管理者代表的领导下，在通过国际标准、环境知识、环境法律等培训后，即可着手建立体系。 二、初始环境评审：初始环境评审是组织明确环境管理现状的手段，其结论是建立EMS 的技术基础和前提条件。管理者代表和工作组应精心策划和实施评审，充分调动发挥各部门的积极性和作用，广泛收集信息资源，编制评审报告。初始环境评审的内容主要包括： (1)明确组织应遵守的与环境相关的法律法规标准及其他要求，对组织的环境表现进行评价，确定改进的需求和可能性; (2)利用产品生命周期分析的思想明确组织产品、活动和服务中可以控制和可能施加影响的环境因素，评价出重要环境因素，以作为改进和控制的对象; (3)收集、分析和评审组织现有与环境相关的管理制度、职责、程序、惯例等信息资源和文件，与ISO14001标准要求对照，确认有益合理成份，以作为EMS的基础。(4)对以前的环境条件和市场信息进行分析评审，以避免环境风险，争取竞争优势。

常见细菌药物敏感性试验报告规范

常见细菌药物敏感性试验报告规范中国专家共识 微生物学检验为感染性疾病的诊断、治疗和控制提供了必不可少的证据。因此微生物学检验报告是临床和实验室等多方共同关注的焦点。国内临床微生物学检验发展较为薄弱，报告存在着种种不足。同时，临床与实验室的沟通存在一定不足，密切协作非常必要。基于实际存在的问题，为规范国内临床微生物学检验药物敏感性试验报告，加强临床与实验室合作，发挥检验医师作用，特制订本共识，以期指导相关报告的规范化，减少错误，增加专业信息，提高服务质量，为临床医学诊、治、控提供坚实的科学依据。本共识限于常见细菌的药物敏感性报告。 一、药物敏感性试验的意义和基本原则 (一)意义 药物敏感性试验可以检测细菌对于抗细菌药物的敏感性，为临床用药、新药研究、监测耐药变迁、发现耐药机制等提供客观证据[1]。对于经验治疗，依据一方面来自医生自身的经验，一方面是实验室长期不断提供的数据积累。临床需要考虑不同感染的病原谱和常见病原对不同药物的敏感性；对于靶向治疗，特定分离株的具体药敏试验结果可以用于判断经验治疗选药合理性、经验治疗效果分析、调整治疗选药依据等。 (二)基本原则 1．药敏试验检测获得性耐药，不必测试天然耐药： 天然耐药是细菌菌种固有的特征，耐药基因一般位于染色体，可以长期稳定遗传，表现为对某类或某种药物的天然耐药[2]。天然耐药信息一般由基础医学和临床文献提供。部分天然耐药，体外试验条件下可能无法检测出来，因而导致假敏感，如果报告将成为极重要错误，严重误导临床。常见菌种对各类药物的天然耐药见文献[3,4]。实验室全体人员应熟知这些信息，可将其发给临床学习和参考。 2．药敏试验测试的前提条件[5]： 实验室应具备相应检测的人员能力、客观条件、结果解释依据。标本处理、菌株分离鉴定、药敏试验操作等环节规范、标准、结果可信；具备对结果的解释能力，能够提供临床会诊服务。临床常规工作，分离株(可能)有临床意义而非定植或污染时，才可进行药敏试验。错误示例：来自痰标本的溶血葡萄球菌，未作标本质量评估和半定量培养，进行药敏试验；来自粪便标本肠球菌属进行药敏试验等。 3．测试结果应准确： 实验室应遵照C L S I文件或相关规范建立本医院药敏试验的质量管理体系。质控菌株、频率、质控范围符合相关要求；定期参加实验室室间比对项目。建议保留菌株，以便复核。 二、具体的专业要求 (一)标本类型 临床微生物学的一大特点是标本种类繁多，而不同药物在这些部位的分布不同。标本的规范采集、质量保证、立即运送和有效保藏有赖于临床、实验室以及相关各方的密切合作。

大肠杆菌实验报告

大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选 0740063 阿噟兰 1.前言 抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。 在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。 紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。 因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。 2.材料和方法 实验材料、仪器和试剂 菌种：大肠杆菌 仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器 试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水 实验方法 2.2.1制备培养基 普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）： 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml 筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。（卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA，阻断细菌蛋白质的合成。） 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml），按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌，取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素加入培养基中，充分震荡混匀，倒平板，2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml 2.2.2制备菌悬液（106 ~ 108个/mL） ①固体培养：大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基，37℃培养24-48h。 ②菌悬液：用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小三角瓶（或试管）中，充分振荡使菌

实验十一 紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选

实验十一紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选 Ⅰ、紫外诱变技术 一实验目的 以紫外线处理细菌细胞为例,学习微生物诱变育种的基本技术。了解紫外线对细菌细胞的作用。 二实验材料与用具 菌株:大肠杆菌(Escherichia coli) 培养基:营养肉汤(nutrient broth)固体与液体培养基 生理盐水等 器皿:10ml及1ml的移液管,无菌试管,无菌培养皿,无菌三角瓶(内有无菌的玻璃珠20~40粒),无菌漏斗(内有两层擦镜纸),无菌离心管,离心机,紫外诱变箱等。 三实验原理 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小,一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率,可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效就是UV,UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯,其光谱比较集中在253、7nm处,这与DNA的吸收波长一致,可引起DNA分子结构发生变化,特别就是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体,从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产与科研中可利用此法获得突变株。 四实验内容 1、对出发菌株进行处理,制备单细胞悬液; 2、紫外线进行处理; 3、用平板菌落计数法测定致死率;

五 操作步骤 (一)出发菌株菌悬液的制备 1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基,37℃培养16~24h; 2. 将活化后的菌株接种于液体培养基,37℃ 110rpm 振荡培养过夜(约16h),第二天,以 20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基,继续培养2~4h; 3. 取4ml 培养液与5ml 离心管中,10000rpm 离心3~5min,弃去上清液,加4ml 无菌生理 盐水,重新悬浮菌体,再离心,弃去上清,重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液; 4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内,振荡20~30min,以打散细胞; 5. 取诱变前的0、5ml 菌悬液进行适当稀释分离,取三个合适的稀释度倾注肉汤平板, 每一梯度倾注两皿,每皿加1ml 菌液,37℃倒置培养24~36h,进行平板菌落计数。 (二)UV 诱变 1. 将紫外灯打开,预热30min; 2. 取直径6cm 的无菌培养皿(含转子),加入菌悬液5ml,控制细胞密度为107~108个/ml; 3. 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上,静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋 纽进行搅拌,然后打开皿盖,分别处理5s 、10s 、15s 、30s 、45s,照射完毕后先盖上皿盖,再关闭搅拌与紫外灯; 4. 取0、5ml 处理后的菌液进行适当稀释分离,取三个合适的稀释度倾注肉汤平板进 行计数(避光培养)。 六 实验结果 对平板菌落进行计数,并计算死亡率。 %100///?-=ml ml ml 照射前活菌数照射后活菌数照射前活菌数死亡率

实验室常用的细菌作用及其选择

第一篇：JM109，DH5a，BL21这些感受态有何区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac －proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU ，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验

大肠杆菌培养实验报告

大肠杆菌培养实验报告 篇一：大肠杆菌检测实验报告 国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数 实验目的 实验原理：国标法操作的原理 实验器材： 培养箱，10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，试管架，4个平皿，500ml大烧杯1个，电子天平，纱布，脱脂棉，灭菌锅，PH计或PH试纸，100ml量筒，橡皮手套，超净台 实验药品： 磷酸盐缓冲液，蒸馏水，LB培养基，琼脂，5%NaOH，5%HCl 实验步骤： 一： 10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，4个平皿，500ml大烧杯1个，100ml量筒进行洗涤，然后一起放入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min。灭完菌后烘干，完成后放入超净台中。 用酒精擦拭超净台，紫外消毒30min 二： 1：用电子天平称取成品LB 3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中。 2：用量筒量取125ml的蒸馏水

加入该锥形瓶中，制成培养基。 3：用棉花堵住该锥形瓶的瓶口，用牛皮纸包住瓶口，用橡皮筋扎牢，再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下灭菌20min。 4：灭完菌后放入超净台中备用。 三： 1：取1只无菌250ml锥形瓶，用量筒向其中加入49ml PBS 2：将1ml样品加入到该锥形瓶中，摇匀制成1:50的细菌溶液。 3：取4只试管，编号1—4 4：用无菌移液管分别向4只试管中加入9ml的PBS 5：用1ml无菌移液管从样品中移取1ml菌液加入到1中.震荡试管使菌液均匀。 6：用1ml无菌移液管从1号试管中移取1ml的细菌溶液加入2号试管中，摇匀 7：用另一只1ml无菌移液管从2号试管中移取１ｍｌ细菌溶液，加入3中，摇匀．．．．．．以此类推直至4只试管中均加入了细菌溶液。 9：取4只平皿，编号1—4 10：分别用4只无菌移液管从这4只试管中移取１ｍｌ的菌液置于4只平皿中，加入４５—５０摄氏度温度下的培养基，约１５ｍｍ厚度。缓慢旋转平皿使菌液与培养基混合均匀；待培养基冷凝后倒置。

实验六 大肠杆菌营养缺陷型的筛选

实验六大肠杆菌营养缺陷型的筛选 一、实验目的 ?1、学习掌握培养基的配制方法 ?2、学习掌握消毒灭菌的原理与方法 ?3、学习掌握紫外线诱变育种的方法 ?4、学习掌握营养缺陷型的筛选方法 ?5、学习掌握微生物接种及划线分离等基本技术，巩固加强无菌操作技术. 二、实验原理 ?（一）培养基 ?培养基（culture medium）：人工配制的供微生物生长或产生代谢产物的营养基质。 1、制备培养基的原则 ?目的明确、营养协调、理化适宜、经济节约 ?1 ）根据营养类型设计培养基 ?2 ）注意培养基中各种营养物质的浓度及比例 ?3 ）适宜PH、氧化还原电位、水的活化度 ?4 ）营养物质廉价易得 ?5 ）灭菌：高温灭菌对营养物质的破坏及pH变化 2、培养基类型 ?1）物理状态：固体、液体、半固体 ?2 ）、化学组份：天然或合成培养基 ?3 ）、根据用途： ?A、加富培养基（enrichment medium） ?B、选择培养基（selective medium） ?C、鉴别培养基（differential medium） （二）消毒与灭菌 ?1、消毒、灭菌的概念 ?2、灭菌的方法

(1)高温灭菌 火焰灼烧法： 干热灭菌 高烘箱热空气法：150—170℃，2h; 温 灭 菌巴氏消毒法：60—85 ℃，20min. 煮沸消毒法：100℃ 湿热灭菌间歇灭菌法(丁达尔灭菌法)： 高压蒸汽灭菌：＞110℃ 超高温瞬间灭菌135-150 ℃ 2-6S 高压蒸汽灭菌 相同温度下，湿热比干热灭菌效果好 ?蒸汽存在潜热； ?蛋白质更易变性； ?湿热蒸汽穿透力比干热空气强； 微生物耐热性能 细菌内生孢子＞真菌孢子＞营养体 影响灭菌的因素 温度微生物种类；微生物的数量；培养基的体积；培养基的性质:浓度、PH （2）辐射灭菌(radiation sterilization) 利用电磁辐射产生的电磁波进行灭菌的方法 紫外线：260nm效果最好； 电离辐射：X射线，γ射线； 可见光长时照射 （3）过滤除菌 （4）高渗作用

大肠杆菌实验总结

分离

划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。 涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。 （一）制备LB培养基（通用的细菌培养基） 1、配方：蛋白胨10.0克，牛肉膏5.0g，氯化钠10.0克，水1000ml （配固体培养基再加琼脂20克） 2、流程 计算称量溶解调pH分装加塞，包扎灭菌倒平板

培养基配制(特) 培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。 1、按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中： 2、用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、 溶解。待灭菌。 ①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用___三角漏斗 _。 ②加塞：试管用塑料盖或__棉花塞___；三角瓶口用_封口膜__或_6层纱布封口,再用__牛皮纸__或报纸封口。 ③包扎：用_牛皮纸__或报纸 ④灭菌：高压蒸气灭菌法 1）加水：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是不触及内胆 _. 2）装锅：物品放置的要求__整齐、稳定、留出空隙：加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_排气槽__内。再以__两两对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺 栓松紧一致，勿使漏气。3）加热排气：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀。4）保温保压：当锅内压力升到1_kg/cm2时，控制热源，维持压力至15 _min。5）出锅：切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至_0_时，打开_排气阀__，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。

大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定

大肠杆菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定 关于菌株的几个概念： 野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。 原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同 关于培养基： 基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。 完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。用[＋]来表示。 补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。 摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为xxx缺陷型。 关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法 一、目的

1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。 2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。 二、原理 筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。 本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。 三、器材 离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针 四、材料 (一)菌种E.coli (二)培养基、 1LB培养液(Luria-Bertani 培养基,这个名字来源于英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。是微生物学实验中最常用的培养基，用于培养大肠杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成的固态培养基。加入抗生素的LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。)：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g； 水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min 22×LB培养液：其它不变，水，50ml。 3基本培养基：葡萄糖0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠0.1 g，

常见细菌理化性质鉴定试验

常见细菌理化性质鉴定试验 淀粉水解：淀粉在酸的催化作用下，能发生水解；淀粉的水解过程：先生成分子量较小的糊精(淀粉不完全水解的产物)，糊精继续水解生成麦芽糖，最终水解产物是葡萄糖。培养基：将细菌接种在平板上，置37度温箱中培养24h，加革兰氏碘液于菌落上，观察颜色变化，呈蓝色者为阴性，无蓝色为阳性。 甲基红试验：是根据肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红这个原理进行的测验。 产氨实验（乙酰胺肉汤）原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加纳氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色络合物。操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，在36℃±1℃下培养20h～24h。然后向每支试管培养物加入1～2滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。 吲哚试验：是指有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培养基中的色氨酸生成吲哚(靛基质)，经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色，则为吲哚试验阳性。 过氧化氢酶试验（又名：接触酶试验） 一、原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。 二、试剂3%过氧化氢溶液：临用时配制。 三、试验方法挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。 四、结果于半分钟内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。革兰氏阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验

大肠杆菌检测实验报告

国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数 实验目的 实验原理：国标法操作的原理 实验器材： 培养箱，10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，试管架，4个平皿，500ml 大烧杯1个，电子天平，纱布，脱脂棉，灭菌锅，PH计或PH试纸，100ml量筒，橡皮手套，超净台 实验药品： 磷酸盐缓冲液，蒸馏水，LB培养基，琼脂，5%NaOH，5%HCl 实验步骤： 一： 10只移液管，1只250ml锥形瓶，5只大试管，4个平皿，500ml大烧杯1个，100ml量筒进行洗涤，然后一起放入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min。灭完菌后烘干，完成后放入超净台中。 用酒精擦拭超净台，紫外消毒30min 二： 1：用电子天平称取成品LB 3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中。 2：用量筒量取125ml的蒸馏水加入该锥形瓶中，制成培养基。 3：用棉花堵住该锥形瓶的瓶口，用牛皮纸包住瓶口，用橡皮筋扎牢，再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下灭菌20min。 4：灭完菌后放入超净台中备用。 三： 1：取1只无菌250ml锥形瓶，用量筒向其中加入49ml PBS 2：将1ml样品加入到该锥形瓶中，摇匀制成1:50的细菌溶液。 3：取4只试管，编号1—4 4：用无菌移液管分别向4只试管中加入9ml的PBS 5：用1ml无菌移液管从样品中移取1ml菌液加入到1中.震荡试管使菌液均匀。 6：用1ml无菌移液管从1号试管中移取1ml的细菌溶液加入2号试管中，摇匀 7：用另一只1ml无菌移液管从2号试管中移取１ｍｌ细菌溶液，加入3中，摇匀．．．．．．以此类推直至4只试管中均加入了细菌溶液。 9：取4只平皿，编号1—4 10：分别用4只无菌移液管从这4只试管中移取１ｍｌ的菌液置于4只平皿中，加入４５—５０摄氏度温度下的培养基，约１５ｍｍ厚度。缓慢旋转平皿使菌液与培养基混合均匀；待培养基冷凝后倒置。 11：将培养基在３6摄氏度条件下培养12小时。 12：取出培养皿，选择细菌个数在30至300个之间的平皿数细菌的个数。 四：实验结果（记得在操作过程和得到结果时拍照） 1号，2号菌落个数多不可计，舍弃 4号平皿中菌落数目小于10 cfu ，舍弃 3号平皿中菌落分布较均匀，数3号中的菌落数，一共有210个cfu 。 计算样品中细菌浓度为：1.05× 105 Cfu/ml

ISO14000环境管理体系建立的步骤

ISＯ14001体系得筹建工作,从体系得策划设计启动至最终得体系认证,主要分为６个阶段。 一、策划设计阶段 1、了解期望目标，调查现存问题 （1)首先,了解公司最高管理者经营观念与对品质、环境系统得期望; (2)在得到公司最高管理者对环境体系得建立认可得基础上，对公司得主要问题进行调查; ①系统地调查企业组织机构及各部门职能; ②总结现有组织结构存在得问题； ③系统地总结现有品质系统存在得缺陷与问题，提出相应得建议; ④撰写调查报告，确定认证模式； ２、确定环境体系管理者代表，制订咨询计划 (1)结合公司实际情况，详细安排认证咨询时间； （2)由公司高官层在公司管理层中确定环境体系管理者代表,授与其如下职权: ①按标准规范要求建立、实施与维护环境管理体系; ②向最高管理层汇报体系得运行情况以供管理层评审，并为体系得改进提供依据; ③负责协调体系建立与运行过程中各部门间得关系，为最高管理者提出建议。 ④环境管理者代表应就是组织中具有相当级别得管理者,建议至少由具备相关知识得中层管理者,最好就是副总经理级得管理者担任。 （３)由环境体系管理者代表提出对咨询方得具体要求； （4）由环境体系管理者代表组织公司相关人员参加认证咨询与培训。 3、建立取证组织机构 （1)由环境体系管理者代表建立ISO１4000工作小组,确定小组成员; （2）由ISO１4００0工作小组初步确定EMＳ体系职能部门得成员与职责范围； (3）由环境体系管理者代表与ISO14０0０工作小组讨论确定公司得环境方针; 4、部门间得职责分工(ISＯ1400０工作小组负责） （１）制定公司各部门得职责分工表； （２）制订职责分工草案; (３）与各部门负责人开会讨论，确定部门职责分工得方案; (4）与公司高管层讨论，如有修改,再次进行（3）与（４)得循环；最终确定部门职责分工得正式方案； （５）公司董事长审定批准部门职责分工得正式方案。 5、列出文件清单（ISO140０0工作小组负责) (1)列出环境手册得框架结构; （２）列出程序文件清单,指出各部门具体分担得内容; （３）列出工作文件类别； (4）与各部门讨论文件清单，确定各部门具体分担得文件清单。 二、培训辅导阶段（培训由认证咨询部门进行) 1、IＳO140０0工作小组与EMS部门成员培训 (1）由认证咨询师准备教材； (2)安排认证咨询师进行现场培训; （３）讨论手册与程序文件得内容、结构； （４）问题答疑； 2、文件编写人员得培训 (１）确定文件编写人员； (2）由认证咨询师准备教材;