人胰岛素的生产

简介

胰岛素(Insulin)是糖尿病，尤其是I型糖尿病的特效药物

，可以促进血液中葡萄糖的利用而降低血糖，并调节糖、脂肪及蛋白质代谢。WHO 相关资料表明：糖尿病已成为继

心血管疾病、肿瘤之后的第 3 位主要疾病，严重威胁全人类健康，全球共有糖尿病患者 1.75亿人，中国糖尿病患

者9200 万人，已超越印度成为亚洲第一大国。2002 年到2012 年的十年间，全球胰岛素的销售额年复合增长率达14.5%；2010年全球胰岛素药物的销售额超过145亿美元，因此胰岛素药物的开发和生产具有重大的社会效益和经济

效益。

人胰岛素是利用基因重组技术生产出来的。是利用重组DNA 技术生产与天然胰岛素有相同的结构和功能。可调节糖代谢，促进肝脏、骨骼和脂肪组织对葡萄糖的摄取和利用，促进葡萄糖转变为糖原贮存于肌肉和肝脏内，并抑制糖原异生。

胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素(Insulin Human)A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。

主要成份

活性成份：人胰岛素

非活性成份：甘油、间–甲酚

其结构式：

分子式：C257H338N65O77S6

分子量：5807.69

生产企业

中国通化东宝、丹麦诺和诺德、美国礼来

目前，国际上生产医用重组人胰岛素的（recombinant human insulin,rhI）方法主要有三种：

1)用基因工程大肠杆菌(E.coli)分别发酵生产人胰岛素(human

insulin，hI)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用；

2)用基因工程 E.coli发酵生产人胰岛素原(human

pminsulin，hPI)，后经加工形成hI。E.coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hI；

3)通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工院细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg/L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略，尤其是对E.coli表达系统的研究更是越来越深入，用E.coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，筒化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E.coli 发酵表达(His)6-Arg-Arg-人胰岛素原[(His)6-Arg-Arg-human proinsulin，RRh-PI] ，后加工成hl的制备工艺。

4)医用的胰岛素主要有两种，一种是从动物脏器中生化提取的动物胰岛素，如猪胰岛素、牛胰岛素等，动物脏器中生化提取产量低、成本高（100公斤动物胰腺只能提取4-5克胰岛素，一个病人所需胰岛素要从40头牛或50头猪的胰腺中提取）、纯度低，疗效差；一种是通过基因工程手段的人胰岛素，基因重组人胰岛素纯度高、疗效好

美国的E 1 i L i l l y和丹麦的No v o是目前向

市场供应基因工程人胰岛素的主要厂家，他们

分别研究和利用大肠杆菌和酵母生产人胰岛

素。这两个系统各有利弊，一般讲．大肠杆菌系

统表达效率高，但后处理较难：酵母系统表达量

虽然比较低．对表达产物的处理较简便。关键

胰岛素制备

生物技术制药参考资料 基因工程制备胰岛素 一、胰岛素的定义 胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。 二、目前临床使用的胰岛素来源 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。 三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法 1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用； 2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi； 3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略 I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—human proinsulin，PPh—PI]，后加工成hI的制备工艺。 四、基因工程制备胰岛素 1、提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法： （1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针 （2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。 （3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用 （4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作…… 2、提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒 为环状。主要有如下2种方法：

人胰岛素的制备

人胰岛素的制备

一、获得目的基因 从供体细胞中提取mRNA，以其为模板，在反转录酶的作用下，反转录合成胰岛素mRNA互补DNA，再以cDNA第一链为模板，在反转录酶或DNA聚合酶I的作用在，最终合成编码它的双链DNA序列。即得到了目的基因。 反转录-聚合酶链反应法 (一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA 1, 细胞总RNA的提取 : 取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。 2 ，从总RNA中分离mRNA： 取上述提取的总RNA若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀。 70℃水浴（裂解RNA的二级结构）， 20-30℃条件下，静置（让Oligotex 与mRNA结合）。将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。 （二）mRNA转录合成cDNA第一链 cone 第一链的合成 加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-free water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、 RNA酶抑制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素 利于检验），混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。取出置于冰上。

电泳分析，同位素活性测定。 （三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链 通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA 链。 PCR法的操作步骤： 预变性 引物退火 引物延伸 循环25-35次 最后延伸 ?前端引物： ?5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’ ?后端引物： ?5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’ 二、组建重组质粒 采用pQE--30质粒作为载体，用双酶切法进行基因重组。 １.双酶切法 用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端分别形成不同黏性末端，将它们混合，在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组DNA分子，从而实现DNA的定向连接。 ２.重组过程 pQE--30用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源DNA片段同样也用Hind Ⅲ和BamHⅠ酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后的载体外源DNA片段混合退火，因为Hind Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端不匹配，避免了载体和外源DNA片段的自身连接，外源DNA片段只能定向地连接到载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ位点之间。当然也不可避免发生载体的Hind Ⅲ和BamHⅠ的黏性末端之间的两个碱基互补形成开环，转到大肠杆菌中被修复，但这样的重组子占少数，是低效转化。 三、构建基因工程菌 (一)重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建 A链和B链同时表达法 将人胰岛素的A链和B链编码序列拼接在一起，然后组装在大肠杆菌-半乳糖苷酶基因的下游。重组子表达出的融合蛋白经CNBr处理后，分离纯化A-B链多肽，然后再根据两条链连接处的氨基酸残基性质，采用相应的裂解方法获得A 链和B链肽段，最终通过体外化学折叠制备具有活性的重组人胰岛素。重组DNA 的转化 1, CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞：

胰岛素生产现状

胰岛素生产现状 摘要：胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、 精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。也是治疗糖尿病最基础最有效的方法。糖尿病是由于绝对或相对不足或靶细胞对胰岛素不敏感导致糖、脂肪、蛋白质和水电解质等代谢紊乱而引起的慢性高血糖为特征内分泌代谢疾病。 由于生活方式改变与收入的上升，换糖尿病率提高。预计2025年糖尿病患病率为7.1%，20-79岁人口糖尿病患者突破3.80亿。2009年，中国胰岛素市场规模约为53亿元，但仍不到全球市场规模的6%。目前中国是全球糖尿病第一大国，糖尿病患者已达9200万人，加之中国糖尿病患者整体治疗率不足三成，且人均胰岛素使用量偏低，仅为美国糖尿病患者人均使用量的0.8%，所以中国胰岛素市场潜力巨大。胰岛素行业属于高技术含量行业范畴。中国基因工程人胰岛素胰岛素行业属于高技术含量行业范畴。中国基因工程人胰岛素产业化还基本处于起步阶段，生产成本高、生产规模小等特点使其国际竞争力甚弱，这也就造成了进口胰岛素垄断中国市场的现象。 关键词：胰岛素糖尿病 一、胰岛素的介绍 （一）、按来源不同分类 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 3、生物合成人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。 （二）、按药效时间长短分类 1、超短效：注射后15分钟起作用，高峰浓度1-2小时。 2、短效(速效)：注射后30分钟起作用，高峰浓度2-4小时，持续5-8小时。 3、中效(低鱼精蛋白锌胰岛素)：注射后2-4小时起效，高峰浓度6-12 小时，持续24-28小时。 4、长效(鱼精蛋白锌胰岛素)：注射后4-6小时起效，高峰浓度4-20 小时，持续24-36小时。 5、预混：即将短效与中效预先混合，可一次注射，且起效快(30分钟)，持续时间长达16-20小时。 市场常见的有30%短效和70%中效预混，和短、中效各占50%的预混两种。

大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺修订稿

大肠杆菌生产制备重组 人胰岛素工艺 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-

1.提取: 2.既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将从原DNA中分离. 3.2.提取质粒: 4.使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA. 5.3.基因重组: 6.取出与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒. 7.4.将质粒送回大肠杆菌: 8.再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将吸收. 9.5.胰岛素的产生: 10.再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素! 〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法 【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。 一、基础知识 【活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。 2．（记忆）DNA的溶解性特点： DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。 【思考1】据图5－1分析： DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？在L时溶解度最小； 要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解； 要使DNA析出，又需要使用什么浓度？L可使DNA析出。 【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。 3．（记忆）DNA的耐受性特点： 蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。 4．（记忆）DNA的鉴定原理 当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。在沸水浴条件下，该试剂与DNA反应，呈现（浅）蓝色。

胰岛素制备

生物技术制药参考资料 09级制药工程（1）班叶溢民090219011 基因工程制备胰岛素 一、胰岛素的定义 胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。 二、目前临床使用的胰岛素来源 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。 三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法 1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用； 2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi； 3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—human proinsulin，PPh—PI]，后加工成hI的制备工艺。 四、基因工程制备胰岛素 1、提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法： （1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针 （2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。 （3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用 （4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作…… 2、提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为 环状。主要有如下2种方法： （1）碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于

大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺设计

1.提取目的基因: 既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离. 2.提取质粒: 使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA. 3.基因重组: 取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒. 4.将质粒送回大肠杆菌: 再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收. 5.胰岛素的产生: 再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素! 〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法 【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。 一、基础知识 【活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。2．（记忆）DNA的溶解性特点： DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。 【思考1】据图5－1分析： DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点？在0.14mol/L时溶解度最小； 要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解； 要使DNA析出，又需要使用什么浓度？0.14mol/L可使DNA析出。 【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。 3．（记忆）DNA的耐受性特点： 蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。 4．（记忆）DNA的鉴定原理 当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。在沸水浴条件下，该试剂与DNA反应，呈现（浅）蓝色。 二、实验设计

重组人工胰岛素

重组人工胰岛素 胡霞 一、概念 1、概念：重组DNA技术生产的由51个氨基酸残基组成的蛋白质，宿主细胞为大肠杆菌。按干燥品计算，每1mg含重组人胰岛素不得少于27.5单位。重组人胰岛素中残余宿主DNA和宿主细胞蛋白质为与生产过程相关的、潜在的特异性杂质，必须在生产过程中严格控制，其限度应符合有关规定。 2、形状 该品为白色或类白色的结晶性粉末。 该品在水、乙醇和乙醚中几乎不溶，在稀盐酸和稀氢氧化钠溶液中易溶。3、物化性 分子量：5807.57022 分子式：C 257H 383 N 65 O 77 S 6 水溶性：2.0: 2 mg/mL 储存条件：2-8°C 二、工艺流程 1重组人工胰岛素的生产原理 通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—human proinsulin，PPh—PI]，后加工成hI的制备工艺。 2重组人工胰岛素的生产工艺流程

2.1菌种的制备 2.1.1目的基因的提取 既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法： （1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针 （2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。 （3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用 （4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作。 2.1.2提取质粒 使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒 质粒为环状。碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA 可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。 2.1.3基因重组将 取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA 连接酶将目的基因与质粒“缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。 2.1.4将质粒送回大肠杆菌 再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因，此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收。 将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态）。 2.2胰岛素的产生和精制（即菌种的发酵培养） 重组人工胰岛素的工业生产制备和深加工技术在如今已经是炉火纯青。有近百年的发酵工程为基础，结合现在的基因工程技术的产物，在菌种制备后的发酵培养过程更是可靠和安全的。 发酵培养流程见下图表： 对从菌种库中取出的菌种进行活化及初步扩大培养

人胰岛素的生产

简介 胰岛素(Insulin)是糖尿病，尤其是I型糖尿病的特效药物 ，可以促进血液中葡萄糖的利用而降低血糖，并调节糖、脂肪及蛋白质代谢。WHO 相关资料表明：糖尿病已成为继 心血管疾病、肿瘤之后的第 3 位主要疾病，严重威胁全人类健康，全球共有糖尿病患者 1.75亿人，中国糖尿病患 者9200 万人，已超越印度成为亚洲第一大国。2002 年到2012 年的十年间，全球胰岛素的销售额年复合增长率达14.5%；2010年全球胰岛素药物的销售额超过145亿美元，因此胰岛素药物的开发和生产具有重大的社会效益和经济 效益。 人胰岛素是利用基因重组技术生产出来的。是利用重组DNA 技术生产与天然胰岛素有相同的结构和功能。可调节糖代谢，促进肝脏、骨骼和脂肪组织对葡萄糖的摄取和利用，促进葡萄糖转变为糖原贮存于肌肉和肝脏内，并抑制糖原异生。 胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素(Insulin Human)A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。

主要成份 活性成份：人胰岛素 非活性成份：甘油、间–甲酚 其结构式： 分子式：C257H338N65O77S6 分子量：5807.69 生产企业 中国通化东宝、丹麦诺和诺德、美国礼来 目前，国际上生产医用重组人胰岛素的（recombinant human insulin,rhI）方法主要有三种： 1)用基因工程大肠杆菌(E.coli)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hI)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用； 2)用基因工程 E.coli发酵生产人胰岛素原(human pminsulin，hPI)，后经加工形成hI。E.coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hI；

大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺

1.提取目的基因: 既从人的DNA 中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA 中分离. 2.提取质粒: 使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA. 3.基因重组: 取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA 连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA 质粒. 4.将质粒送回大肠杆菌: 再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+ 的物质,如CaCl2 ,这使细胞会吸收外源基因此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收. 5.胰岛素的产生: 再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素! 〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法 【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。

一、基础知识 活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题： 1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。 2．（记忆）DNA的溶解性特点： DNA在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。 【思考1】据图5－1 分析： DNA在不同浓度NaCl 溶液中溶解度有何特点？在0.14mol/L 时溶解度最小； 要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解； 要使DNA析出，又需要使用什么浓度？0.14mol/L 可使DNA析出。【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。 3．（记忆）DNA的耐受性特点： 蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。

利用重组酵母菌生产人胰岛素

利用重组酵母菌生产人胰岛素 摘要利用套叠PCR技术合成重组人胰岛素基因，并在A链和B链之间加入Kex2酶切位点。将合成的重组人胰岛素基因以正确的阅读框插入到组成型分泌表达载体pGAPZα-A的α-factor信号肽序列的下游，构建成pGAPZα-A/Insulin重组分泌表达载体。表达载体用Bln I线性化处理后电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，构建成分泌型表达Insulin的工程菌。SDS2PAGE和Native2PAGE的分析表明：蛋白在分泌表达过程中，加入Insulin的A链（2.4k）和B链（3.4k）之间的Kex2酶切位点发挥了作用，Kex2蛋白酶将A链和B链切开，在α-factor信号肽的作用下通过分泌途径将A链和B链分泌到胞外，同时A链和B链又以二硫键形成了高级结构。WesternBlot结果表明：重组蛋白能够与鼠抗人Insulin抗体发生特异性反应，具有与天然Insulin相同的免疫原性。通过单因素分析和正交实验法对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵培养基进行了筛选和优化；对高效表达人生长激素的培养条件进行了优化；根据优化的摇瓶发酵结果进行了补料分批发酵；对表达产物进行了初步鉴定。 关键词：重组人胰岛素，毕赤酵母，分泌表达，培养基优化，晶体收集 Abstract：Use nested PCR synthesis of recombinant human insulin gene, join Kex2 cleavage sites between the A and B chains. The synthetic recombinant human insulin gene in the correct reading frame was inserted into the constitutive secretory expression vector pGAPZα-A α-factor signal peptide sequence Preparation the construct pGAPZα-A/Insulin recombinant secretory expression vector. The expression vector linearization Bln I treated electroporation competent cells of Pichia pastoris GS115 constructed expression of secretory Insulin engineered bacteria.The analysis SDS2PAGE and Native2PAGE showed that: the protein in the process of secretion expression added Insulin A chain (2.4k) and Kex2 cleavage sites between the B-chain (3.4k) played a role, Kex2 protease of the A and B chains cut through the secretory pathway in the role of the α-factor signal peptide of the a and B chains secreted into the extracellular domain, while the a-chain and B-chain disulfide bond formation Youyi advanced structure. WesternBlot: The results show that the recombinant protein was able to specifically react with mouse anti-human Insulin Antibodies

大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺

1. 提取目的基因: 既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离?2. 提取质粒： 使用细胞工程，培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒为环状DNA. 3. 基因重组： 取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒. 4?将质粒送回大肠杆菌： 再大肠杆菌的培养液中加入含有 Ca+的物质，如CaCI2，这使细胞会吸收外源基因此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收. 5?胰岛素的产生： 再大肠杆菌内，质粒通过表达转录与翻译后，便产生出胰岛素蛋白质?通过大肠杆菌的大量繁衍，便可大量生产出胰岛素！ 〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA E提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法 【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。 一、基础知识 【活动1】阅读教材P54 “基础知识”，讨论并回答下列问题: 1. （记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。

2. （记忆）DNA勺溶解性特点： DNA在不同浓度NaCI溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。 【思考1】据图5- 1分析： DNA在不同浓度NaCI溶液中溶解度有何特点？在 O.14mol/L时溶解度最小；要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解；要使DNA析出，又需要使用什么浓度？ O.14mol/L可使DNA析出。 【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将 DNA和蛋白质进一步分离目的。 3. （记忆）DNA勺耐受性特点： 蛋白酶能分解蛋白质而不能分解 DNA在60?80C时蛋白质变性沉淀而 DNA 分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。 4. （记忆）DNA勺鉴定原理 当鉴定提取出的物质是否是 DNA寸,需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定 在沸水浴条件下，该试剂与 DNA反应，呈现（浅）蓝色。 二、实验设计 【活动2】阅读教材P55 “实验设计”，讨论并回答下列问题：

胰岛素制备

胰岛素制备 Prepared on 22 November 2020

生物技术制药参考资料 基因工程制备胰岛素 一、胰岛素的定义 胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。 二、目前临床使用的胰岛素来源 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。 三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法 1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用； 2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi； 3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—human proinsulin，PPh —PI]，后加工成hI的制备工艺。 四、基因工程制备胰岛素 1、提取目的基因：既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方法： （1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针 （2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。 （3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用 （4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作…… 2、提取质粒：使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒，质粒 为环状。主要有如下2种方法： （1）碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。 （2）煮沸法

基因工程制备胰岛素2

基因工程制备胰岛素 一、胰岛素的定义 胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。 二、目前临床使用的胰岛素来源 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛 素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 2、半合成人胰岛素： 将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度 的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。 三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法。 1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这 一方法缺点较多，目前已较少使用； 2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，h PI)，后经加工形成hI。E． coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi； 3 、通过基因工程酵母菌发酵生产 hPI ，经后加工形成 hI 。酵母系统下游后加工比细菌表 达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少 (1 ～ 50 mg ／ L) ，产量低。 因此，虽然 rhI 投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的 表达策略 I2 J ，尤其是对

高效人工合成胰岛素工艺可行性研究

高效人工合成胰岛素工艺可行性研究 ［作者：生物工程二班罗文杰转贴自：本站原创点击数：2378 更新时间：2004-6-29 文 章录入：admin］ 一、项目背景 据WHO统计，全世界糖尿病患者已接近1.2亿，而我国目前糖尿病患者的总数已达到3000万人，跃居世界第二位，其中数百万患者长期使用胰岛素治疗。糖尿病例已成为仅次于心脑血管病症和癌症的第三大死亡疾病与顽症。随着我国经济的发展，国人的生活水平的提高，糖尿病的发生率将更高，糖尿病患者的数量也将增加，糖尿病将成为影响我国国民健康水平的重大疾病。国内外对糖尿病越来越重视，各方面研究也在不断的进行之中，并不断有相应的研究成果产生。 以知是糖尿病是产生机理是：当人体胰腺b 细胞被破坏时，细胞产生胰岛素的能力丧失，这样将导致1 型糖尿病的发生；此外，当患者餐时胰岛素分泌量不足，因而无法克服餐后血糖的升高时，2型糖尿病就会发生。因此，不管是1型还是2型糖尿病，都存在有胰岛素分泌的不足，只不过1型糖尿病患者胰岛素分泌能力完全丧失。由此可见，1型糖尿病患者或者一部分 2型糖尿病患者需要接受胰岛素治疗，以补充自身胰岛素的不足或者缺失。 目前国内市场上传统的降糖药物疗法并不能使糖尿病行到根本性治疗，而胰岛素则是通过调节葡萄糖的产生和分解来控制葡萄糖在人体中的供求平衡。其可视为是目前治疗糖尿病的最佳方式。同样由于胰岛素半衰期短，糖尿病患者随时需要注射胰岛素，一般来说一个糖尿病患者每天需要注射1克胰岛素。目前医用的胰岛素主要有两种，一种是从动物脏器中生化提取的动物胰岛素，如猪胰岛素、牛胰岛素等，动物脏器中生化提取产量低、成本高（100公斤动物胰腺只能提取4-5克胰岛素，一个病人所需胰岛素要从40头牛或50头猪的胰腺中提取）、纯度低，疗效差；一种是通过基因工程手段的人胰岛素，基因重组人胰岛素纯度高、疗效好。目前国内临床逐渐由国产的猪胰岛素（26.9元/400单位）转向基因工程人胰岛素。作为人体中惟一降低血糖的激素，人胰岛素的市场稳定性高，且呈不断增长态势。1982年投放市场后的两年，销售额分别增长30%和50%；1996年发达国家几乎都用人胰岛素，销售额为8.84亿美元；1998年人胰岛素的全求销售额达到25亿美元（预计2000年销售额不低于19.5亿美元），位于所有药物的前100名，位于生物工程药物的前几名。目前人胰岛素主要应用于西方发达国家，如美国和西欧等国。但随着我国经济的不断发展，人民生活水平的不断提高，人胰岛素在我国国内的应用也必将大量增加。国内外市场对人胰岛素的需求将始终处于增长的状态之中，市场将不断增大。 二、国内外生产水平 现在有三个国家在生产人胰岛素，为丹麦、美国和我国。主要公司有美国Eli lilly公司、丹麦Nove和我国的通化东宝集团。