蜡样芽胞杆菌检验

蜡样芽胞杆菌及检验

蜡样芽胞杆菌及检验 在《Bergey氏鉴定细菌学手册》第8版中，蜡样芽胞杆菌的分类地位为芽胞杆菌属的第I群，该群有22个种。根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌属“大细胞菌种”。 1950年Hauge在对挪威奥斯陆某医院职工和病员进食甜食后引起的食物中毒研究中，首次明确指出蜡样芽胞杆菌的致病作用。 一、生物学特性 1、形态特性 蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，大小为1-1.3×3-5μm，兼性需氧，形成芽胞，芽胞不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似。引起食物中毒的菌株多为周鞭毛，有动力。 2、培养特性 蜡样芽胞杆菌生长温度为25-37℃，最佳温度30-32℃。在肉汤中生长混浊有菌膜或壁环，振摇易乳化。在普通琼脂上生成的菌落较大，直径3-10mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状。偶有产生黄绿色色素，在血琼脂平板上呈草绿色溶血。在甘露醇��卵黄多粘菌素（MYP）平板上，呈伊红粉色菌落。 3、生化特性

b+/-，50-50% 菌株是阳性； c-， 90-100% 菌株是阴性； d-，绝大多数菌株是阴性。 4、耐热性 蜡杆芽胞杆菌耐热，其37℃16小时的肉汤培养物的D80℃值（在80℃时使细菌数减少90%所需的时间）约为10-15分钟；使肉汤中细菌（2.4×107/mL）转为阴性需100℃20分钟。其游离芽胞能耐受100℃30分钟，而干热灭菌需120℃60分钟才能杀死。 二、流行病学 1、细菌分布 蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。 在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。 2、流行情况 蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，如1982年犬饲等对日本名古屋所采1641份食品样品中，有193份检出了该菌、阳性率为11.8%；1984年我国有关单位对南京市所采211份食品样品中，有81份检出了该菌，阳性率为38.4%。 蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（6-10月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。中毒的发病率较高，一般为60-100%。但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。1985年9月，美国缅因州的健康局报导了在一家日本餐馆发生了食物中毒而导致的胃肠炎事件，经调查所有的食品其加工和储藏都是规范的，仅用剩饭制作的炒饭其是冷藏储放还是在室温放置说不清楚，在炒饭中虽然找不到活的蜡样芽胞杆菌，但是完全可能存在重新加热过程中消除了活菌而没有破坏热稳定毒素的可能性。 3、临床症状 当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>106/克时常可导致食物中

蜡样芽孢杆菌试纸说明书

商品名称：蜡样芽孢杆菌测试片 规格：24批次/盒 检测项目：用于乳制品、肉类、淀粉类食品、各种甜点等的蜡样芽孢杆菌检测产品简介： 蜡样芽孢杆菌测试片(FilmplateTM Bacillus cereus BL210)是一种商品化的一次性培养基产品，由选择性培养基、高分子吸水凝胶和专一性酶指示剂等构成，一步培养显色就可确认是否有病原菌的存在，大大地简化了检测程序，对于提高细菌性食物中毒突发事件的反应能力具有重要的作用，同时也可在食品生产企业使用。本产品适用于乳制品、肉类、淀粉类食品、各种甜点等的快速检测。执行标准：食品卫生微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验（GB/T 4789.14-2003）。 技术参数 1、样品处理：取样品25mL（g）放入含有225mL灭菌磷酸缓冲液稀释液（或生理盐水）的取样罐或均质杯内，制成1:10的样品匀液。用1mL灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL稀释液的试管内，振摇后成为1:100的样品匀液。 2、接种：将蜡样芽孢杆菌测试片(BL210)置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管每个梯度各取1mL样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置10s左右，使培养基凝固，每个稀释度接种两片，同时做一片空白对照。 3 、培养：将测试片叠在一起放回原自封袋中，并封口，透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过12片。培养温度为36℃±1℃，培养15～24h。 4、结果判读：对测试片进行观察，呈蓝绿色的菌落为蜡样芽孢杆菌。对于出现阳性菌落的样品，最好用其他方法作进一步的鉴定。 品牌：天迈生物 产地：杭州

附加说明 1、本产品具有很好的特异性，接种蜡样芽孢杆菌纯菌株产生典型的蓝绿色点，而大部分非目标菌如大肠杆菌、大肠杆菌O157、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌和阪崎肠杆菌等均被抑制。 2、初步试验表明，蜡样芽孢杆菌测试片对纯菌的最低检测限为1cfu/mL。用蜡样芽孢杆菌测试片检测了23种食品样品，同时接种平皿做对比试验。测试片检出阳性样品7个，检出率为30.4％；用平皿法检出阳性样品6个，检出率为26.1％，测试片法比平皿法高了4.3％。 3、注意使用过的测试片上带有活菌，需及时按照生物安全废弃物处理原则进行处理。 4、保存条件：本产品需存放在4℃～10℃冰箱中，保质期为一年，铝箔袋打开后,未用完的纸片要放回铝箔袋中封好，放到冰箱中，一个月内用完。在高湿度的环境中可能出现冷凝水，最好在拆封前将整包回温至室温。

蜡样芽孢杆菌风险评估

蜡样芽胞杆菌的生物危害评估报告 一、细菌的传播与致病 蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国则主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。 1950年Hauge在对挪威奥斯陆某医院职工和病员进食甜食后引起的食物中毒研究中，首次明确指出蜡样芽胞杆菌的致病作用。蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，如1982年犬饲等对日本名古屋所采1641份食品样品中，有193份检出了该菌、阳性率为11.8%；1984年我国有关单位对南京市所采211份食品样品中，有81份检出了该菌，阳性率为38.4%。 蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（6-10月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。中毒的发病率较高，一般为60-100%。但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。 当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>106/克时常可导致食物中毒。蜡样芽胞杆菌食物中毒在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类。呕吐型的潜伏期为0.5-6小时，中毒症状以恶心、呕吐为主，偶而有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24小时，这种类型的症状类似于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。腹泻型的潜伏期为6-15小时，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24小时，这种 类型的症状类似于产气荚膜梭菌引起的食物中毒。严重者还可导致败血症。 蜡样芽胞杆菌引起食物中毒是由于该菌可产生肠毒素。它产生两种性质不同的代谢物，引起腹泻型综合症的是一种大分子量蛋白；而引起呕吐型综合症的被认为是一种小分子量、热稳定的多肽。致呕吐型综合症的肠毒素至今尚未提纯，致腹泻型综合症的肠毒素已提纯，其纯化的肠毒素分子量为55-6.0×103。致腹泻的肠毒素能使小白鼠致死。 二、细菌的生物学特性 蜡样芽胞杆菌分类为芽胞杆菌属的第I群，该群有22个种。根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌属“大细胞菌种”。 蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，大小为1-1.3×3-5μm，需氧或兼性需氧，生长6h即可形成原形芽胞，芽胞位于菌体的中心或次末端不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似。引起食物中毒的菌株多为周鞭毛，有动力无荚膜。它的生长温度为25-37℃，最佳温度30-35℃。在肉汤中生长混浊有菌膜或壁环，振摇易乳化。在普通琼脂上

MMFSCNJ出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法

MM_FS_CNJ_0158出口食品蜡样芽孢杆菌微生物法 MM_FS_CNJ_0158 出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法 1.适用范围 本方法适用于出口食品的检验。 2.培养基和仪器 2.1.培养基 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)； 胰酪胨大豆多粘菌素肉汤； 酚红葡萄糖肉汤； 硝酸盐肉汤； 营养琼脂； l-酪氨酸营养琼脂； 溶菌酶营养肉汤； 改良V-P培养基； 动力培养基； 胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)； Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液； 亚硝酸盐试剂； V-P试剂； 碱性复红染色液。 2.2.仪器 吸管：容量1.0mL和10.0mL，具0.1mL刻度； 菌落计数器； 均质器； 厌氧培养装置； 涡动搅拌器； L形玻璃棒； 恒温培养箱：30℃及36±1℃。 3.样品的保存和送检 待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。送达实验室后，应保存于4 ℃并尽快进行检验。如在4d内不能进行检验，应将样品储存在－20℃，检验前再于室温下解冻。 脱水食品可在常温下送检和储存。 4.样品的制备 4.1.以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。称取50g放于无菌均质杯中。 4.2.加450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000～20000r/min均质2min。制成1∶10样品稀释液。 4.3.取1∶10稀释液10.0mL加到含有90.0mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中，充分混匀制成1∶100的稀释液。 4.4.每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10－6。

5.检验步骤 5.1.平板计数法 取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面。每稀释度接种两个MYP琼脂平板。 将平板置于30℃培养24h。 选取具有15～150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板，进行计数。并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。 蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色，环绕产生卵磷脂酶沉淀环。如反应不典型，可继续培养24h再计数。 计数后，从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面，于30℃培养24h，按第6章进行证实试验。 根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的菌落数，按比例计算出该皿内的蜡样芽孢杆菌菌落数，然后乘其稀释倍数再乘以10，即得每克样品所含蜡样芽孢杆菌数并作出报告。例：将检样10－4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上，生成的可疑菌落数为25个，取5个进行鉴定，证实为蜡样芽孢杆菌的是4个，则1g 样品中蜡样芽孢杆菌数为(25×4/5)×104×10＝2×106。 5.2.最近似值(MPN)法 适用于污染蜡样芽孢杆菌数不大于103个/g的食品。 选用三管法MPN系列。取10－1、10－2、10－3三种稀释液，每种稀释液接种3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤，每管接种1mL。 置于30℃培养48±2h。 从长菌的试管取培养物划线接种到MYP琼脂平板上。 置30℃培养24～48h。 从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环的单个菌落，接种营养琼脂斜面，置30℃培养24h，供作证实试验。 根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的管数，由MPN表〔附录C(补充件)〕计算蜡样芽孢杆菌的MPN值/g，并作出报告。 6.证实试验 6.1.形态观察 取营养琼脂斜面培养物，作革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大。 6.2.生化学性状 葡萄糖发酵试验： 接种于酚红葡萄糖肉汤中，厌氧条件下35 ℃培养24h。培养基应由红色变为黄色(表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸)。 硝酸盐还原试验： 接种于硝酸盐肉汤中，35℃培养24h。加硝酸盐试剂后应为阳性反应(红色)。 V-P试验： 接种于改良V-P培养基中，35℃培养48h。加V-P试剂及肌酸数粒，静止1h，应为阳性反应(伊红色)。 L-酪氨酸分解试验： 接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35 ℃培养48h，阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区(表示产生酪蛋白酶)。阴性时应继续培养72h再观察。 溶菌酶试验：

蜡样芽孢杆菌

蜡样芽孢杆菌 蜡样芽孢杆菌是芽胞杆菌属中的一种，1950年首次在挪威报告，与人类的密切关系是会引起食物中毒，中毒者症状为腹痛、呕吐腹泻。 形态特征 芽胞杆菌属(Bacillus)中的一种。菌体细胞杆状，末端方，成短或长链，1.0～1.2×3.0～5.0微米。产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5微米，孢囊无明显膨大。革兰氏阳性，无荚膜，运动。菌落大，表面粗糙，扁平，不规则。菌落形态：在普通琼脂平板培养基上，37 ℃，培养24 h，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落(似蜡烛样颜色)直径5-7 mm．在M.S.P 培养基上生长更旺盛，菌落直径达8-10 mm，质地更软，挑起来呈丝状，培养时间稍长，菌落表面呈毛玻璃状，并产生红色色素。在蛋白胨酵母膏平板上菌落为灰白色，不透明，表面较粗糙，似毛玻璃状或融蜡状，菌落较大。蜡状芽胞杆菌细菌对外界有害因子抵抗力强，分布广，是典型的菌体细胞，有部分菌株能产生肠毒素，呈杆状(约1.5μm)，有色，孢子呈椭圆形，有致呕吐型和腹泻型胃肠炎肠毒素两类。 生态习性 兼性好氧。生长温度范围20～45℃，10℃以下生长缓慢或不生长。存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。在葡萄糖肉汤中厌氧培养产酸，从阿拉伯糖、甘露醇、木糖不产酸，分解碳水化合物不产气。大多数菌株还原硝酸盐，50℃时不生长。在100℃下加热20min可破坏这类菌。 经济用途 与人类关系密切是引起食物中毒，中毒者症状为腹痛、呕吐腹泻。蜡状芽胞杆菌可产生抗菌物质，抑制有害微生物的繁殖，降解土壤中的营养成分，改善生态环境。可产生细菌蛋白酶；可用于麻脱胶，是各种抗生素抗菌活性的测定菌。可用于明胶液化，牛奶胨化，还原硝酸盐，水解淀粉。 病症 蜡样芽胞杆菌与少数食物中毒有关(约2–5%)，包括一些严重的恶心、呕吐以及腹痛。大概来说，杆菌性食物中毒是由于错误地烹调方法造成细菌孢子残留在食物上，更糟糕的是食物被不当冷冻而让孢子发芽。细菌繁殖的结果是产生肠毒素，人食用含毒素的食物后会产生呕吐、腹泻等不良症状。

蜡样芽胞杆菌生物危害评估报告

蜡样芽胞杆菌生物危害评估报告 一、细菌的传播与致病 蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国则主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关。 1950年Hauge在对挪威奥斯陆某医院职工和病员进食甜食后引起的食物中毒研究中，首次明确指出蜡样芽胞杆菌的致病作用。蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，如1982年犬饲等对日本名古屋所采1641份食品样品中，有193份检出了该菌、阳性率为11.8%；1984年我国有关单位对南京市所采211份食品样品中，有81份检出了该菌，阳性率为38.4%。 蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（6-10月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。中毒的发病率较高，一般为60-100%。但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。 当摄入的食品其蜡样芽胞杆菌数量达>106/克时常可导致食物中毒。蜡样芽胞杆菌食物中毒在临床上可分为呕吐型和腹泻型两类。呕吐型的潜伏期为0.5-6小时，中毒症状以恶心、呕吐为主，偶而有腹痉挛或腹泻等症状，病程不超过24小时，这种类型的症状类似于由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒。腹泻型的潜伏期为6-15小时，症状以水泻、腹痉挛、腹痛为主，有时会有恶心等症状，病程约24小时，这种 类型的症状类似于产气荚膜梭菌引起的食物中毒。严重者还可导致败血症。 蜡样芽胞杆菌引起食物中毒是由于该菌可产生肠毒素。它产生两种性质不同的代谢物，引起腹泻型综合症的是一种大分子量蛋白；而引起呕吐型综合症的被认为是一种小分子量、热稳定的多肽。致呕吐型综合症的肠毒素至今尚未提纯，致腹泻型综合症的肠毒素已提纯，其纯化的肠毒素分子量为55-6.0×103。致腹泻的肠毒素能使小白鼠致死。 二、细菌的生物学特性 蜡样芽胞杆菌分类为芽胞杆菌属的第I群，该群有22个种。根据营养型菌细胞的宽度分为两类，蜡样芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌、炭疽芽胞杆菌和巨大芽胞杆菌属“大细胞菌种”。 蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，大小为1-1.3×3-5μm，需氧或兼性需氧，生长6h即可形成原形芽胞，芽胞位于菌体的中心或次末端不突出菌体，菌体两端较平整，多数呈链状排列，与炭疽杆菌相似。引起食物中毒的菌株多为周鞭毛，有动力无荚膜。它的生长温度为25-37℃，最佳温度30-35℃。在肉汤中生长混浊有菌膜或壁环，振摇易乳化。在普通琼脂上

出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法

MM_FS_CNJ_0340出口食品蜡样芽孢杆菌平板计数法 MM_FS_CNJ_0340 出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法 1.与适用范围 本方法适用于出口食品的检验。 2.主要试剂和仪器 2.1.主要试剂（包括培养基） 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂（MYP）； 胰酪胨大豆多粘菌素肉汤； 酚红葡萄糖肉汤； 硝酸盐肉汤； 营养琼脂； L－酪氨酸营养琼脂； 溶菌酶营养肉汤； 改良V－P培养基； 动力培养基； 胰酪胨大豆羊血琼脂（TSSB）； Betterfield氏磷酸盐缓冲稀释液； 亚硝酸盐试剂； V－P试剂； 碱性复红染色液。 2.2.仪器 吸管：容量1.0mL和10.0mL，具0.1mL刻度； 菌落计数器； 均质器； 厌氧培养装置； 涡动搅拌器； L形玻璃棒； 恒温培养箱：30℃及36±1℃。 3.样品的保存和送检 待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。送达实验室后，应保存于4℃并尽快进行检验。如在4d内不能进行检验，应将样品储存在－20℃，检验前再于室温下解冻。 脱水食品可在常温下送检和储存。 4.过程简述 4.1.样品的制备 4.1.1.以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。称取50g放于无菌均质杯中。 4.1.2.加450ml无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000～20000r／min均质2min。制成1∶10样品稀释液。 4.1.3.取1∶10稀释液10.0mL加到含有90.0mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中，充分混匀制成1∶100的稀释液。 4.1.4.每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀

释直至10－6。 4.2.检验步骤 4.2.1.平板计数法 4.2.1.1.取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面。每稀释度接种两个MYP琼脂平板。 4.2.1.2.将平板置于30℃培养24h。 4.2.1.3.选取具有15～150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板，进行计数。并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。 蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色，环绕产生卵磷脂酶沉淀环。如反应不典型，可继续培养24h再计数。 4.2.1.4.计数后，从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面，于30℃培养24h，按第6章进行证实试验。 4.2.1. 5.根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的菌落数，按比例计算出该皿内的蜡样芽孢杆菌菌落数，然后乘其稀释倍数再乘以10，即得每克样品所含蜡样芽孢杆菌数并作出报告。例：将检样10－4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上，生成的可疑菌落数为25个，取5个进行鉴定，证实为蜡样芽孢杆菌的是4个，则1g 样品中蜡样芽孢杆菌数为（25×4／5）×104×10＝106。 4.2.2.最近似值（MPN）法 适用于污染蜡样芽孢杆菌数不大于103个／g的食品。 4.2.2.1.选用三管法MPN系列。取10－1、10－2、10－3三种稀释液，每种稀释液接种3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤，每管接种1mL。 4.2.2.2.置于30℃培养48±2h。 4.2.2.3.从长菌的试管取培养物划线接种于MYP琼脂平板上。 4.2.2.4.置30℃培养24～48h。 4.2.2. 5.从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环的单个菌落，接种营养琼脂斜面，置30℃培养24h，供作证实试验。 4.2.2.6.根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的管数，由MPN表［附录C（补充件）］计算蜡样芽孢杆菌的MPN值／g，并作出报告。 4.3.证实试验 4.3.1.形态观察 取营养琼脂斜面培养物，作革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大。 4.3.2.生化学性状 4.3.2.1.葡萄糖发酵试验 接种于酚红葡萄糖肉汤中，厌氧条件下35℃培养24h。培养基应由红色变为黄色（表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸）。 4.3.2.2.硝酸盐还原试验 接种于硝酸盐肉汤中，35℃培养24h。加硝酸盐试剂后应为阳性反应（红色）。 4.3.2.3.V－P试验 接种于改良V－P培养基中，35℃培养48h。加V－P试剂及肌酸数粒，静止1h，应为阳性反应（伊红色）。 4.3.2.4.L－酪氨酸分解试验 接种于L－酪氨酸琼脂培养基上，35℃培养48h，阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区（表示产生酪蛋白酶）。阴性时应继续培养72h再观察。

VITEK_2全自动微生物鉴定系统在蜡样芽孢杆菌检测中应用

V ITE K 22全自动微生物鉴定系统在蜡样芽孢杆菌检测中应用 刘水,杜志刚 作者单位:北京市怀柔区疾病预防控制中心101400 【摘要】　目的　分析V ITEK 全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌检测的可靠性。方法　将蜡样芽孢杆菌的标准菌株及阳性菌株应用标准方法进行检测,同时应用V ITEK 全自动微生物鉴定系统检测,比较两种方法的检出率及检测时间。结果　两种方法检测16株蜡样芽孢杆菌符合率100%,缩短检测时间6～48h 。结论　V ITEK 全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌的鉴定简便、快速、准确,适合食源性疾病监测及食物中毒检测工作中应用。 【主题词】　微生物学技术;食物中毒;芽孢杆菌,蜡状/分离和提纯 【中图分类号】　R446.5 【文献标识码】　A 【文章编号】　100926647(2010)2425854202 本实验采用标准方法与V ITEK 22全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌阳性菌株的检测,评估V ITEK 22全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌的鉴定检测,现报告如下。 1　材料与方法1.1　材料 1.1.1　菌株来源　本单位日常工作中分离的蜡样芽孢杆菌11 株,平谷疾控中心提供蜡样芽孢杆菌4株,中国药品生物制品检定所提供蜡样芽孢杆菌标准菌株(63301)1株,中国普通微生物菌种保藏中心提供苏云金芽孢杆菌(22945)1株。 1.1.2　检测仪器和培养基　VITEK 22全自动微生物鉴定仪、BAC 芽孢杆菌鉴定卡、浊度仪等购自法国生物梅里埃公司,其 他培养基购自北京陆桥公司。 1.2　方法 1.2.1　标准方法　按照G B/T4789.1422003中的方法进行检 测[1]。 1.2.2　V ITEK 22全自动微生物鉴定仪检测　对16株蜡样芽 孢杆菌阳性菌株及1株苏云金芽孢杆菌菌株(用于类似菌鉴别),进行复苏后接种于甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基上32℃培养13h ,挑选典型菌落划线分离于添加多粘菌素B 的营养琼脂平板上[2]和血琼脂平板上,32℃培养13h 做纯培养和溶血试验。将纯培养分离出的菌株,用无菌棉签擦脱部分菌苔与 0.9%氯化钠溶液充分振荡混匀,将菌悬液调至013～015麦氏 度,在鉴定卡架上将菌液管与BAC 鉴定卡连接,将鉴定卡上信息输入V ITEK 22全自动微生物鉴定系统工作站,后将鉴定卡放入仪器充填室进行自动充填,充填结束后取出鉴定卡放入孵育室进行自动培养检测。15～18h 后仪器工作站给出最终结果。 2　结果 2.1　检测结果　16株蜡样芽孢杆菌在添加多粘菌素B 的营 养琼脂平板上菌落形态为灰白色,不透明,边缘不整,具融蜡状。 2.2　标准方法对蜡样芽孢杆菌检测 2.2.1　证实试验　革兰阳性杆菌,芽胞全部位于菌体内。动 力(+),明胶液化(+),硝酸盐还原(+),过氧化氢酶(+),厌氧下葡萄糖发酵(+),甘露醇(-)。 2.2.2　与苏云金芽孢杆菌鉴别试验　无红色结晶小体,无游 离芽胞。结果为阴性。 2.3　V ITEK 22全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌检测　16株菌株V ITEK 22的鉴定结果:怀柔7#、8#菌株99%蜡样芽 孢杆菌;怀柔1#、5#、6#、9#、10#、11#菌株,平谷2#～4#菌株 98%蜡样芽孢杆菌;怀柔2#～4#菌株,平谷1#菌株92%蜡样 芽孢杆菌。标准1#菌株100%蜡样芽孢杆菌;标准2#菌株 100%苏云金芽孢杆菌。鉴定时间为16h 。3　讨论 蜡样芽孢杆菌的标准检验方法中,病原菌鉴定采用形态观察、生化性状及培养特性等证实试验来判定[3],在实际工作中,由于检测样品的复杂性和蜡样芽孢杆菌引起中毒症状的非特征性,其病原菌的鉴定工作难度相当大,往往要求采用多项技术进行综合判断和验证。而且标准方法中对与蜡样芽孢杆菌培养形态、生化特性相似的苏云金芽孢杆菌的鉴别,也比较繁琐并大大增加了鉴定的时间。 V ITEK 全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌检测是采 用V ITEK 22全自动微生物鉴定系统对纯培养出的菌落进行生化鉴定。生化反应项目达三十几项,远远多于标准方法生化反应项目。从本试验可看出16株蜡样芽孢杆菌V ITEK 鉴定仪检测可信度为97%,阳性标准菌株可信度为100%,结合纯培养菌落的典型特征及强溶血、有动力特征性反应[4],可证实 V ITEK 鉴定仪的鉴定结果。在与类似菌苏云金芽孢杆菌鉴别 试验可同时完成。因此采用V ITEK 全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌的鉴定简化了实验步骤,减少人为误差对实验的影响,缩短了检测报告时间,比标准方法节省检测时间6～48 h 。 V ITEK 全自动微生物鉴定系统,具有高度的特异性、敏感 性和重复性,系统可联机孵育、定时扫描、自动分析,操作简便,人为误差小。本实验利用V ITEK 全自动微生物鉴定系统对蜡样芽孢杆菌的快速鉴别,得到了形态学和标准方法的验证,表明V ITEK 鉴定仪的可靠性和准确性。因此,使用VITEK 全 自动微生物鉴定系统可实现对食品中蜡样芽孢杆菌的快速鉴