乙醇沉淀DNA步骤

乙醇沉淀DNA步骤

1. 加入1/10体积的乙酸钠（3 mol/L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3 mol/L；

2. 加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中15~30分钟；

3. 12,000 g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

4. 加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

5. 于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；

6. 加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。

1.加入1/10体积的乙酸钠（3 mol/L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3 mol/L（Na+使DNA的负电荷中和掉）；

2. 加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中15~30分钟（这个时间可以长于1小时）；

3. 12,000 g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

4. 加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

5. 于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；

6. 加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。

3 mol/L乙酸钠（pH5.2和pH7.0）溶液

【配制方法】在80ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2或用稀乙酸调节pH值至7.0，加水定容到1L，分装后高压灭菌。

苯酚、氯仿、异戊醇抽提DNA的原理是通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质,再加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.

使用苯酚抽提细胞DNA 时,苯酚的作用是使蛋白质变性,同时抑制了DNase 的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而DNA 溶于水相.

氯仿的作用是克服酚的缺点；加速有机相与液相分层.最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚.（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA 时,通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇,为什么?因为异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡.异戊醇可以降低表面张力,从而减少气泡产生.另外,异戊醇有助于分相,使离心后的上层含DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定.

抽提DNA去除蛋白质时,怎样使用酚与氯仿较好?酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性.经过离心,变性蛋白质的密度比水的密度为大,因而与水相分离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开.而酚与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层.作为表面变性的酚与氯仿,在去除蛋白质的作用中,各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10％～15％的水溶解在酚相中,因而损失了这部分水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,不会带走DNA.所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好.经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白质,此时一起将酚带走.也可以在第二次抽提时,将酚与氯仿混合（1:1）使用.

为什么用酚与氯仿抽提DNA时,还要加少量的异戊酵?在抽提DNA时,为了混合均匀,必须剧烈振荡容器数次,这时在混合液内易产生气泡,气泡会阻止相互间的充分作用.加入异戊醇能降低分子表面张力,所以能减少抽提过程中的泡沫产生.一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比.也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制,可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成）,同时异戊醇有助于分相,使离心后的上层水相,中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定.