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成骨细胞茜素红染色方法改进

成骨细胞茜素红染色方法改进
成骨细胞茜素红染色方法改进

万方数据

成骨细胞茜素红染色方法改进

作者:过倩萍

作者单位:苏州大学骨科研究所,江苏苏州,215007

刊名:

科技与生活

英文刊名:Technology and life

年,卷(期):2012,4(24)

参考文献(2条)

1.Zhang J;Wang JH Characterization of differential properties of rabbit tendon stem cells and tenocytes 2010

2.何志义;原丽英;陈晏;赵晶 邹巧治 高卓 欧阳嶷大鼠骨髓基质细胞的体外分离、培养和鉴定的实验研究 2004(05)

本文链接:https://www.wendangku.net/doc/7318525510.html,/Periodical_kjysh201224123.aspx

细胞染色方法总结

Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst 有hoechest33342和hoechst33258两种hoechsts33258,hoechst33342二者区别不大,但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些,所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色,而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色! 染色步骤 PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料(红色),它不能透过完整的细胞膜,但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加,PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞,只能表示细胞的坏死情况,而不是凋亡(当然晚期凋亡PI亦可着色)。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况,而不是仔细区分坏死或凋亡,那么PI单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡,那么PI单一染色显然不够! annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光;如果用PE标记就发红色荧光。 JC-1染色JC-1是一种阳离子染料,可以在线粒体内聚集,低浓度时主要以单体(monomer)存在,发射光以绿光(~525nm)为主;而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation),发射光以红光(-590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性(polarization),其外膜为负极,内膜为正极。电位差由Ca2+、Na+和H+流调控。当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少,因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化(depolarization)时,线粒内JC-l的浓度较高,多以多聚体的形式存在,绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membrane potential),而与线粒体的形态、体积和密度都无关,因而能更好地反映线粒体的功能状态。由于凋亡发生的早期存在线粒体的去极性,因此,JC-1染色被用于检测凋亡的早期发生。其实验方法如下。 JC-l染色非常简单。首先可将成品JC-1以DMSO配成储存液(1~5mg/ml),储存于-20℃,用时以培养液稀释至10ug/ml终浓度。对贴壁细胞可以直接弃去培养液,漂洗细胞后直接加入染色液,10-30min后在荧光显微镜下或者激光共聚焦 下观察。线粒体状态好时细胞以绿色为主,当红光信号增强时,红绿相叠,以橙色为主。该染色运用于悬浮细胞时还可以通过流式细胞仪进行检测,收集红/绿信号强度,计算其强度比。

细胞染色方法大全

细胞染色方法大全 The manuscript was revised on the evening of 2021

Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合 (主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察 效果.hoechst有hoechest33342和hoechst33258两种 hoechsts33258, hoechst33342二者区别不大,但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些,所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色,而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色! 染色步骤 PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料(红色),它不能透过完整的细胞膜,但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加,PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞,只能表示细胞的坏死情况,而不是凋亡(当然晚期凋亡PI亦可着色)。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况,而不是仔细区分坏死或凋亡,那么PI单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡,那么PI单一染色显然不够! annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光;如果用PE标记就发红色荧光。 JC-1染色 JC-1是一种阳离子染料,可以在线粒体内聚集,低浓度时主要以单体(monomer)存在,发射光以绿光(~525nm)为主;而在高浓度时则可以形成多聚

细胞染色方法

DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)的配制 贮存液:70%酒精溶解,浓度100 μg/ml,配好后用锡纸包起来,避光,可在4摄氏度下长期保存。 使用浓度:贮存液用1xPBS稀释1000倍,最终浓度100 ng/ml。 10x PBS的配制 80 g NaCl 2 g KCl g 无水Na2HPO4 2 g 无水KH2PO4 加水到1000ml 贮存液可根据需要用蒸馏水稀释 荧光封片液 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合, 染色与观察: 制好的玻片上滴加几滴DAPI染液,染色10分钟,流水冲去染液,滤纸吸除多余水分,加一滴荧光封片液,置于荧光显微镜下观察,激发波长360-400nm.

注意事项: DAPI可能具有致癌性,全部操作过程中必须带塑料或乳胶手套。 上:正常绍鸭成纤维细胞核,下:凋亡核 Lyso-Tracker Red是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针,可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。 Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针,可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中,从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(Neutral Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色,但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。 Lyso-Tracker Red呈红色荧光,检测时的最大激发波长为577nm,最大发射波长为590nm。 按照1:20000的比例稀释,可以配制1000ml Lyso-Tracker Red工作液。 可用于家蚕脂肪体细胞autophage监测。见李胜文章。

细胞染色方法

一、形态学观察方法 1、HE染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽” 现象。 2、丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色 质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 3、台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜 完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。 4、透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞 质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 二、DNA凝胶电泳 (一)、检测原理 细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180-200bpDNA 片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。 (二)结果判断 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。 三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA 法检测。 (一)检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体; 2、在微定量板上吸附组蛋白体? 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合… 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合? 4、加酶的底物,测光吸收制。 (二)用途 该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器,适合基层工作,但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。 四、流式细胞仪定量分析 (一)检测原理 细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。 (二)应用价值 流式细胞仪检测具有以下特点: 1)、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确 2)、可以做许多相关性分析 3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期 ■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法 细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

细胞固定、染色原理与方法

细胞固定、染色原理与方法 一、固定与固定液 (一)固定:将新鲜的活组织从生物体取下后,立即投入固定剂中,借助化学药品的作用,使细胞保持原有形态、结构的一种手段。 1.目的 (1)迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败,尽量保持生长状态结构。 (2)使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质,以保持生前的形态。 (3)使组织内各种物质成分产生不同的折光率,便于观察和鉴定。 (4)使不同组织成分对染料有不同的亲和力,便于染色。 (5)防止细胞过度收缩或膨胀,失去原有的形态结构。 2.时期 (1)有丝分裂:有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织,根尖取材容易,操作和鉴定方便。 (2)减数分裂:选取适当大小的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性的第一步。此时的植株形态及花蕾大小依植物的类别及品种有所不同。 小麦:在植株开始挑旗,旗叶与下一叶的叶耳间距为3-4cm,花药长度大致在1-2mm左右,黄绿色时取材最好。如花药为绿色时则为时过早,花药为黄色,则已过时。一般上午8-10点为取材最佳时间。 玉米:一般夏玉米在7月份取材,以上午7-8点为好。在玉米雌穗未抽出前的7-10天手摸植株上部(喇叭口下部)有松软感觉,表明雄花序即将抽出。用刀在顶叶近喇叭口处纵向划一刀,切口长10-15cm,剥出雄花序,顶端花药长3-5mm,花药尚未变黄时取材。 蚕豆:从现蕾开始,上午10-11点可选取2-3mm大小的花蕾或一小段花序。蚕豆开花的次序是由下而上,由外而内。 3.固定时的注意事项 (1)固定液量:20倍于材料的体积,以免固定液被稀释。 (2)选择合适的固定液:渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中,又不使组织过度收缩或膨胀。 (3)固定的时间要合适: 与材料的大小和温度有关:材料大则时间长,材料小则时间短;温度高则时间短,温度低则时间长。 经固定的材料如不及时使用,可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时,再换入一次70%酒精,在0-4℃冰箱内可保存半年。经过较长时间保存的材料进行观察前可以换新的固定液再处理一次,效果较好。 (二)固定液固定液包括简单固定液和混合固定液两种。简单固定液就是用一种药品作为固定液,如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等。简单固定液只对细胞的某种成分固定效果较好,而不能将所有的成分都保存下来。混合固定液是指两种或两种以上的化学物质的混合液,如卡诺氏固定液等。 1.固定液的条件 (1)迅速渗入组织,杀死原生质。在杀死的短时期中,细胞形态不致有所变化。 (2)必须具有渗透力,对组织各部分的渗透力相等,可使组织内外完全固定。 (3)尽可能避免使组织膨胀或收缩。 (4)使细胞内的成分凝固或沉淀。 (5)增加细胞内含物的折光程度,易于鉴别。

细胞各种染色方法

细胞培养后,需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行连续地观察。由于细胞小而复杂,若不借助适当的手段,则难以观察其形态、结构,更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。目前,已有多种研究细胞的技术,从光镜到电子显微镜,从一般细胞化学法到免疫化学法,本章将重点介绍一些常用的观察和检测方法。 第一节培养细胞的常规检查和观察方法 细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察,及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。细胞常规检查观察的内容为: 一、肉眼观察 一般常规检查用肉眼即可观察,主要看培养液的颜色和透明度的变化。正常情况下,培养液pH介于7.2~7.4之间,呈桃红色清亮透明。加入细胞在培养瓶中置一般温箱培养时,随着细胞生长时间的延长,细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降,引起颜色变浅变黄。在超越缓冲范围后培养液酸化变黄,如不及时调节pH,会影响细胞的生长,甚至造成细胞退变死亡。所以,一旦发现培养液变黄,应及时换液传代。一般更换培养液的时间,依营养物的消耗而定,正常情况生长稳定的细胞2~3天换液一次,生长缓慢的细胞3~4天换液一次。培养液中加Hepes或用5%CO2温箱培养可使pH维持稳定,利于细胞生长。用含磷酸盐缓冲系统培养时,可因瓶及塞子漏气,CO2溢出,也可能由于培养瓶塞洗刷不洁、残留碱性物,使培养液变碱发红,只致使细胞难以生长,甚至死亡。细胞换液传代后,若发现培养液很快变黄,要注意是否有细菌污染或培养器皿没有洗干净。贴壁细胞培养时若出现混浊,多为污染。悬浮培养的细胞,应将瓶竖起静置1小时,若培养基混浊示为污染,也可在显微镜下仔细观察有无污染现象出现。 二、显微镜观察 生长良好的细胞,在显微镜下可观察到细胞透明度大,折光性强,轮廓不清。相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。若细胞生长状态不良,可见细胞轮廓增强,细胞折光性变弱,细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质,细胞之间空隙增大,细胞形态不规则,甚至失去原有细胞的特点,产生圆缩脱落,有时细胞表面及周围出现丝絮状物。若细胞营养不良状况没有得到及时纠正,进一步发展可见到部分细胞死亡,崩解漂浮在培养液中。发现这种情况应及时处理,只有生长良好的细胞才能进行传代培养和实验研究。 三、细胞的生长状态 细胞培养时,经初代培养或传代培养,都有一长短不同的潜伏期,在培养过程中注意观察细胞增殖生长的状态极为重要。各种细胞增殖的时间不尽一致。传代细胞系,胚胎组织或幼体细胞潜伏期短,一般在接种培养第二天即可见细胞生长增殖,3~4天便可连接成片。成体组织的潜伏期长,老年组织和癌组织潜伏期更长,可达一周左右。原代细胞培养中最先可见从组织块中边缘“长出”细胞,这种细胞是从原代组织块中游走出来的,并不是细胞增殖产生。这种早期游出的细胞多以成纤维细胞为主,其易生长,适应性强,呈放射状或旋涡状分布,很快生长并互相连接成网状。传代细胞在传代后,一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期,对数生长期,细胞大量繁殖,逐渐相连成片而长满瓶底。一旦发现细胞长满瓶底80%就应及时传代,否则会影响细胞生长甚至脱落。悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。 四、微生物污染 细胞接种、传代、换液加药后应经常观察,密切注意是否有微生物污染发生。一旦发现培养液混浊、液体内漂浮着菌丝或细菌,或生长明显变缓,胞质内颗粒增多,有中毒表现等

免疫荧光细胞化学染色方法

免疫荧光细胞化学染色方法 一、标本制作 可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片,经适当固定或不固定,作免疫荧光染色用。 二、荧光抗体染色方法 (一)直接法 1.染色切片经固定后,滴加经稀释至染色效价如1:8或1:16的荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等),在室温或37℃染色30min,切片置入能保持潮湿的染色盒内,防止干燥。 2.洗片倾去存留的荧光抗体,将切片浸入pH7.4或 pH7.2PBS中洗两次,搅拌,每次5min,再用蒸馏水洗1min,除去盐结晶。 3.用50%缓冲(0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0~9.5)甘油封固、镜检 4.对照染色 ①正常免荧光血清染色,如上法处理切片,结果应为阴性。 ②染色抑制试验(一步法):将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清(相同)等量混合,如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致,可用盐水代替

未标记抗血清,染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验,前面已作叙述。 直接法比较简单,适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原,特异性高而敏感性较低。 (二)间接法 (1)切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的湿度,37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次,10min,用吸水吸去或吹干余留的液体。 (2)再滴加间接荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等),同上步骤,染色30min,37℃,缓冲盐水洗两次10min,搅拌,缓冲甘油封固,镜检。 对照染色:①抗体对照:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法进行染色,结果应为阴性。②抗原对照:即类属抗原染色,亦应为阴性。③阳性对照。 间接法中上述方法称双层法(Double Layer Method)。另一种称夹心法,即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合,再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上,而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在,方法步骤如下: ①切片或涂片固定后,置于染色湿盒内。 ②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃,30min。

细胞染色方法大全

染色步骤 PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂,常用于细胞凋亡检测. 碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料(红色),它不能透过完整的细胞膜,但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加,PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞,只能表示细胞的坏死情况,而不是凋亡(当然晚期凋亡PI亦可着色)。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况,而不是仔细区分坏死或凋亡,那么PI 单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡,那么PI单一染色显然不够! annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不 同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光;如果用PE标记就发红色荧光。 JC-1染色 JC-1是一种阳离子染料,可以在线粒体内聚集,低浓度时主要以单体(monomer)存在,发射光以绿光(~525nm)为主;而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation),发射光以红光(-590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性(polarization),其外膜为负极,内膜为正极。电位差由Ca2+、Na+和H+流调控。当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少,因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化(depolarization)时,线粒内JC-l的浓度较高,多以多聚体的形式存在,绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membrane

Hoechst染色方法

Hoechst染色方法 实验步骤 1.贴壁细胞 1) 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间,无菌超净台内吹干或用细胞培养PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍,再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片至于六孔板内,种入细胞培养过夜,使约为50%——80%满。 2)刺激细胞发生凋亡后,吸尽培养液,加入0.5ml固定液,固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。 3) 去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟,吸尽液体。洗涤时宜用摇床,或手动晃动数次。 4) 加入0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分钟。也宜用摇床,或手动晃动数次。 5) 用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。 6) 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,尽量避免气泡,使细胞接触封片液,切勿弄反。 7) 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。 2. 悬浮细胞 1) 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内,加入0.5ml固定液,缓缓悬起细胞,固定10分钟或更长时间(可4℃过夜)。 2) 离心去固定液,用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。洗涤期间手动晃动。 3) 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体,再缓缓悬起细胞,滴加至载玻片上,尽量使细胞分布均匀。 4) 稍晾干,使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。 5) 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液,染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体,微晾干。 6) 用PBS或0.9%NaCl洗两遍,每次3分钟。 7) 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上一洁净的盖玻片,尽量避免气泡。 8) H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

血细胞化学染色检验

血细胞化学染色检验 发表时间:2011-05-13T17:08:37.940Z 来源:《中外健康文摘》2011年第5期作者:张辉[导读] 中性、嗜酸性较细胞及单核细胞胞质能将试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝,生成蓝色颗粒。 张辉 (黑龙江省林甸县中医院 166300) 【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2011)5-0146-02 【关键词】血细胞检验染色 (一)过氧化物酶(POX)染色中性、嗜酸性较细胞及单核细胞胞质内含过氧化物酶(POX),能将试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝,生成蓝色颗粒。 1.酶活性增高可见于再生障碍性贫血、急性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、放射病,嗜碱性粒细胞在慢性粒细胞白血病时可出现阳性。 2.酶活性减低可见于肿瘤、MDS、链球菌感染、风湿热等。 (二)中性粒细胞碱性磷酸酶染色 中性粒细胞中的碱性磷酸酶(NAP)能使试剂中的成分产生一系列化学反应,形成棕黑色颗粒定位于胞质中。胞质中出现灰色到棕黑色颗粒为阳性反应,视反应强度可分为阴性反应,+~4+。由此可计算出NAP阳性细胞的百分率和阳性积分值。 1.NAP积分增高可见于①细菌性感染时,NAP活性明显增高,病毒性或寄生虫性感染时常无明显变化或减低,这有助于感染性质的鉴别;②真性红细胞增多症以及再生障碍性贫血;③类白血病,由化脓性球菌引起的白血病反应;④急性淋巴细胞性白血病;⑤多发性骨髓瘤时,NAP活性显著升高;⑥烧伤、中毒、手术、外伤等。 2.NAP积分降低可见于①慢性粒细胞性白血病时NAP活性明显降低,经治疗病情缓解时活性恢复正常,急变时活性增强,有助于对病情判断;②粒细胞缺乏症、脾功能亢进等疾病;③感染革兰阴性杆菌、结核、病毒感染以及立克次体病等。 (三)酸性磷酸酶染色 血细胞中的酸性磷酸F(ACP)在酸性条件下水解试剂中的成分,产生的化学反应形成黑色颗粒定位于胞质中。 1.单核细胞、网状细胞、巨噬细胞、组织细胞中此酶呈阳性反应,有助于急性单核细胞性白血病、组织细胞性淋巴瘤及恶性组织细胞病的诊断。 2.毛细胞白血病时呈阳性反应,且不为左旋酒石酸所抑制,有助于毛细胞白血病的诊断。 3.高雪细胞呈阳性反应尼曼-匹克细胞细胞呈阴性反应,有助于两者鉴别。 (四)特异性酯酶染色 特异性酯酶(SE)为粒细胞所特有,能将试剂成分形成不溶性红色沉淀定位于胞质中。 急性粒细胞性白血病时,原粒及早幼粒细胞的SE活性显著增强;急性单核细胞性白血病时一般呈阴性反应;急性淋巴细胞性及单核细胞性白血病时均呈阴性反应。 (五)非特异性酯酶染色 血细胞中的非特异性酚酶(NSE)能将试剂中的成分形成不溶性的有色沉淀定于胞质中。 NSE主要存在干单核细胞系,从原单核细胞到成熟单核细胞其活性逐渐增强,粒系细胞一般为阴性或弱阳性反应,淋巴细胞系一般呈阴性反应。在急性单核细胞性白血病时呈强阳性反应,但其活性能被氟化钠抑制。急性粒细胞性白血病时,有部分病理可呈弱阳性反应,但其活性不被氟化钠抑制,有助于急性单核细胞性白血病与急性粒细胞性白血病的鉴别。 (六)糖原染色 糖原染色又称过碘酸-雪夫(FAS)反应。过碘酸能将血细胞内的糖原氧化后与雪夫试剂反应形成紫红色化合物定位于细胞质中。胞质中出现红色颗粒或块状物质为阳性反应因细胞不同,其反应程度各异粒系细胞中原始粒细胞多呈阴性反应;早幼粒细胞以下各阶段随细胞成熟,阳性反应增强;红系细胞呈阴性反应;单核细胞呈弱阳性淋巴细胞多呈阴性;巨核细胞及血小板均呈阳性反应按阳性强度计算积分值。 1.鉴别良性与恶性淋巴细胞增生性疾病在良性淋巴细胞增生如传染性单核细胞增多症时,其淋巴细胞PAS阳性反应产物呈细小颗粒状,积分值正常;在恶性增生时如恶性淋巴瘤、急或慢性淋巴细胞性白血病时,其淋巴细胞中常呈粗颗粒或块状红细胞沉淀的阳性反应,积分值增高。 2.鉴别幼红细胞增生的性质在巨幼红细胞性贫血、溶血性贫血时,幼红细胞PAS反应积分值正常;在红血病、红白血病时则呈强阳性反应,积分值增高。 3.鉴别急性白血病的类型原始及幼稚粒细胞PAS反应呈阴性;原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞反应呈颗粒状或块状阳性;原始单核细胞及幼稚单核细胞反应呈弥漫性强阳性。 4.鉴别某些细胞类型如巨核细胞呈强阳性反应,尼曼-匹克细胞呈弱阳性或阴性,李-斯细胞一般为阴性或弱阳性反应。 (七)铁染色 骨髓组织中的含铁血黄素(细胞外铁)和幼红细胞中的铁粒(细胞内铁)在酸性溶液中与亚铁氰化钾反应,生成蓝色沉淀定位于含铁部位及胞质中。 1.细胞内外铁消失或减低,见于铁原料摄入降低,铁吸收功能障碍或铁的丢失和消耗过度,使幼红细胞血红蛋白合成量减少或障碍,如临床常见的缺铁性贫血及能引起机体缺铁的相关疾病,如钩虫病、ITP等均能使机体细胞内外铁减少,产生贫血症状。 2.细胞内外铁增多,见于机体造血功能障碍,铁利用和转换能力下降或迟缓,临床常见的疾病有再生障碍性贫血、铁粒幼细胞贫血、骨髓增生异常综合征、溶血性贫血、白血病等。 3.铁染色与血清铁、总铁结合力联合检测,有助于了解机体内铁的动态变化以及铁剂治疗的效果,可评价骨髓代偿造血能力。参考文献

染色方法总结

mydye 发表于 2006-3-4 14:37:00 AgNOR染色法: 1、试剂配制: (1)AgNOR染色液: 甲液:明胶2 g 溶于双蒸水至99 ml,在60℃使之完全溶解,再加入纯甲酸1 ml 摇匀待用。 乙液:硝酸银50 g 溶解于双蒸水中至100 ml,4℃冰箱保存。 (2)AgNOR工作液 取甲液10 ml,乙液20 ml 临用前混合。 2、步骤: (1)切片脱蜡至水 (2)双蒸水洗2次 (3)AgNOR 工作液中(25℃)浸染30分钟(暗处进行)(镜下观察)(4)双蒸水洗3次 (5)脱水,透明,封固 3、结果:油镜观察,细胞核及胞质背景为淡黄色, AgNOR呈棕黑色颗粒状。 B 鞭毛染色法: 1.试剂配制: 甲液:丹宁酸5克 氯化铁(FeCl3)1.5克 福尔马林(15%)2.0毫升 氢氧化钠(NaOH)1%1.0毫升 乙液:硝酸银(AgNO3)2克 蒸馏水100毫升 制备乙液时,待硝酸银溶解后,取出10毫升备用,向余下的90毫升硝酸银液中滴加浓氢氧化铵,先呈很浓厚的沉淀,再继续滴加至刚刚溶解沉淀成澄清液为止。再将备用的硝酸银溶液慢慢逐滴加入澄清液中,先呈现薄雾,但轻摇则消失,继续边滴加边摇动,待澄清液呈现略有轻微不消散的薄雾状为止。如雾重,则银盐沉淀,不宜使用。 2.染色方法: (1)将待检菌接种在新制备的肉汤琼脂斜面上,置37°培养16—20小时,备用。 (2)在载玻片的中部相隔一厘米处,用接种环各沾一滴蒸馏水,然后用接种环挑取湿润处的菌苔少许于一端的水滴中,倾斜玻片使培养物流至另一水滴中,两水滴自然相通,菌体从上位自然扩散到下位水滴中,待干燥后染色。 (3)在干燥涂片上加甲液3—5分钟,用蒸馏水冲洗。将残水沥干或用乙液冲去残水后,加适量乙液保持30—60秒钟。染色时在酒精灯上稍加热,使染液出现蒸汽即可,用蒸馏水冲洗。 (4)镜检:菌体及鞭毛皆染成茶色。

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol:PI染色检测细胞周期 1、收集细胞:胰酶(含EDTA)消化收集对数生长期细胞(加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个),吸取旧培养基到一个新离心管里;少量常温PBS(根据培养皿大小决定量,PBS洗可以保证消化效率)洗2次,清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】;然后胰酶消化(注意一定要消化完全,显微镜下观察细胞呈单个,而不是成片脱落)后利用旧培养基中和胰酶;离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞:用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀,使细胞充分悬浮成单细胞,再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%),吹打混匀以免细胞团聚,4℃固定2H至过夜。 4、细胞染色:离心(1000r/300g5min)收集固定的细胞,以1.8 mL的PBS洗细胞一次,离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来,但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入1 00μlRNaseA于37℃水浴30min,最后加入400μlPI避光染色30 min(常温或4℃均可) 【有的试剂盒说明是:每个样本加入500uL染色剂(据样本数,用P BS临时配好总量,其中PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Triton X-100 0.2%)4℃避光染色30分钟】 5、流式分析

以标准程序用流式细胞仪检测,一般计数2-3万个细胞,结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时,使用FL2-w和FL2-A显示,去除联体细胞。

常用血细胞化学染色原理及应用

常用血细胞化学染色原 理及应用 Document number:NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

常用血细胞化学染色原理及应用 (1)过氧化物酶染色的原理和临床意义(POX) [原理]粒细胞和单核细胞胞浆中含有的过氧化物酶能将底物过氧化氢分解,产生新生态氧,它将四甲基联苯胺氧化为蓝色联苯胺。后者进一步变成黑色化合物,沉积于胞质内。 正常血细胞的染色反应: 1.粒细胞系---原粒大多数呈阴性反应,有点渴出现少量蓝黑色颗粒。自早幼粒致成熟中性郡城阳性反应,细胞月成熟,阳性越强。中性分叶核强阳性,嗜酸性粒细胞阳性反应最强,其阳性颗粒比中性粗大,有折光性。定位于胞质内。嗜碱性粒细胞呈阴性反应。 2.单核细胞系-原始单核呈阴性反应,幼稚单核及单核呈弱阳性,阳性颗粒少而细小,均匀分布,有时也可呈阴性反应。 3.红细胞系、淋巴细胞系、巨核细胞系、浆细胞系---均呈阴性。有的巨噬细胞可呈阳性。 (2)过碘酸-雪夫染色的原理和临床意义(PAS) [原理]过碘酸-雪夫又称糖原染色。胞浆内存在的糖原或多糖类物质(如黏多糖、黏蛋白、糖蛋白、糖酯等)中的乙二醇基经过碘酸氧化,转变为二醛基,与雪夫试剂中的无色品红结合,形成紫红色化合物而沉积于胞浆中糖原类物质所存在的部位。该反应称为过碘酸-雪夫(PAS)阳性反应。 正常血细胞的染色反应: 1.粒细胞系-----原粒细胞多呈阴性,至早幼粒至中性分叶核粒细胞呈阳性反应,并随细胞熟,阳性反应的强度逐渐增强。嗜酸粒细胞本身不着色,而颗粒之间的胞浆呈红色,嗜碱粒细胞为阳性反应,阳性物质为大小不一的紫红色颗粒。 2.单核细胞系---原单位阴性,幼单为(+)阳性反应,单核细胞为(+)~(++)阳性反应。 3.淋巴细胞系---大多数淋巴细胞为阴性反应,少数淋巴细胞可为(+)阳性反应。 4.红细胞系----红细胞系的各个阶段皆呈阴性反应。

第三章细胞生物学研究方法总结

第三章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 分辨率: 肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm 一、光学显微镜技术 (light microscopy ) (一)普通复式光学显微镜技术 a . 光学放大系统:目镜和物镜 光镜 照明系统:光源、折光镜和聚光镜,有时另加各种滤光片 组成 机械和支架系统 b .分辨率D :分开两个质点间的最小距离。 0.61 λ 其中: λ为光源波长 D = α为物镜镜口张角 N ·sin α/2 N 为介质折射率 c.普通光镜样品制备: 固定(如甲醛)、包埋(如石蜡)、切片(约5μm )、染色 (二)荧光显微镜技术(fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位) 1. FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 2. 不同荧光素的激发光波长范围不同,所以同一样品可以同时用两种以上荧光 素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。 (三)激光共焦点扫描显微镜技术(laser scanning confocal microscopy ) 1.特点:瞬间只用很小一部分光照明,保证只有来自焦平面的光成像,成像清晰 分辨率比普通荧光显微镜提高1.4-1.7倍。 通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造,进行三维重构。 2. 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。 (四)相差和微分干涉显微镜技术 1.相差显微镜(phase-contrast microscopy ) 光线通过不同密度物质产生相位差,相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜的不同是其物镜后有一块“相差板”,夸大了不同密度造成的相位差。 2.微分干涉显微镜(differential -interference microscopy )——用的是平面偏振光 光经棱镜折射成两束,通过样品相邻部位,再经棱镜汇合,使样品厚度上的微小 差别转化为明暗区别,使样品产生很强的立体感。 二、电子显微镜技术(electron microscope ) (一) 电子显微镜基本知识 1.与光镜的基本区别:电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像 2.分辨本领与有效放大倍数: 分辨率0.2nm ,比肉眼放大 分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。 实际情况中,分辨率受样品限制。 3.电子显微镜 电子束照明系统:电子枪、聚光镜 基本构造 成像系统:物镜、中间镜、投影镜等 真空系统:用两级真空泵不断抽气 记录系统:荧光屏或感光胶片成像 (二) 主要电镜制样技术介绍 制样要求:①要求样品很薄(数十纳米) ②要求保持精细结构 1.超薄切片技术 ①固定:保持样品形态结构,甚至超微和分子水平上结构。 固定剂:常用饿酸(OsO 4)和戊二醛等,另外有物理方法如高频微波。

实验室做细胞常用的细胞固定及染色方法(详细)

实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法 一、爬片前盖玻片处理方法 对于悬浮培养的细胞,在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落,必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等,这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。 1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min,间或振荡。 2、用自来水冲洗5min。 3、以1%盐酸—70%乙醇溶液浸泡5min。 4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。 5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min,振荡。 6、入60℃烤箱1 h,或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。 二、细胞固定常用方法 固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来,避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等,使细胞和组织内的各种酶失去活性,防止细胞和组织的各种分子变性、解离,使细胞的化学物质和酶能准确定位,并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。同时,固定还可使细胞的各部分易于着色,适于观察、长期保存和分析。 1.固定组织、细胞的基本原则:尽可能选用新鲜培养物;根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。 2.培养物的准备和固定前处理:各种细胞培养物,如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说,常通过离心收集细胞,PBS漂洗2~3次后,备固定制片;对盖片单层培养物来说,将盖片从培养器皿中取出后,PBS液漂洗2~3次,以洗去血清和附着于细胞表面的残渣,备固定用。 3.常用固定液:常用的固定液分两类,一类是以单一化学物质配成的固定液,称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液,称混合固定液。如Mueller固定液、Flemming固液、FAA 固定液、Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等。

细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)操作步骤及注意事项

细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)操作步骤及注意事项 货号:G0170 规格:100T 有效期:12个月有效。 产品内容: 产品名称规格Storage 试剂(A):MDC Stain1ml-20℃避光 试剂(B):10×Wash buffer20ml4℃ 试剂(C):Collection buffer10ml4℃ 产品说明: 自噬(autophagy)是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器,最终将吞食物在溶酶体内降解的过程,自噬体(autophagosome)为双层膜包被的圆形或椭圆形结构,内含细胞质、长寿蛋白质和异常蛋白聚集物,损伤或多余细胞器如线粒体、粗面内质网和微体、病毒和细菌等。 单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC)是一种荧光色素,是嗜酸性染色剂,通常被用于检测自噬体形成的特异性标记染色剂,其检测激发滤光片波长355nm。阻断滤光片波长512nm。细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法),适用于培养细胞的自噬染色,又称为MDC染色液,可与EB合用双染。 自备材料: 荧光显微镜、低速离心机、EB、载玻片、盖玻片 操作步骤(仅供参考): (一)、MDC单独染色:

1、用去离子水稀释10×Wash buffer至1×。 2、800g离心5min,收集细胞,用300~400μl的1×Wash buffer清洗细胞1次,弃上清。 3、加入适量的1×Wash buffer重悬细胞,计数并调节细胞浓度至106/ml。 4、取适量90μl的细胞悬液至新的EP管中,加入10μl的MDC Stain,轻轻混匀。 5、室温避光染色15~45min。 6、800g离心5min,收集细胞,用300~400μl的1×Wash buffer清洗细胞2次,弃上清。 7、加入100μl的Collection buffer重悬细胞,滴加于载玻片上并加盖玻片。 8、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长355nm,阻断滤光片波长512nm),计数并拍照。 (二)、与EB双染色: 1、用去离子水稀释10×Wash buffer至1×。 2、800g离心5min,收集细胞,用300~400μl的1×Wash buffer清洗细胞1次,弃上清。 3、加入适量的1×Wash buffer重悬细胞,计数并调节细胞浓度至106/ml。 4、取适量90μl的细胞悬液至新的EP管中,分别加入10μl的MDC Stain和0.2μM EB 染色液,轻轻混匀。 5、滴加于在玻片上,室温避光染色15~30min,加盖玻片。 6、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长512nm),计数并拍照。 染色结果: 正常细胞细胞被均匀染成黄绿色荧光 凋亡细胞染色质浓缩,细胞核碎裂成点状,被染成大 小不一、致密浓染的绿色颗粒

十二常用血细胞化学染色

实验十二常用血细胞化学染色 Cytochemistry stain for blood cells 一、过氧化物酶染色 染色原理 粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有髓过氧化物酶(myeloperoxidase, POX或MPO),能将底物H202分解,产生新生态氧,新生态氧可氧化四甲基联苯胶成联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化形成棕色的四甲基苯酿二胺,后者与亚硝基铁氧化纳结合,再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒,沉淀于细胞质内酶所在的部位。 试剂器材 1.1%TMB(3,5,31,5f一四甲基联苯胶)乙醇溶液:0.1g TMB溶于100mL88%乙醇溶液中,置棕色瓶内,冰箱保存。 2.亚硝基铁氧化锅饱和溶液在少量蒸馏水中加入亚硝基铁氰晶体,至不再溶解为止,置棕色瓶内,冰箱保存。 3.1%过氧化氢溶液取30%H2021mL加入蒸馆水29mL。 4.稀过氧化氢溶液1%H2021滴,加10 mL蒸馏水稀释(新鲜配制)。 5.瑞氏(Wright)染色液。 6.新鲜涂片(骨髓或血片)、染色架、洗耳球、光学显微镜等。 操作步骤 1.取0.1%TMB乙醇溶液1mL,加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μL,溶液呈淡棕黄色,染色液应临用前配制。 2.在新鲜干燥的血片或骨髓涂片上,加0.1%TMB一亚硝基铁氰化钠饱和溶液0.5mL,放置lmin,再加稀H202溶液0.7mL,吹匀,染色6min。3.自来水冲洗,待干,用瑞氏染液复染15~20 min。 4.自来水冲洗,待干,用油镜镜检。 注意事顶 1.血涂片或骨髓涂片应新鲜制作,涂片应厚薄适宜。 2.TMB配制在85%~88%的乙醇溶液中染色效果较好,勿用90%~95%乙醇,否则细胞表面蛋白质很快凝固,妨碍试剂向胞内渗入而导致染色效果差。3.H202需新鲜配制,其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒,红细胞呈棕色或绿色,即表示H202过浓。若H202加于血片上不产生气泡,则示无效。 4.染色液pH应为5.5。 5.试剂应置于低温暗处,防止因光线照射而失效。 实验评价 1.POX染色是鉴别急性白血病类型最重要最常用的细胞化学染色方法,临床上不管是哪种急性白血病,首先做POX染色,以区分是急性髓细胞白血病还是急性淋巴细胞白血病。如变异型的急性早幼粒细胞白血病极易误诊为急单、急粒中如以小型原粒细胞为主者极易误认为急淋等。在判读细胞POX 染色结果前,要先观察成熟粒细胞是否呈强阳性,以判断染色是否成功。2.POX阳性说明是急性髓细胞白血病(阳性较强常见于急性粒细胞白血病,弱阳性常见于急性单核细胞白血病);阴性说明各种急性白血病的可能性均有。因原始细胞多表现为阴性反应,故本法对白血病的分型有一定的局限性,特别是对某些分化极差的白血病,可能失去鉴别意义。

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