当前位置：文档库 › 基因分离克隆和功能鉴定

基因分离克隆和功能鉴定

动物遗传学读书报告

之

新基因的分离克隆及功能鉴定

学院班级：动物科技学院动物科学10级2班

小组成员：王宇豪20100880 宁椿游20100884

武启繁20100877 陈映20100879

新基因分离克隆及功能鉴定方法研究进展

前言

随着DNA分子双螺旋结构、密码子等的被发现，几种模式生物基因组测序和人类基因组计划的相继完成，使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。基因组学时代的主要任务是图谱制作性和序列测定，后基因组学时代则是进行基因组功能注释，这也是功能基因组学的主要研究目标。而PCR技术的诞生，推动了许多新技术和方法的应用。

1.基因的分离克隆

基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。分子克隆是指在体外对不同生物的DNA分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA。基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。

1.1基因的分离克隆主要方法

基因分离与克隆是基因工程的第一步，它是利用分子克隆技术获取用于转化、控制目的性状相关的基因。一般方法是先建立文库(基因组文库或cDNA文库)，再利用适当的探针，通过分子杂交从基因文库分离出目的基因，这是应用最早，目前最为成熟的一种方法。而对于未知序列，常采用步移的方法，其原理是如果知道离开该基因一定距离上的DNA序列，则可用这个DNA序列作探针，通过染色体步移来逐步接近并最后达到待克隆的基因。先用探针筛查文库，得到阳性克隆后，将这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列)作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列)是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库。通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。

以下对目的基因分离和克隆方法作一总结。

1.1.1功能性克隆

通过基因产物的克隆技术在传统遗传学占主导地位的时代，人们以基因产物为导向来分离克隆基因。由于基因产物的结构、功能已知，可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列，反推其核苷酸序列，设计探针或引物从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选克隆，也可以制备

产物抗体，从表达载体构建的cDNA文库中筛选相应克隆，进而分离目的基因。若可得到足

够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因。除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA 文库的筛选；或根据所获得的基因序列，指导5’端的引物合成，根据mRNA 3’端poly—A

序列指导合成poly—T的3’端引物，用PCR技术从制备细胞的mRNA或直接从胞浆内溶物中合成相应的cDNA，将该cDNA克隆到表达载体上进行产物表达。

1.1.2同源性序列克隆技术

随着基因研究的不断深入，人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列设计简并

引物，并用简并引物对含有目的基因的DNA文库进行PCR扩增，再对PCR扩增产物进行扩增、克隆和功能鉴定。对于同源性很高的基因，可以直接用作探针进行非严谨性杂交筛选另一物

种的DNA文库。

同源性序列克隆技术自提出以来，受到国内外学者的广泛重视，发展很迅速，但有些问题值得重视和思考：①由于密码子的简并性和不同同源序列间同源程度的差异，简并引物的特异性要设计得当，必要时需要设计几套引物组合。②由于某些同源序列并不专属于某一基因家族，因而扩增产物不一定是某一基因家族成员。③基因家族成员往往成簇存在，克隆的基因片段是否为目的基因尚需进一步判断。因此对PCR扩增产物和克隆产物，有必要进行基因与性状共分离分析，插入失活或遗传转化等功能鉴定工作，以便最终筛选到目的基因。1.1.3表型克隆技术

细胞在增殖、分化、外界环境变化等某些异常状态下，常有某些新基因特异性表达或表达异常地增高，而另一些基因可能表达降低或缺失，因而分离差异表达基因将是认识生物体的生长发育等生命活动过程的入手点，以此为基础，才能深入理解基因的结构、功能、表达与调控。差异表达基因的分离方法也伴随分子生物学技术的发展由单一化发展为多元化，而且呈各种方法互相结合的趋势。分离差异表达基因的3种基本方法为：差式筛选、扣除杂交、差异展示反转录。

1.1.3.1差式筛选法

差式筛选法是分别从有特异表达基因的目标样和无特异表达基因的参照样中提取mRNA，反转录为cDNA，并构建Ts的cDNA文库，分别将从TS和RS中提取mRNA制成cDNA探针，分别用TS和RS的eDNA探针与TScDNA文库的菌落或噬菌斑作原位杂交，选出只与Ts杂交，而不与RS杂交的克隆即为TS特异表达的克隆。此法常要经过多轮菌斑杂交，不仅费力费钱，重复性差，而且灵敏度很低。

1.1.3.2扣除杂交

扣除杂交则是用TS提取的mRNA反转录成cDNA探针与Rs的过量mRNA或cDNA杂交，经两轮充分杂交后，移去杂交分子和过量的RS的mRNA或cDNA，将不形成杂交体的TS的eDNA纯化富集，扩增，建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库。但此法回收cDNA量有限，重复性差，灵敏度低。

1.1.3.3DDRT—PCR

DDRT—PCR则是分别用Ts和RS的总mRNA作模板，利用12个可能的锚定引物T11MN锚定mRNA的olyA末端，借助逆转录酶合成cDNA第一链，得mRNA／cDNA，再用相同的3’锚定引物和5’端随机引物分别扩增TS、RS的mRNA／cDNA，扩增产物用序列胶电泳分析差异表达情况，将差异带DNA回收，可进一步鉴定分析，最终获得差异表达基因。它与前二者相比，速度快，易操作，可以鉴定低丰度差异表达的mRNA。分析2种以上样品基因的差异表达等优点，但仍存在假阳性率高、重复性差、扩增片段短等问题。

1.1.4 代表性差示分析法(RDA)

代表性差示分析法(RDA)可用于分离与生理条件改变相关的基因及不同发育阶段差异

表达的基因，具体过程如下：①制备扩增子。提取TS和RS的mRNA并反转录制备双链cDNA即test。er eDNA和driver cDNA。然后用限制性内切酶切，将酶切片段装上接头，末端补平后，加入接头引物进行PCR扩增。②扣除杂交。去除接头后仅对tester片段加上新的接头，用过量的driver cDNA与之杂交退火，将形成三种产物：tester／tester、tester／driver、driver／driver。

③特异性片段的扩增。末端补平后，加入新接头引物进行PCR。3种产物中仅自身退火形成的tester／tester两端均能和新引物配对而呈指数扩增，tester／driver仅一端可和新引物配对而呈线性扩增，Driver／driver无引物配对不扩增。然后用绿豆核酸酶去除单链DNA分子，再进行PCR富集特异表达cDNA片段。④对特异片段进行克隆，通过FISH等技术进一步分离特异表达基因。

1.1.5 抑制性差减杂交PCR法(SSH)

SSH的基本流程如下：①第1次杂交。提取TS和RS的mRNA反转录为tester eDNA和driver eDNA，用Rsa I或Hae m酶切成平头末端cDNA，分成均等2份，分别加不同的接头，再分别与过量的driver cDNA杂交，将形成4种产物：a，单链tester cDNA、b，自身退火的tester／tester 双链、c，异源退火tester／driver双链、d，drivercDNA。②第2次杂交。合并2份杂交产物，加入新的变性driver cDNA退火、杂交，这次除了a、b、c、d4种产物外还形成产物e，e是tester 自身退火形成，但两端带不同接头。③特异性片段的扩增。末端补平后，先后加接头的内、外侧引物扩增，a和d无扩增。b由于两端接头互补形成发夹结构也无扩增，c仅一端有引物结合呈线性扩增，仅e两端可配不同引物而呈指数扩增。④特异性片段e克隆，并进一步分离差异表达基因。该法通过2次杂交和2次PCR，使假阳性率可降到6％，且灵敏度高。用SSH可一次同时分离几十至几百个差异基因，效率大增。

1.1.6交互差减差异RNA显示(RSDD)

RSDD的主要过程如下：①交互差减。分别提取具有差异表达的2种组织细胞A、B的mRNA，反转录为cDNA，并构建cDNA文库。将这2个文库进行交互差减得到A减B和B减A的2个差减cDN A文库，由于构建文库所用的噬菌体载体上带有质粒载体的结构，载体进入宿主后，其上质粒载体被切下，得质粒cDNA文库。②差异显示。用3’锚定引物和5’随机引物对2个差减文库提取的DNA分别进行PCR扩增，将扩增产物用5％序列胶电泳，显示并分离差异条带，回收差异DNA，再次扩增后，获得富集的差异表达片段。③表达分析。采用反向Northern分析和Northern分析鉴定经再次扩增的差异DNA片段的真伪。反向Northern分析是将差异显示得到的扩增后DNA片段转膜，分别与来自A、B细胞系的总mRNA经反转录制备的32 P标记的cDNA第一条链探针进行杂交，只与亲本来源细胞系杂交，而不与另一细胞系杂交的即为真正差异表达的基因。④对差异片段克隆、测序，并进一步分离获得差异表达的基因。

RSSD可以有效快速地鉴定由于细胞生理变化而在基因组中差异表达的基因，它结合了DDRT—PCR和扣除杂交的优点，减少或消除了共有序列，使序列胶上条带清晰度增加，并使低丰度序列得到富集，降低了假阳性率，且RSDD仅用较少的引物进行逆转录PCR就可分析全部差异表达基因，但RSSD并不能完全杜绝假阳性。Kang等用RSDD法克隆并证实了促进肿瘤发展的基因(PEGene)和抑制肿瘤发展的基因(PS Gene)。

1.1.7图位克隆技术

随着各种生物分子标记连锁图的相继建立和越来越多的基因被定位，在90年代初图位克隆技术也应运而生。其原理是根据功能基因在基因组中存在相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DAN 文库(如YAC、BAC或Cos。mid文库)，构建出目的基因区域的物理图谱，再通过染色体步行(chromosome walking)逐步逼近候选区域或通过染色体登陆(chromosome landing)的方法最终找到包含该目的基因的克隆进而克隆该基因。

定位克隆理论上适用于一切基因。但也存在应用上的一些不足：如果要构建完整的基因组文库，建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系，对基因组较大、标记数量不多而重复序列较多的生物采用此法投资大且效率低，因而图位克隆技术目前仅局限于拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和的模式植物上。

1.1.8转座子标签法(transposon tagging)

转座子(Transposon)是从染色体的一个位置转移到另一位置的DNA片段，最早在玉米内发现的。随后的研究表明，在生物界内转座子是普遍存在的。并在生物的遗传进化方面有重要作用。转座子标签技术克隆基因的基本原理是：利用转座子插入到基因内部或邻近位点，会引起相火表型突变的特点。以转座子的已知序列为标签，克隆因转座子插入而功能失活的基因，如果某基因的突变是基于转座子插入而造成的，那么以转座子序列为探针就可以从变异株的基因组中筛选出带有此转座子的部分基因，再以突变基因的部分序列作探针，即可以

从野生型文库中克隆出完整的基因，在植物内利用转座子的有玉米的Ac／Ds。En／Spm和金鱼草的Tn3等，其中应用最多的是AciDs双因子系统。利用转座子标记技术目前已克隆y-0的

植物抗病基因有玉米抗网斑病基因Hml、Hm2。番茄抗叶霉病基因Cf-2、Cf-4a、Cf-5、Cf-9、Cf-9B及Cf-ECP2,烟草抗花叶病毒病基因N，亚麻抗锈病基因L6、M等。该技术是目前分离克

隆抗病基因有效工具之一。随着农杆菌介导转座子导入目标植物系统建成后，目前已在拟南芥、番茄、水稻内有广泛的运用。同时，随着拟南芥、水稻等模式植物的基因组测序完成，研究的热点转向功能基因组，转座子标签技术己经成为构建植物突变体库，进行基因功能研究的核心技术。

1.1.9基因芯片技术(gene chips)

基因芯片义称DNA芯片、DNA微阵列(DNA ini—croarray)，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫捕，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作m比较和检测，从而迅速得到所要的信息。基因芯片具有高通量、高信息量、快速、并行检测、样品用量少、用途广泛等优点，已经被广泛应用到基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因义库作图以及杂交测序等方面。基因芯片根据功能可分为基因表达芯片(gene expression nlicroarra)和DNA测序芯片(DNAsequencingchip)2类：按基因芯片的用途可分为表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片等；根据所用探针的类型可分为eDNA微阵列芯片和寡核苷酸阵列芯片。

基因芯片与传统的膜杂交相比有以下优点：①芯片点样密度远远高于膜的点样密度、样品用量少、信息量大。②芯片可用双色荧光标记两种探针，这样数据准确度大大提高；而膜通常用核素标记探针，一张膜只能杂交一种探针，数据可比性差：③芯片杂交体积小，灵敏度高；膜杂交体积大，灵敏度差。④芯片具有表面平攀性好、硬度大、透明等特点，比易卷曲的膜杂交更容易在点样、杂交、图像处理及数据采集等方面自动化。基因芯片具有高通量、高信息量、快速、样品用量少、造价低、用途广泛等优点。

1.1.10电子克隆(electronic cloning)

电子克隆，又称计算机杂交(computer hybridization)，是以数学算法为手段，以计算机和互联网为工具，利用现有的基因序列、表达序列标签(EST)、蛋白序列和生物信息数据库，发掘新基因，并通过生物学试验进行编码序列和功能验证而克隆基因的方法。电子克隆的理论基础是利用绝大部分功能基因的编码区比较保守、同源性较高的特点，采用生物信息学的手段，通过同源性分析延伸EST序列，以获得基因潜在的部分乃至全长的cDNA序列。

电子克隆充分利用已有的生物信息资源，从ESTs序列人手，通过同源筛选，获得基因部分乃至全长cDNA序列，避免或减轻了构建与筛选cDNA义库等繁重、耗时的实验室T作，将大大加快基因克隆的方法。与传统的实验室克隆基因的繁杂、耗时、费用高、效率不高的方法相比，电子克隆更为简捷、快速、费用大大降低。随着多种模式生物的基因组测序T作的完成，以及各种生物的EST数据库的建立和充实，电子克隆必将在基因克隆的领域占有重要的一席之地，也必将加快新基因的发现与克隆的进程。

2.基因功能的鉴定方法

基因功能的鉴定方法有很多方向，根据基因的功能不同，可从表象、分子水平等对其探究。以下总结一下各种基因功能鉴定的方法。

2.1 基因的生物信息学分析

生物信息学以大规模序列信息产出为基本特征，除了对人类基因的测序外，还包括了多种模式生物体的基因组测序，这些序列可以从美国的基因库(GenBank)、基因组序列数据库(GSDB)、欧洲的分子生物学实验室(EMBL)，日本的DNA数据库(DDBJ)中获得。通过序列分析比较工具，

可以对基因序列资料中各类信息进行识别和比较，寻找序列之间的同源性，得到序列之间的进化关系，建立基因序列结构和功能的关系。

2.2基因的时空表达谱分析

基因的表达在个体发育的不同阶段以及在个体的不同组织和细胞类型中均不相同，即基因表达的时空性。因此，在研究一个基因的功能前，要对基因的时空表达谱进行分析，包括mRNA和蛋白质两个水平上的基因表达谱分析。

2.2.1 mRNA水平的表达谱分析研究

mRNA水平的基因表达谱分析常用的方法有Northern blot、原位杂交、RT—PCR等。

Northern blot可对基因进行特异和定量的检测，但测定效率不高，灵敏度也低，不能检出微小的基因表达量，同时实验中使用的放射性物质对人和环境也有危害。作为一种经典的基因表达量分析方法，Northern blot依然被广泛地应用。

原位杂交技术由美国耶鲁大学Gall和Pardue于1969年首先创立，广泛用于检测一个特异的mRNA在某一种生物体或者组织、细胞里的具体表达位置，对待测核酸分子进行定性、定量及定位分析。

RT—PCR主要有半定量RT—PCR、实时定量RT—PCR以及竞争性定量RT—PCR．半定量RT —PCR操作简便、快捷，但精确度不高，多用于快速初步分析；实时定量RT—PCR是近年来新发展起来的，特异性强、自动化程度高；竞争性RT—PCR则是将特异性的目的序列同已知浓度的内标RNA一起扩增。通过比较由内标获得的信号和目的模板所获得的信号，确定目的模板的相对含量。

近年来发展了一些新方法，如表达序列标签串联排列连接(TALEST)和GeneCalling。TALEST是应用含有IIs型限制酶位点的寡核苷酸引物，产生在mRNA上固定的短(16bp)ESTs。这些ESTs与热变性有关的GC一锁状标点序列相邻，因此可串联成长阵列，然后通过高通量DNA 测序识别、分析。GeneCalling法研究的对象是用两种不同限制酶消化的cDNA样品。用荧光标记的引物扩增、毛细管电泳分离这些标记的片断，然后同时测定每个片断的精确长度。通过电泳比较两个样品中每个点的强度，自动识别不同表达基因的cDNA片段。用大小精确的片段和片段旁侧序列查询特定物种的数据库，得出片段信息，而旁侧序列由限制酶消化而来。查询数据库包括转录子的“in silico”消化片段以及所有预测的基因片段。这种预测称为“GeneCalling”，可瞬时显示基因表达差异的临时列表。

2.3 蛋白质水平的表达谱分析

蛋白质水平上的表达分析的常用技术是Western blot和免疫组化等。Western blot与Nortern blot类似，不仅可以进行定量分析，而且还能够检测蛋白质的分子质量大小及其聚体形式。免疫组化是研究细胞内蛋白质定位、定量的重要方法，特异性强、敏感性高、能够准确确定蛋白质是在特定组织中的哪些细胞以及在特定细胞的哪个部位中表达。

2.4基因功能的实验学验证

在对基因的功能进行合理的预测后，需要通过实验来进行研究和验证。通常的研究策略是将基因导入到一个细胞或个体中，通过该基因在体内的表达情况，观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，从而鉴定基因的功能。主要的方法有基因敲除和敲入技术以及人工染色体技术等。此外，一些新的技术，如反义技术、microRNA技术、基因诱捕技术和微阵列分析等也得到了广泛的应用。

2.4.1 基因敲除和敲入技术

基因敲除是应用DNA同源重组原理发展起来的一门技术。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善，目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。与基因敲除相反，基因敲入是通过同源重

组的方法，将基因的编码序列用另一基因的编码序列进行替换的技术。通过基因敲入，可以让基因在体内表达、研究其功能；也可以与之前的基因进行比较，看其是否具有相同的功能。传统的方法只能在基因组中插入较小的DNA片段。Venken和Bellen将含有DNA片段的P转座因子转入到质粒里，质粒能够较P转座因子自身更稳定地携带大片断DNA。这种方法可将20kb

到133kb的DNA敲入果蝇基因组。这一突破使生物学家向果蝇体内敲入大片段的DNA 成为可能。

2.4.2工染色体的转导

质粒载体不仅承载能力有限，且表达水平低、缺乏组织特异性等。因此，克隆大片段DNA

常用酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)等。它们不仅可产生较高的表达水平和组织特异性，还可精确地调节重组。白20世纪末，又出现了一种全新的载体系统——人类人工染色体(HAC)。与其他基因载体相比，HAC能携带包含完整基因或多个基因以及基因的所有外显子和附近染色体区域的调控区的大片段DNA，为目的基因提供了一个与其在正常染色体上一致的环境，保证了转基因在正常细胞中时空性的表达。同时，HAC不整合到基因组中，从而不产生宿主基因组本身的插入突变和转基因沉默等现象，能够使基因表达的时限增长。Shitara等.就将这种非插入型的HAC载体成功应用于人端粒逆转录酶(hTERT)的研究。

2.4.3反义技术

反义技术包括三类：反义寡核苷酸、核酶和小干扰RNA。反义寡核苷酸包括反义DNA和反义RNA。1978年，Zameenik利用人工合成的与劳氏肉瘤病毒(RSV)的mRNA互补的DNA来抑制RSV

增殖，阻止了RSV使鸡红细胞癌变，使其成为研究反义DNA的第一人。目前反义DNA用于基因功能研究效果较好，也可用自动DNA／RNA合成仪很方便地合成，但因合成后的未修饰寡核苷酸对核酸酶的抵抗力较弱，不易透过细胞膜，与靶序列的亲和力也较低，故经常需要修饰。反义RNA则是通过与靶mRNA形成较稳定的二聚体来抑制靶基因的表达，其作用机理可能在DNA复制、转录及翻译水平上抑制靶基因的表达。核酶是一类具有催化活性的特殊的RNA

分子，具有高度专一内切核酸酶活性。单个核酶分子可以结合多个mRNA分子并使之在特定部位断裂，而核酶本身具有不易受RNase攻击的较稳定的空间结构，使得催化效率比反义RNA 高。核酶已经成功地应用于培养细胞中基因表达的阻断，主要靶基因包括，V、C2fo S、bcr2abl和H2ras等。小干扰RNA可通过双链RNA(dsRNA)介导特异性的降解靶mRNA，导致转录水平或转录后水平的基因沉默。1 995年，GuO和Kempheus在研究秀丽新小杆线虫(C．elegans)的parl基因功能时最先发现这种现象，但直到1998年，Fi re等?才解释了这种现象，他们发现将dsRNA注入线虫后可以有效地引起序列特异性的基因抑制，并将这种转录后水平的基因沉默机制称为RNAi。RNAi广泛存在于自然界中，其高度的序列专一性和高效的干扰能力，可以使特定的基因表边降低或沉默，是研究基因功能的强有力的工具。Xia等利用RNAi降低Spl和CREB的表达，同时通过EMSA位点的突变和缺失，从而验证了cAMP反应位点(CRE)和Spl 结合位点在调节人类SNF2L基因基底活性中的作用。

2.4.4 microRNA

成熟的microRNA长约l9—25 nt，是一类重要的内源性单链的非编码小分子RNA，可调节与其序列互补mRNA的表达。1993年，由Lee等在线虫中首次发现。microRNA在不同物种间具有高度的保守性，表达具有细胞或组织特异性，与细胞的生长、增殖、分化和衰亡等相关。它可以在转录和翻译水平来抑制基因的表达。根据最近的研究推测，目前已经有多达200

个基因可以通过microRNA进行调节。Stewart等在研究猪胎儿血红蛋白中short hairpin RNA(shRNA)的干扰效应时，结合microRNA技术和RT。PCR检测技术，来进一步验证和研究shRNA 的干扰效应。可以说，microRNA技术和RT。PCR检测技术的结合，使得基因功能的研究技术得到了新的发展。

2.4.5 基因诱捕技术和基因诱捕数

据库基因诱捕技术是近几年发展起来的，是基因打靶技术的进一步发展，已成为研究

基因功能及分析其生物学现象的重要工具。其基本原理是：通过物理、化学、生物等方法，将带有外源基因的DNA载体导入ES细胞中，使内源基因突变，并在被诱捕序列启动子的转录控制下表达插入的报告基因(常为新霉素或半乳糖苷酶基因)以鉴定突变。无启动子、增强子的报告基因在ES细胞中通过同源重组得到重组子后，分析不同发育阶段、不同组织器官中报告基因的表达情况，可以研究重组部分内源基因的表达特性。基因诱捕载体在整合位点可利用内源基因调控元件模仿内源基因表达，使其表达终止，从而可以阐明内源基因的功能，因此广泛应用于基因功能的研究。

2.4.6微阵列分析

微阵YlJ(microarray)是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因组表达谱、DNA 序列多态性、疾病相关基因的一项研究基因功能的新技术，于1984年由Geysen 等首次开发出。它包括cDNA微阵列和DNA芯片，其原理为：将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标签等)按横行纵列方式在固相支持物上有序点样。检测时，先用来自不同生理状态和发育阶段的mRNA作为模板，以放射性同位素或荧光标记的dNTP为底物反转录合成cDNA，再用所得cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交，然后通过计算机对结果进行判读和处理，从而判断待测样品中基因是否存在或者存在多少。微阵列分析是一种新的大规模检测基因表达的技术，具有高通量分析的优点。采用微阵列分析，可以进行DNA或RNA表达水平的高效快速的检测。微阵列分析打破了以往“一种疾病一个基因”的研究模式，通过对个体在不同生长发育阶段或不同生理状态下大量基因表达的平行分析，研究相应基因在生物体内的功能，阐明不同层次多基因协同作用的机理。

3.展望

3.1生物的基因是一片海洋，在基因分离克隆的领域，人类已经迈了坚实的步伐，但要彻底破译生命的天书，基因克隆的研究仍任重而道远，基因克隆的进展依赖于基因分离克隆技术的发展与创新：展望未来，基因分离克隆技术的发展将可能有以下趋势：

3.1.1高通节，高效率，经济快速的基因克隆技术将会领导潮流，如SSH、基因芯片等：生命科学的发展一日干，效率低下、耗时耗力的克隆技术必将退出舞台

3.1.2全基因组组测序将成为一种趋势。动物中，随着猪、人等的基闪组测序的完成，必将会有更多的动植物中进行。

3.1.3探讨众多功能基因之间的调控网络将成为今后的研究重点。当前飞速发展和不断完善的高通量基因克隆技术，如基芯片技术，能够存短时间内获得大量的基因组表达谱数据，可以定量的、从整体上对动物功能基因的作用机理进行深入的研究，从而把对功能基因调控作用的认识从单个基因水平上升到众多基因的网络层次。整合相关研究的信息以全面认识功能基因的调控网络，有助于从多维度系统水平上为利用功能基因进行动植物基因工程改良提供理论依据。

3.1.4在基因克隆中，计算机技术、电子技术将扮演更加重要的角色：基因组测序，基因芯片，电子克隆等技术的产生与发展，都与计算机技术的发展息息相关：面

对日益增多的生物信息的海洋，没有计算机技术和电子技术的辅助，人类只能望洋兴叹。3.1.5 不同的基因克隆技术之间的相互交叉融合。例如抑制消减杂交与基因芯片技术相结合。电子克隆与RT—PCR相结合等。将显示出巨大的应用前景。

3.2基因功能的鉴定不仅仅是我们今天面临的严峻问题, 它也将是整个二十一世纪全世界生物医学研究面临的一个重要课题。人类对于自身发生发育、成长、疾病、衰老死亡过程的许多分子机制尚属未知。即使对于许多已克隆的致病基因, 其功能的神秘面纱也还未彻底揭开,在疾病与基因基因与功能之间尚需架设起数万座桥梁。

基因功能的研究是科学研究的重要内容，也是一项复杂的工程。除了文中的研究方法

外，还有许多其他的方法可用于基因功能的研究。在实际工作中，研究者需要根据具体情况制定某一特定基因功能的研究方案，且对一个特定基因功能进行全面、系统的研究。相信通过广大研究者的努力创新、国际间的广泛合作以及新技术新方法的开创和应用，还会有更多更好的方法出现。在不久的将来，我们能够更全面了解基因组的功能，完成生命周期表的制作，认识人类基因组中约3万个基因是如何在人类的生长、发育、疾病、衰老、死亡等过程中发挥功能及相互协调，解密生命的奥秘。

结语

经过40多篇文献以及各种讲解ppt的查阅和总结，这篇总结报告篇幅过于庞大，经过几次删减最后还是有将近10页。基因的分离克隆及功能鉴定题目宽泛了些，当时选题时该再局限一点。通过这次学习，从做ppt到讲述ppt再到这篇报告的撰写，的确让我学到很多东西。虽然已经在实验室经过了一年多的学习和操作，但是发现自己所掌握的理论知识还是很少，平时运用的方法也只是众多实验方法中的冰山一角，如PDA-PCR、DD-PCR、SSH等在以前都闻所未闻。感谢他们把所有事都拿给我一个人做，让我有了更多的自知之明，革命尚未成功，同志尚需努力。

参考文献：

[1]孔建,沈岩,吴冠芸. 基因功能的鉴定一个新的挑战. 国外医学遗传学分册.1996,19(5);75-76.

[2]王冀姝,王莉,韩骅. 细胞内分布克隆—一种新的功能性基因克隆方法.生命的化

学.2002,22(6):322-325.

[3]郭榕,李勇.一种新的基因克隆方法—消减杂交差异显示分析方法.国际遗传学杂志.2006,29(3).

[4]鲁国东,王宗华,郑学勤,谢联辉. cDNA文库和PCR技术相结合的方法克隆目的基因.农业生物技术学报.1998,6(3):122-127.

[5] 易濒,常宏,曹毅. 肝癌组织及细胞系总RNA抽提逆转及基因克隆方法的改进与比较. 动物学研究2009，Oct．30(5):573-577.

[6]陈儒钢,巩振辉,逯明辉,李大伟,黄炜. 植物基因克隆技术的发展与展望.长江蔬菜.2009,20(4).

[7] 李杰之，常晓彤，林坚，黄翠芬，刷建光．从动物组织提取高纯度RNA方法的改进及应用．生物技术通讯.2002,l3(5)：256-261.

[8] 田振东，柳俊，谢从华．利用抑制差减杂交技术分离马铃薯晚疫病抗性相关基因lJI．遗传学报，2003，30(7).

[9] 孙兵 ,闫彩霞, 张廷婷，等. 基因芯片技术在植物基因克隆中的应用研究进展. 基因组学与应用生物学.2009,28(1).

[10] 张雷，杨志攀，刘一鸣，等．cDNA文库的差异筛选与抑制性减数杂交相结合分离胡萝体细胞胚根发育相关基因．自然科学进展，2002，12(3)：261—265．

[11] 周奕华, 党本元, 王槐, 等. 黑麦1R 染色体微克隆文库的构建与分析. 植物学报, 1999, 41( 12) .

[12] 常胜合，舒海燕，李滨，英加，李振声，2004，生物芯片技术研究进展，生物信息学，10(3)：31-3

[13] 陈志，曾照芳，2006，基因芯片技术的最新进展，国际检验医学杂志，27(3)：249．25

[14] 李景娟，张正斌，李魏强，等. 六倍体小麦基因克隆方法研究进展. 麦类作物学报.2007，27(2)：349—353.

[15] 邓伟，杨迎伍，胡楠等. 激活标记——一种有效的基因功能鉴定技术. 植物生理学

通.2008,44(2):357-360.

[16] 魏衍全，田宏，吴锦艳,等. RNAi实现方法及在免疫相关基凶功能鉴定中的应用. 中国人兽共患病学报.2010,26(11):1067-1070.

[17] 杜玉梅，左正宏. 基因功能研究方法的新进展. 生命科学.2008,20(4).

[18] 陈长宝. siRNAs介导的基因沉默技术和相关应用的研究进展.上海第二医科大学学

报.2005,25(11):1184-1187.

[19] 李子银，陈受宜.植物的功能——基因组学研究进展[J].遗传，2000，22(1)：57—60.

[20] 解涛，梁卫平，丁达夫.后基因组时代的基因组功能注释[J].生物化学与生物物理进展，2000，27(2)：166—170.

[21] 郑新民，刘中华，周木清,等. 基因沉默技术的研究动态及在畜牧业中的应用. 湖北畜牧兽

医.2008,6(3):15-19.

[22]刘海峰. 猪前脂肪细胞诱导分化前后SSH文库的构建及差异表达基因的筛选鉴定.

[23]张罕星, 朱晓彤, 束刚, 等. 猪脂肪前体细胞分化过程中聚脂相关基因的表达模式[J]. 动物学报, 2007,

53(1):143-150.

[24]何鹏, 江渝. 抑制性消减杂交技术及其应用研究进展[J]. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 2004,

25(4):653-853.

[25]黄涛, 熊远著, 徐德全, 等. 大梅与梅山猪背最长肌正反消减文库的构建及序列分析[J]. 农业生物技

术学报, 2006, 14(4):456-461.

[26]刘庆坡, 冯英, 董辉. 水稻线粒体丝氨酸羟甲基转移酶基因的电子克隆[J]. 生物信息学, 2005, 3(1):5-9.

[27] Nathalie Bonnefoy-Berard, Abdel Aouacheria, Claire Verschelde. Control of proliferation by Bcl-2 family members. Biochimica et Biophysica Acta 1644 (2004) 159– 168.

[28]由淑贞. 平邑甜茶MhNCED和MhCCD基因分离及功能初步鉴定.山东农业大学硕士毕业论文.2009.

[29] 崔凯，刘月琴，张英杰,等. 绵羊FecB基因分离克隆的研究进展. 全国养羊生产与学术研讨会议论文集:59-61.

[30] 张玉皓. 猪H2A.Z、DAZL基因分离鉴定及遗传效应分析.华中农业大学硕士毕业论文.2008.

附：

组员分工情况:

1.ppt制作及讲解:王宇豪

2.资料搜集:王宇豪,宁椿游,武启繁,陈映

3.报告撰写:王宇豪

(完整版)质粒DNA的提取、纯化与鉴定

分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的： 1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。二、实验原理： 1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。 2.凝胶电泳进行DNA分离纯化：电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可

【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析

（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多

控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸

荧光定量PCR、基因克隆和基因测序

临床分子生物学 1. 试述荧光定量PCR技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用。（1）原理：实时荧光定量PCR是一种将PCR扩增和扩增结果的检测有机地结合在一起的一种分子生物学技术，系在PCR反应体系中加入能够反映PCR反应进程的荧光报告基团，随着PCR 反应的进行，荧光信号强度也按特定的规律随PCR产物不断累积而增加。同时，每经过一个热循环，定量PCR仪收集一次荧光信号，通过实时监测反应体系荧光强度的变化来实时监测PCR扩增过程，最终得到荧光强度随PCR循环数的变化曲线。理论上，PCR的扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,其荧光量与扩增产物量亦成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。最后根据该曲线的特征及标准曲线实现起始模板数的精确定量。荧光定量PCR的扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。在荧光信号背景阶段，由于PCR扩增产生的荧光信号远远小于荧光背景信号，为背景荧光所掩盖，我们难以判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已经不再呈指数增加，PCR的终产物量与起始模板之间没有线性关系，所以用终产物量不能计算出起始模板的量。为了定量和比较的方便，在定量PCR中引入了三个非常重要的概念：荧光基线、荧光阈值和CT值。基线是指PCR循环开始时，虽然荧光信号累积，但仍在仪器可以检测的灵敏度下。基线范围的定义是从三个循环开始起到CT值前的第三个循环止。荧光阈值的确定是3－18个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。CT值的定义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。可见CT值取决于阈值，而阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，因此CT值是一个完全客观的参数。（2）方法： 1、引物设计遵守的原则 2、探针设计遵守的原则 3、RNA提取 4、逆转录逆转录成cDNA 5、常规PCR扩增（1）反应体系（2）混匀，瞬时离心。（3）设定扩增条件，进行扩增反应，循环35次。（5）产物用于琼脂糖电泳或-20℃长期保存。 6、实时荧光定量PCR扩增目的基因用假定初始拷贝数（X）的cDNA模板按10倍梯度进行稀释，制成标准模板系列，自每个稀释模板中取样5μl，分别加入30μl的反应体系中，行实时荧光定量PCR。反应体系在荧光定量PCR仪上进行，这种仪器较普通的PCR仪增加了一套复杂而紧密的荧光强度检测系统及数据分析系统，可对PCR反应过程中的每一循环的系统荧光强度进行实时（real-time）检测，通过对荧光强度的分析来达到等量检测的目的。将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期。45循环的扩增反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数（DRn）进行分析绘制每一反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值（threshold）时的扩增循环数（Ct值），根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数值作图，得到该样品的标准曲线。在此反应系统中，荧光强度的增加与模板量的增加成正比，荧光强度的变化可反应模板产物量的变化。 7、基因相对拷贝数的检测与计算 8、统计学分析

2019_2020高中生物专题1基因工程2第2课时目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定检测含解析人教版选修3

第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、选择题题型一目的基因导入受体细胞 1．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是( ) 答案 B 解析花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；将目的基因导入微生物细胞，常采用感受态细胞法(Ca2＋处理法)，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；双子叶植物和裸子植物常用农杆菌转化法导入目的基因，单子叶植物(如小麦)可用基因枪法导入目的基因，D 正确。 2．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是( ) A．Ti质粒上 B．受体细胞染色体的DNA上 C．T-DNA D．农杆菌的拟核答案 B 解析在农杆菌转化法中利用农杆菌的T-DNA将目的基因整合到受体细胞染色体的DNA 上。 3．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是( ) A．显微注射法B．农杆菌转化法 C．基因枪法D．花粉管通道法答案 A 解析显微注射法是迄今为止将目的基因导入动物细胞中采用最多、最有效的一种方法。 4．在基因工程技术中，需要用氯化钙处理的环节是( ) A．目的基因的提取和导入 B．目的基因与载体结合 C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的表达答案 C 解析如果载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，使其成为感受态细胞，使含有目的基因的重组DNA分子更容易进入受体细胞，目的基因导入受体细胞后，

新基因的克隆

新基因克隆技术原理的概述摘要：新基因克隆是当今生物学最热点的领域之一，为能快速而准确地克隆目的基因, 本文综述了一些基因克隆常用技术,包括功能性克隆，表型克隆，图位克隆，转座子标签技术，电子克隆等；通过从技术原理、适应性及使用例证等方面进行综述和评价，以便在实际研究中可以选用较为可行的方案。关键词：新基因克隆技术原理从上世纪70年代, 由于以限制性核酸内切酶、DNA连接酶、逆转录酶的发现和应用及外源性DNA转化感受态E. coli.实验成功为标志的基因工程的出现, 使人们可以在分子水平对目的基因进行克隆。根据“中心法则”遗传信息的流向,克隆新基因的途径主要分为正向遗传学途径和反向遗传学途径:前者主要通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行,而后者则是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。正向遗传学途径常见的方法如传统的功能克隆(functional cloning)、表型克隆(phonetypical cloning)包括递减杂交(substractive hybridization)、差异显示PCR (DD-RT PCR)、代表性差示分析法(RDA)、抑制性扣除杂交(SSH) 等; 而反向遗传学途径则以图位克隆(map-based cloning)与转座子标签(transposon tagging )技术较为常见, 在未知基因的功能信息又无适宜的相对表型用于表型克隆时,上述两

种方法较为常用; 同时随着现代生物信息学的发展, 电子克隆(silicon cloning)出现, 更为研究者提供了方便、迅捷的方法。 1功能性克隆(functional cloning) 1.1纯化后克隆若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时,可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法, 筛选阳性克隆获取其目的基因(1),除了免疫筛选方法外, 也可根据目的蛋白的生物学功能,利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得, 但纯度较高时, 可利用其中的一段氨基酸序列, 反推出其基因序列, 据此合成寡核苷酸用cDNA文库的筛选;或根据所获得的基因序列,指导5′端的引物合成,根据mRNA3′端poly-A 序列指导合成poly-T的3′端引物, 用PCR 技术从制备细胞的mRNA 或直接从胞浆内溶物物中合成相应cDNA, 将该cDNA克隆到表达载体上进行产物表达。 1. 2同源性克隆生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列,基于此原理,在其它种属同源基因被克隆的前提下, 构建cDNA文库或基因组文库,然后用已知分子高保守序列制备同源探针,经标记后从相应的文章中筛选阳性克隆,并经核酸序列分析鉴定所克隆的基因,当然在没有全同源探针的情况下,可以使用部分同源探针来筛选与探针序列相关但不完全相同的基因。 2表型克隆( phonetypical cloning)

功能基因的克隆及生物信息学分析

功能基因的克隆及其生物信息学分析摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。

肌动蛋白的克隆与鉴定

β—肌动蛋白的克隆与验证李亚楠邹曾阳孟冠奇李军张建忠沈彤摘要：Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-acti n(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。[1]β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot 很好的内参指数。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。[2] 本次实验主要通过PCR的手法来扩增目标蛋白。通过组织细胞提取DNA，用琼脂凝胶电泳来验证是否得到目标DNA；回收后的目标DNA 用PCR仪扩增，并用电泳进行回收；与T载体（PUD-18T）连接；用培养的大肠杆菌DH-5a来制备感受态细胞；将制备完成的感受态细胞均匀的涂布于含有x-gal和IPTG的混合液的LB培养基平板中进行蓝白斑的筛选；最后提取质粒DNA，经验证后保藏菌种。关键词：β-肌动蛋白横纹肌蛋白质PCR 1材料与方法 1.1 组织细胞DNA提取。[3] 1.1.1 试剂：细胞裂解缓冲液、蛋白酶K、TE缓冲液、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、7.5mol/l乙酸铵。器材：胶头滴管、离心机、烧杯、动物组织、研钵、水浴。 1.1.2 方法取新鲜或冰冻动物组织块0.1g，尽量剪碎，置于石英研钵中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K20微升，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴20min，间歇震荡离心管数次。于台式离心机以

人教版高中生物选修3检测目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定

第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、选择题题型一目的基因导入受体细胞 1．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是() 选项受体细胞导入方法 A 棉花细胞花粉管通道法 B 大肠杆菌农杆菌转化法 C 羊受精卵显微注射技术 D 小麦细胞基因枪法答案 B 解析花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；将目的基因导入微生物细胞，常采用感受态细胞法(Ca2＋处理法)，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；双子叶植物和裸子植物常用农杆菌转化法导入目的基因，单子叶植物(如小麦)可用基因枪法导入目的基因，D正确。 2．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是() A．Ti质粒上 B．受体细胞染色体的DNA上 C．T-DNA D．农杆菌的拟核答案 B 解析在农杆菌转化法中利用农杆菌的T-DNA将目的基因整合到受体细胞染色体的DNA上。 3．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是() A．显微注射法B．农杆菌转化法 C．基因枪法D．花粉管通道法答案 A

解析显微注射法是迄今为止将目的基因导入动物细胞中采用最多、最有效的一种方法。 4．在基因工程技术中，需要用氯化钙处理的环节是() A．目的基因的提取和导入 B．目的基因与载体结合 C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的表达答案 C 解析如果载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，使其成为感受态细胞，使含有目的基因的重组DNA分子更容易进入受体细胞，目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的复制而复制。 5．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞的主要原因是() A．结构简单，操作方便 B．繁殖速度快 C．遗传物质含量少，易操作 D．性状稳定，变异少答案 B 解析微生物一般具有以下几个特点：①个体微小，结构简单；②繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代；③代谢类型多，活性强；④易变异，相对于高等生物而言，较容易发生变异。在基因工程中，主要是利用它快速繁殖的特点，可以提供更多的基因工程的产物。 6．目的基因整合到某作物DNA片段上后() A．改变了原DNA的碱基排列顺序 B．改变了原DNA上各基因的碱基排列顺序 C．改变了原DNA上各基因的复制过程 D．改变了原DNA上各基因的转录过程答案 A 解析目的基因整合到某作物的DNA片段上后，不能改变其他基因的碱基序列，也不能改变基因的复制和转录过程，B、C、D错误；只能改变原DNA的碱基排列顺序，A正确。 7．人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体加工合成。通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是() A．大肠杆菌B．酵母菌

BOP基因的克隆及鉴定

Bop基因克隆摘要：以pUC18质粒为载体，bop基因为目的基因，通过PCR扩增出含目的基因，将克隆载体pUC18和bop基因经限制性内切酶酶切后，在T4DNA接酶连接下，形成重组质粒并转化入大肠杆菌DH5a。通过氨苄青霉素平板筛选出抗性转化子，对重组子进行PCR和酶切，电泳鉴定检测完成了bop基因额的克隆。关键词：基因克隆；PCR；BOP基因第一章 1.前言 1.1 基因工程狭义上仅指基因工程。是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状。重组DNA分子需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆（Gene Cloning）。广义上包括传统遗传操作中的杂交技术、现代遗传操作中的基因工程和细胞工程。是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；

下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。广义的基因工程是一个高度的统一体：上游重组DNA的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；下游过程则是上游重组蓝图的体现与保证。---基因工程产业化的基本原则。基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种（species）间限制，扩大和带来了定向改造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质的转移和重新组合。[1] 1.2 PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将

基因分离克隆和功能鉴定.

动物遗传学读书报告之新基因的分离克隆及功能鉴定学院班级：动物科技学院动物科学10级2班新基因分离克隆及功能鉴定方法研究进展前言随着DNA 分子双螺旋结构、密码子等的被发现，几种模式生物基因组测序和人类基因组计划的相继完成，使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。基因组学时代的主要任务是图谱制作性和序列测定，后基因组学时代则是进行基因组功能注释，这也是功能基因组学的主要研究目标。而PCR 技术的诞生，推动了许多新技术和方法的应用。 1. 基因的分离克隆基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。分子克隆是指在体外对不同生物的DNA 分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA 。基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。 1.1基因的分离克隆主要方法基因分离与克隆是基因工程的第一步，它是利用分子克隆技术获取用于转化、控制目的性状相关的基因。一般方法是先建立文库(基因组文库或cDNA 文库，再利用适当的探针，通过分子杂交从基因文库分离出目的基因，这是应用最早，目前最为成熟的一种方法。而对于未知序列，常采用步移的方法，其原理是如果知道离开该基因一定距离上的DNA 序列，则可用这个DNA 序列作探针，通过染色体步移来逐步接近并最后达到待克隆的基因。先用探针筛查文库，得到阳性克隆后，将

这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库。通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。以下对目的基因分离和克隆方法作一总结。 1.1.1功能性克隆通过基因产物的克隆技术在传统遗传学占主导地位的时代，人们以基因产物为导向来分离克隆基因。由于基因产物的结构、功能已知，可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列，反推其核苷酸序列，设计探针或引物从基因组DNA 文库或cDNA 文库中筛选克隆，也可以制备产物抗体，从表达载体构建的cDNA 文库中筛选相应克隆，进而分离目的基因。若可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因。除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA 文库的筛选；或根据所获得的基因序列，指导5’端的引物合成，根据mRNA 3’端poly —A 序列指导合成poly —T 的3’端引物，用PCR 技术从制备细胞的mRNA 或直接从胞浆内溶物中合成相应的cDNA ，将该cDNA 克隆到表达载体上进行产物表达。 1.1.2同源性序列克隆技术随着基因研究的不断深入，人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA 文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列设计简并引物，并用简并引物对含有目的基因的DNA 文库

第五章基因克隆技术

第五章基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。基因克隆的一般程序为：一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。 2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。 3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。 4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是：(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子；(2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源DNA片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选；(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。 1、质粒载体质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点：分子相对较小(3~10kb)；含松弛型复制子因而在

2017-2018学年高中生物第一章基因工程第一节基因工程概述-导入检测和鉴定目的基因同步备课教学案

第3课时导入、检测和鉴定目的基因 [学习导航] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。[重难点击] 1.目的基因导入受体细胞的方法。2.检测和鉴定目的基因的方法。方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取及基因表达载体的构建。在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同、宿主细胞不同，将重组DNA导入宿主细胞的具体方法也不相同。方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。一、导入目的基因将目的基因导入受体细胞的方法和过程 1．农杆菌转化法的分析

(1)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？答案基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。 (2)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上？答案农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。 2．植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？答案植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。 3．为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？答案微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点。 1．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。如图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题： (1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是____________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T－DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到_______(部位)即可。

人类疾病基因的鉴定与分离

人类疾病基因的鉴定与分离医学遗传学研究的一项重要任务就是建立基因型与表现型之间的关系，也就是寻找疾病的致病基因。通过本课程的学习，将让学生明确分离单基因病致病基因及复杂疾病易感基因的基本思路与常用方法，本课程主要内容包括：基因的基本结构，突变与多态，常用的突变检测方法，不同多态的分型技术，连锁分析的原理，Lod score的计算，Hardy-Weinberg 平衡定律，关联分析的原理及应用，样本量估计，以及复杂疾病分析中的常用统计方法，分子病理。 This course is designed to give students a practical knowledge of the principles and practice of Medical Genetics which will allow them to evaluate, choose and interpret appropriate genetic investigations for individuals, families and populations with genetic disease. Also，we aim to ensure students develop the skills to know how to make the connection between genotypes and phenotypes by using of linkage analysis, mutation analysis, association studies. The major fields of this course involve: gene structure, mutation and polymorphism (RFLP, STR, SNP), linkage analysis, Lod score, Hardy-Weinberg equilibrium, association study, genotyping techniques, sample size calculation, common used statistical analysis，molecular pathology.

全长基因的克隆

全长基因的克隆王闵霞　马欣荣　代富英　谭　红 (中国科学院成都生物研究所,成都610041) 摘　要:新基因全长cDNA序列、全长DNA序列的获得常常是分子生物学工作者面临的难题。本文就克隆全长基因的各种技术如文库筛选法、各种PCR技术及新发展起来的电子克隆法等方法作一简单综述。关键词:全长基因　克隆　文库筛选法　PCR　电子克隆 The Cloning of Entire G ene WANG Minxia　MA Xinrong　DAI Fuying　TAN H ong (Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu610041) Abstract:To obtai n the enti re DN A or cDN A sequence of a new gene is a problem f or researchers.The article described the techniques that are used to clone the enti re gene,f or ex am ple:screeni ng li2 braries,a great variety of PCR techniques and new developed silico cloni ng. K ey w ords:enti re gene,cloni ng,screeni ng libraries,PCR techniques,silico cloni ng 研究一个基因的结构、功能及其表达产物的特性,完整的基因信息是必需的,但是新基因全长cD2 NA序列的获得常常是分子生物学工作者面临的难题。随着分子生物学技术的飞速发展和广泛应用,对基因进行克隆的技术在原有的基础上也有了许多新的发展,例如差别显示杂交、抑制性差减杂交、RAP2PCR、代表性差异显示、酵母双杂交系统、cD2 NA直接捕捉法等。本文就克隆全长基因的各种技术作一简单介绍。 1　文库筛选法文库筛选法是克隆基因最经典的方法,至今仍广泛应用。构建文库主要有两种类型:基因组文库和cDNA文库。 1.1　从DNA入手,建立基因组文库作为遗传学科研究的重要内容,基因组文库的概念早在七十年代就已提出,Maniatis于1978年设计了随机片段克隆的方案。选择含有目的基因的基因组DNA,应用物理或酶学方法打断,再选择合适的载体与DNA片段连接,然后转化至受体细胞,培养得到基因组文库。然后选择合适的方法,如Southern杂交筛选法、HDR(高密度影印膜)杂交筛选或者PCR法等,对基因组文库进行筛选、测序。Shuichi等使用的两步PCR鉴定技术可在一天内找到所需的克隆。王瑛等以λ噬菌体EMBL23为基因载体,构建大麻哈鱼(Oncorhynchus keta)的基因组文库,并从中分离出了全长3361bp的生长激素(cs2 GH)基因的克隆[1]。然而有时候筛选的结果得到的仅仅是基因片段,这时有必要进行染色体步行以得到基因片段旁边的序列。染色体步行(Chromosome Walking)是指由基因组或基因组文库中的已知序列出发逐步探知

转基因植物的检测与鉴定

收稿日期:2006-09-28转基因植物的检测与鉴定宫雪超,于丽杰,高金秋 (哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江哈尔滨150025) 摘要:对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围、转基因植物的检测和鉴定方法、转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述. 关键词:转基因植物;检测;鉴定;评价 [中图分类法]Q943[文献标识码]A[文章编号]1003-6180(2007)01-0015-03 植物转基因实验因受体系统的限制,外源基因的转化频率较低,为了达到转化目的,必然要获得大量的转化材料,如何在数以千万计的转化植株或细胞中,快速、有效地检测出转基因阳性植株或细胞,外源基因是否整合到植物染色体上,整合的方式如何,整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题,就成为重要的研究课题.根据外源基因表达的不同水平,对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行:整合水平、转录水平和翻译水平.本文从外源基因表达的不同水平,阐述转基因植物的检测与鉴定. 1外源基因整合水平的鉴定检测外源基因是否转化成功,首先是对报告基因进行检测,必要时再进行目的基因的检测,检测目的基因需要采用分子杂交方法. 1.1报告基因报告基因必须具有两大特点:一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在;二是便于检测.目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因.大致分为两类:抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因.现在常用的报告基因主要有:gus基因、cat基因、冠瘿碱合成酶基因、np tò基因、gf p基因、bar 基因[1]、荧光素酶基因、二氢叶酸还原酶基因等.近年来,绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用,并显示出较其他几个报告基因更大的优越性. gf p基因的检测gf p基因具有以下优点:1适用于各种生物的基因转化;o检测方法简便,无需底物、酶、辅因子等物质,只要有紫外光或蓝光照射,其表达产物就可以发出绿色荧光,这对转化细胞的检测极为有利;?便于活体检测,十分有利于活体内基因表达调控的研究;?检测时可获得直观信息,有利于转基因植物安全性问题的研究及防范.若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时,很容易通过光照获得直观信息. gus基因的检测g us基因也是广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因,尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中,gus基因应用的最多.gus基因3-端与其他结构形成的融合基因能正常表达,所产生的融合蛋白仍具有gus活性,这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件,这是它的一大优点.但是需要注意的是,有一些植物在胚胎状态时能产生内源gus活性,Sory u[2]在转基因R0和R1代的子叶、花粉和胚珠中检测到g us活性,随着组织的成熟衰老,g us表达逐渐停止.在实验过程中要设定严格的阴性对照.g us活性的检测方法有很多,包括组织化学法、色谱法、荧光法等,其中植物切片gus 组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法. 1.2转基因植株的PCR检测 PCR(聚合酶链式反应poly merase chain re-actio n)是首选的转基因产品检测方法.PCR技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段DNA,可以检测到每克样品含有20pg~10ng的转化基因成分,对转基因产品大分子量DNA检测的灵敏度可以达到样品含量的0.0001%[3].因为PCR的高度特异性及检测所需的模板量仅为10ng以内,所以为外源基因整合的检测提供了便利条件,尤其是在转化材料少又需及早检测的时候.现在已经利用该技术对欧美杨[4]、番茄[5]、辣椒、葡萄、豆瓣菜、小麦[6]等转基因植物进行鉴定,是转基因植物鉴定中最简单、最常用的方法[7].PCR检测具有DNA用量少,操作简单,成本低,耗时少,不需要同位素等优点,但PCR检测也存在缺点,由于PCR扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩增,因此检测只能作为初步结果. 1.3Southern杂交证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是DNA So uther n杂交,只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物. # 15 #