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微生物多样性研究进展

微生物物种多样性研究进展

微生物是分布最为广泛的生命形式,几乎分布到地球上的所有生境,可利用各种有机化合物、无机盐等作为能源,在有氧或无氧条件下,在寒冷的极地、高达100℃的热泉或高盐碱度等极端环境中生活。微生物具有丰富的物种和遗传多样性,并以高度的变异性适应不同的生境。作为生态系统中的重要组分,微生物在自然界的物质与能量循环、生态系统的演替以及生物多样性的维持中发挥重要的生态功能。微生物与人类的生活休戚相关,在直接或间接地为人类提供了极其丰富的物质资源的同时,也为人类带来了巨大危害。Woese和Fox(1977)以核糖体RNA(rRNA)的小亚基(原核生物的16S、真核生物的18S基因)序列为依据,提出了独立于真细菌(Eubacteria)和真核生物(Urkaryotes) 之外的第三种生命形式——古菌(Archaea),认为它和真核生物以及真细菌是从一个具有原始遗传机制的共同祖先分别进化而来。随后Woese等(1990)提出了三域(Domain)分类系统,将地球上的生物分别归为细菌域(Domain Bacteria)、古菌域(Domain Archaea)和真核生物域(Domain Eukarya),其中古菌在进化谱系上更接近真核生物,但在细胞构造上与细菌较为接近,同属原核生物而真菌与动物、植物等生物属于真核生物域。

我国地域辽阔,跨越热带至寒温带,气候条件多样,地理环境与生态系统类型复杂,是世界上生物多样性最丰富的国家之一。而多样的生境蕴藏着丰富的微生物多样性。特别是近年来微生物多样性的研究由传统的培养方法,逐渐转向以免培养的分子生物学技术为主,如DNA的指纹图谱、分子杂交、克隆文库测序、高通量测序(pyroseqencing)、稳定性同位素探测(stable isotope probing,SIP)、基因芯片(gene chip)以及转录组学等技术。我国学者利用先进的分子生物学技术,极大地提高了我国微生物多样性的研究水平。

1 古菌多样性

目前古菌域包括5个门:广古菌门、泉古菌门、奇古菌门、纳米古菌门和初古菌门。古菌主要生活在极端环境中,如海底、陆地热泉、火山口以及盐碱湖等,最近发现古菌也在土壤、湖泊以及动物肠道等中温环境中广泛存在。据Mora等(2011)的不完全统计,目前全世界已报道可培养的古菌有503种。

我国在古菌多样性研究方面取得了重要进展,如在ISI Web of Knowledge 数据库中检索结果表明,自1999年以来我国学者在国际微生物分类学界公认的权威期刊International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM,2000 年前为International Journal of Systematic Bacteriology)和Extremophiles上发表了50篇古菌分类文章,总共报道了61种可培养的古菌新种。如Xu等(1999)从我国西藏盐碱湖底泥中分离到两种嗜盐碱古菌新种Natronorubrum bangense和N. tibetense,随后我国学者相继从新疆的盐湖、内蒙古碱湖、云南腾冲热泉、江苏和福建等地的盐场、山东胜利油田、青藏高原高寒湿地和柴达木盆地内陆咸、淡水湖,以及黑龙江大庆的盐碱地土壤等样本中分离得到了嗜/耐盐碱古菌、嗜热酸的硫化叶菌、产甲烷古菌、极端嗜热古菌新种。

由于古菌常生活在极端环境中,仅凭常规的分离培养方法难以全面反映自然环境中古菌的多样性。因此,近年来我国学者利用免培养的分子生物学技术开展了大量的古菌多样性与功能研究。如利用克隆文库测序和SIP技术发现水稻根际土壤中具有丰富的古菌多样性,而且RC-I (Rice Cluster I)古菌类群在稻田

CH4的产生过程中起着重要的作用; 通过克隆文库测序和实时荧光定量PCR技术发现我国南方红壤中存在丰富的氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA),且施肥处理明显影响AOA的群落组成与丰度,并进一步利用SIP技术证实我国南方红壤中AOA的丰度与氨氧化速率呈显著正相关。Cao等(2012)分析北京、天津、山东、河南、湖南等5省市的4种土壤类型(褐土、棕壤、潮土、红壤)中16S rRNA基因序列表明,红壤中的古类型以Crenarchaeota group 1.3和1.1c为主,而其他3种土壤类型中的古菌以Crenarchaeota group 1.1b和1.1a 为主。利用实时荧光定量PCR和克隆文库测序技术发现青海湖底泥中的古菌是原核微生物的优势类群,主要包括深海群体MBG-B,-C 和-D (Marine Benthic Group-B, -C, -D)和MCG , 而在青藏高原若尔盖湿地中Zoige cluster I (ZC-I)是优势的产甲烷古菌类群。

2 细菌多样性据不完全统计,目前全世界已报道的细菌约11,010种,其中来自陆地生境的约10,358种、海洋生境的约652种(Mora et al., 2011)。我国在细菌分类、多样性等研究上具有很长的历史,据估算我国报道的细菌种数约是世界已报道种数的10%。在ISI Web of Knoledge数据库中检索结果显示,自1990年以来我国学者在IJSEM上已发表论文778篇,对放线菌、嗜热杆菌、双歧杆菌、草酸杆菌以及根瘤菌等分类与多样性的研究成果引起了国际同行的高度关注。如目前全世界在海洋环境中共发现可培养的放线菌66个属,其中Xi等从海洋沉积物、海水和海绵中分离培养放线菌29个属, 包括3个新种; 从南海沉积物中分离培养出海洋放线菌30属、130种,其中包括2个新属,即南海放线菌属(Sciscionella)和海洋产孢放线菌属(Marinac- tinospora) ,显示出我国海域具有丰富的放线菌资源。虽然我们已分离培养了大量细菌种类,但是已发现的细菌物种数,约占自然界中存在种类的10%。我国学者近年来利用免培养的分子生物学方法进行了细菌多样性的研究。如利用16S rRNA基因克隆文库技术发现内蒙古碱湖底泥中具有较高的细菌多样性,且以革兰氏阴性细菌为主; 在矿山酸性废水中检测到60个细菌分类单元(operational taxonomic unit,OTU),其中Acidith- iobacillus ferrooxidans、Leptospirillum ferrooxidans、Acidiphilum sp.等为优势类群; 在青藏高原冰川区积雪中得到了164个细菌OTUs,其中Hymenobacter, Arthrobacter和Polaromonas等是优势类群。Dong采用磷脂脂肪酸和克隆测序分析发现青海湖底泥中具有某些特异的细菌种类。Jiang发现好氧不产氧光合细菌(aerobic anoxygenic phototrophic bacteria, AAPB)广泛分布在青海盐湖水体和底泥中。通过对大熊猫新鲜粪便的16S rRNA基因序列分析,发现梭菌属(Clostridium)的13个OTU中有7个是大熊猫肠道特有的菌群,进一步的宏基因组分析结果证实了梭菌能降解纤维素与半纤维素。Xia等(2011)利用SIP和高通量测序技术,发现氨氧化细菌和亚硝酸盐细菌是农田土壤硝化作用的主要类群。最近, Huang等(2012)对不同海域海水的rRNA克隆文库序列分析,发现海洋中含有丰富的微型蓝藻细菌(picocyanobacteria)。此外,我国学者还在甲烷氧化菌、反硝化菌、硫还原菌、铁还原菌以及锰氧化菌等多样性方面取得了重要成果。

3 真菌多样性

真菌作为真核生物中一个独立的界(Kingdom Fungi),是物种数量仅次于昆虫的第二大真核生物类群,估计全世界总种数为150万种,目前已报道的种类近10万种。我国学者在真菌分类与多样性研究上具有很长的历史,特别是《中国孢子植物志》的编研极大推动了我国真菌多样性的研究,其中已出版《中国真菌志》42卷和《中国地衣志》1卷。据戴玉成和庄剑云(2010)的统计,在中国大

陆的不同生境中共发表了真菌(包括卵菌、黏菌)14,846种297变种,其中包括2,849新种、129新变种、5,260新记录种,而在香港和台湾地区报道的不同于大陆记载的真菌种类中分别约为800种和400种,因此全国总计已知真菌(包括卵菌、黏菌)应为16,046种、297 变种。假设其中有10%为同物异名,则目前我国已知种数约为14,700种,其中管毛生物界(主要是卵菌)约300种,原生动物界(主要是黏菌)约有340种, 真菌约14,060种。其中,食用菌有936种、23变种、3亚种和4变型,药用菌473。下面就我国研究较多的重要菌物类群分别论述。

3.1 地衣型真菌

地衣(lichen)是真菌与藻类或蓝细菌共生而成的具有稳定特殊形态结构的互惠共生体。地衣分布十分广泛,可生长在裸露的岩石、沙漠等干旱、高温以及极地等低温的恶劣环境,它对于岩石风化、土壤形成起到促进作用,被称为植物的开路先锋。同时有的地衣对气候变化和环境污染非常敏感,可作为环境变化的指示生物。魏江春总结了我国地衣多样性,并于1991年编辑出版了英文版的《中国地衣综览》,该书收集了中国已报道的地衣总计232属、1,766种、25亚种、244变种、233变型。据不完全统计,自1991年以来我国大陆发表的地衣新种和新记录种约有300种,加上在香港报道的170种中国新记录种和台湾报道的中国新记录种,目前我国已报道地衣约为2,500种,其中香港有303种,台湾有521种和59个种下单位。

3.2 菌根真菌

菌根真菌(mycorrhizal fungi)可与97%的陆地植物形成互惠共生体 菌根。菌根真菌一方面从植物根系获取生长所需的碳源,同时又帮助植物从土壤中吸收N、P等矿物营养和水分,改良土壤结构,促进植物生长, 提高宿主抗逆性, 并在生态系统的演化过程中发挥重要的生态功能。根据菌根形态特征划分为7种类型:丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza, AM)、外生菌根(ectomyc- orrhiza,EM)、内外生菌根(ectendomycorrhiza)、欧石楠类菌根(ericoid mycorrhiza)、浆果鹃类菌根(arbutoid mycorrhiza)、水晶兰类菌根(monotropoid mycorrhiza)和兰科菌根(orchid mycorrhiza)。目前全世界报道有7,750多种外生菌根真菌和200余种丛枝菌根真菌。我国在菌根真菌多样性与功能等方面具有很长的研究历史。据不完全统计,我国学者已发表了2,400余篇有关菌根真菌的文章,其中有270余篇文章发表在136种SCI索引的期刊上,其余2,150余篇文章发表在400余种中文期刊上(China Chongqing VIP In-formation Inc.’s “Chinese Journals of Science and Technology Database”)。

在EM真菌方面,我国学者在不同的森林生态系统中进行了大量EM真菌子实体多样性调查,并利用分子生物学方法检测植物根系内EM真菌的多样性。目前我国已报道的外生菌根真菌有800余种,涉及到的植物有针叶树中的松属(Pinus)、油杉属(Keteleeria)、云杉属(Picea),阔叶树中的桦木属(Betula)、栲属(Castanopsis)、木麻黄属(Casuarina)、桉属(Eucalyptus)、栎属(Quercus)、杨属(Populus),草本植物嵩草属(Kobresia)。同时也进行了EM真菌物种多样性的分布规律研究。

在AM真菌多样性方面,我国学者调查了不同生境中约800余种植物的AM 真菌侵染结构类型,利用形态方法从不同地区的土壤中进行了大量分离鉴定工作,并报道了120余种AM真菌。同时也进行了AM真菌的多样性和群落组成与宿主关系、地理分布特征以及季节动态变化规律研究,开展了树木砍伐、放牧和耕作水平等人为干扰、重金属污染以及氮沉降对AM真菌多样性的影响研究。

在兰科菌根真菌多样性方面也开展了大量工作,如从兰科植物中分离培养了100余种兰科菌根真菌,包括许多新种,并进行了菌根真菌促进兰科植物种子萌发、营养物质吸收和生长研究。在浆果鹃类菌根真菌多样性方面,郑钰等(2010)利用分子方法从银叶杜鹃(Rhododendron argyrophyllum)和繁花杜鹃(R. floribundum)的根系检测到41种菌根真菌。

3.3 内生真菌

内生真菌(endophytic fungi)是指在全部生活史或生活史中的某一时期内生活在植物组织内,并没有引起植物组织明显病害症状的真菌。由于内生真菌可促进宿主植物的生长、增强其抗病虫害与干旱等不良环境胁迫的能力,以及产生大量的新结构活性化合物,近年来引起大家的关注,并开展了大量内生真菌研究,但相对于其他真菌类群的研究,我们对内生菌多样性的认识还很肤浅,所研究的植物类群数量仅有数百种。但是从目前的研究结果分析,平均每种宿主有4–5种专性内生真菌,按地球目前已知25万种植物计算,内生真菌总数可超过100万种。

我国学者在内生真菌的多样性、生态分布与功能以及活性化合物筛选等方面取得了重要进展。据不完全统计,我国学者在SCI索引的239个期刊上发表论文910篇,在中文期刊上发表论文951篇。在内生真菌多样性的检测与鉴定研究中,由于有的内生真菌在培养基上不产孢或难以生长,Guo建立了不产孢内生真菌的分子鉴定和从植物体内直接检测内生真菌多样性的分子方法,因此传统的分离培养方法和分子方法的结合是当前内生真菌多样性研究的有效方法。目前我国进行过内生真菌多样性研究的植物类群涉及到地衣、针叶树、禾草类、香蕉、水稻、兰科植物、红树林、药用植物以及其他阔叶树植物拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)真菌多样性研究中, Wei从浙江、广西、云南等地的罗汉松科、山茶科和红豆杉科常见植物中分离到24种拟盘多毛孢内生真菌,其中包括3个新种、1个新纪录种。刘爱荣等(2007)从广东、广西和海南的红树林中分离到40种拟盘多毛孢属内生真菌,以及从海南岛的罗汉松科、棕榈科和山榄科等植物中分离到32种拟盘多毛孢属内生真菌,包括1个新种。

展望

据Hawksworth(1991)估计全球有菌物(真核微生物)物种约150万种,现已知约97,861种,仅占估计种数的6.5%。目前我国已发现菌物1.47万种,而我国已知有维管束植物约3万种,若按Hawksworth(1991)的估算方法(维管束植物种数:菌物种数=1:6)推算,中国估计菌物种数约18万以上,而目前已知种数约占估计种数的8.2%。另据Mora等(2011)不完全统计,目前全世界已报道可培养的细菌约11,010种、古菌503种,而我国总共报道的可培养种类约占全世界报道的10%,可见我国微生物多样性资源的研究仍任重道远。

随着科学技术发展,微生物多样性研究由传统的形态和培养方法,逐渐转向以免培养的分子生物学技术为主,特别是宏基因组DNA高通量测序和DNA 条形码技术的结合将揭示环境中大量未被发现的微生物类群,稳定性同位素探测、基因芯片以及转录组学等技术的应用,将极大提高微生物功能多样性的研究水平。

在进一步开展微生物资源收集与保藏的基础上,建立一系列的核心技术,实现资源多样化、管理系统化、服务专业化、品质标准化,建设功能齐全、技术先进的微生物物种和信息资源的高效共享平台,为我国生命科学研究、生物技术创新及产业发展提供重要的菌种和生物信息等资源,满足日益增长的科技研发与

生产的需求,推动我国微生物资源的保护和共享利用,为国民经济的可持续发展做出重要贡献。