辽师微生物实验
实验一油镜的使用和细菌的简单染色
一、目的要求
1.学习并掌握使用油镜的原理和方法。
2.通过简单染色，初步认识细菌的形态特征。
3.掌握染色的基本技术和无菌操作技术。
二、实验原理
1、油镜的使用原理
普通显微镜通常配置几种物镜，其中油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间滴加镜油，这主要有两方面的原因：
（1）增加照明亮度：油镜的放大倍数为100×，其焦距很短，但所需要的光照强度却最大，从玻片透过来的光线，有些会因折射和反射不能进入镜头，致使物象不清。为了不使光线有所损失，在使用油镜时，需在镜头与玻片之间加入与玻璃折射率相仿的镜油（香柏油）。
（2）增加显微镜的分辨率：由于香柏油的折射率比空气和水的折射率要高，因此以香柏油为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径要高于低倍镜、高倍镜等干镜。
2、简单染色原理
利用单一种染料对菌体进行染色的方法称为简单染色法。用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
3、无菌操作技术原理
高温对微生物具有致死的作用，因此在微生物的转接过程中，一般在火焰旁进
行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌目的，但一定要注意冷却后再进行转接，以免烫死微生物。如果转接液体培养物，则用预先已灭菌的玻璃吸管；如果只取少量而且无需定量也可用接种环，视实验目的而定。
三、器材
1、菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌(E.coli)和口腔细菌。
2、染色剂：结晶紫染液或碱性复红。
3、仪器或其他用具：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油、二甲苯）、擦镜纸、生理盐水。
四、步骤：
1、涂片：取三块载玻片，分别滴一滴生理盐水于载玻片中央，用接种环以无菌操作技术分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌少许菌苔于水滴中（口腔中细菌用牙签从口腔中刮取），均匀并涂成薄膜。
载玻片要洁净无油迹，取菌适量，涂片要均匀，不宜过厚。注意无菌操作。
2、干燥：自然干燥。
3、固定：涂面朝上，通过火焰2—3次。
热固定时温度不宜过高，否则会改变或破坏细胞形态。
4、染色：滴加染液于玻片上，以刚好覆盖涂面为宜，染色1min。
5、水洗：用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。
水洗时不要直接冲洗涂面，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。
6、干燥：自然干燥。
7、镜检：涂片干后镜检。按照先低倍镜后高倍镜再油镜的顺序进行。油镜的滴加方法为：在高倍镜下找到观察样品区域后，用用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心下降，使油镜浸在镜油中几乎与标本相接。调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器使镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像，并使用细调节器使其清晰准焦为止。
油镜使用完毕后一定要将油镜镜头擦试干净。
五、作业：
1、用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片与物镜镜头间滴加香柏油的作用是什么？
2、绘出在油镜下观察到的细菌形态图。
3、思考题：
（1）在进行涂片时应注意那些环节？
（2）进行细菌制片时为什么要进行热固定？在加热固定时应注意什么？（3）为什么要在制片完全干燥后才能进行油镜观察？
（4）进行微生物制片时是否都需要进行涂片？为什么？
（5）进行简单染色的目的及原理是什么？进行微生物制片时是否都需要染色？为什么？
（6）根据你的实验结果，对细菌进行简单染色时，染色时间对染色效果有何影响？为什么？
（7）你是否观察到金黄色葡萄球菌聚集成葡萄串状？试解释其形成原因。
实验二细菌革兰氏染色法、芽胞染色和荚膜染色
一、目的要求
1、掌握革兰氏染色法。
2、掌握芽胞染色法并观察芽胞的形态特征。
3、掌握荚膜染色法并观察荚膜的形态特征。
4、巩固显微操作技术及无菌操作技术。
二、基本原理
1、革兰氏染色原理
革兰氏染色法能将细菌分为G+菌和G-菌，其原因是这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢氏碘液进行媒染处理，由于形成碘—结晶紫复合物增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所有的网孔结构可以滞留碘—结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘—结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体
保持原有的蓝紫色。革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增强，原先滞留在细胞壁中的碘—结晶紫复合物容易被脱洗下来，菌体变为无色，用复染剂（番红）染色后又变成复染剂颜色（红色）。
2、芽胞染色原理
芽胞染色法是根据细菌的芽胞和菌体对染料的亲和力不同，用不同的染料进行染色，使芽胞和菌体呈不同颜色而便于区别。芽胞壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽胞使其着色，而进入芽胞的染料则难以透出。若再复染（番红液），则菌体呈红色而芽胞呈绿色。
3、荚膜染色原理
荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质。由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以通常用(负染色法)染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，从而与菌体区分开。
三、器材
1、菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、荚膜细菌。
2、染色剂：革兰氏染色液、孔雀绿染色液。
3、器材：酒精灯、载玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸、接种环，载玻片夹子、滴管等。
四、实验步骤
（一）革兰氏染色
1、制片
取活跃生长期菌种按常规方法涂片、干燥、固定。
选择对数生长期的菌种，防止染色结果错误。
2、初染
滴加草酸铵结晶紫染液染色1min-2min后倾倒去染液，水洗。
3、媒染
先用卢氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，水洗
4、脱色
将玻片上的残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管滴加95%乙醇20s-30s 冲洗,当流出液无色时立即用水洗去乙醇。
脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
5、复染
将玻片上的残留水用吸水纸吸去，番红染液染色2min，水洗，晾干。
6、镜检
低倍→高倍→油镜。
（二）芽胞染色
1、制片：按常规方法涂片、干燥、固定。
选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽胞，而老龄菌芽胞囊已经破裂。
2、加热染色：向载玻片滴加数滴孔雀绿染色液覆盖涂菌部位，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸汽并维持5min，加热时注意补充染液，切勿让涂片干涸。
3、脱色：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗直至水流无色为止。
4、复染：用番红水溶液复染2min。
5、水洗：用缓流自来水冲洗直至水流无色为止。
6、镜检：低倍→高倍→油镜。
（三）荚膜染色
1、推片：在载玻片一端滴一滴草酸铵结晶紫染液，无菌操作取少量菌体于其中混匀。另取一块载玻片作为推片，将推片一端与混合液接触，轻轻左右移动使混合液沿推片散开，之后以约30度角迅速向载玻片另一端推动，带动混合液在载玻片上铺成薄膜。
玻片必须干净无油迹，否则混合液不能均匀铺开。
2、水洗：用缓流自来水冲洗直至水流无色为止。
3、干燥：室温自然干燥。
4、镜检：低倍→高倍
五、作业
1、绘图并说明显微镜下观察到的革兰氏染色鉴定结果、芽胞和荚膜的形态特征。
2、思考题：
（1）革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？
（2）现有一未知菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴别该菌是革兰氏阴性还是革兰氏阳性，如何确定你染色结果的正确性？
（3）为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？
（4）你认为革兰氏染色中哪步可以省略？在哪种情况下可以省略？
（5）Gram在对死于肺炎的患者肺部组织进行检查时，经过染色，某些细菌如肺炎球菌保持蓝紫色，肺部组织背景为淡黄色，为什么肺部组织细胞未被染成蓝紫色？
实验四微生物的分离与纯化
一、目的要求
1、掌握倒平板的方法
2、掌握分离纯化微生物的基本操作技术
二、基本原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法主要有平板划线分离法和稀释涂布平板法。后者除能有效分离纯化微生物外，还可用于测定样品中活菌数。
三、器材
1、土壤样品：从校园中采集的土壤样品
2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基、查氏培养基、高氏Ⅰ号培养基
3、试剂和溶液：10%酚、1%链霉素、盛4.5mL无菌水的试管、盛45mL无菌水带有玻璃珠的三角瓶
4、仪器：玻璃棒、吸管、无菌玻璃涂棒等
四、操作步骤
1、倒平板
将三种培养基加热融化冷却至50℃左右，在高氏Ⅰ号培养基中加入10%酚数
滴，查氏培养基中加入1%链霉素溶液（终质量浓度为30ug/mL），混均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。
倒平板的方法：右手持盛培养基的三角瓶于火焰旁用，左手将棉塞轻轻拔出，瓶口保持对着火焰，然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住棉塞，左手持培养皿，并在火焰旁打开皿盖，成一条缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
2、制备土壤稀释液
取土样5g，放入盛45mL无菌水带有玻璃珠的三角瓶中，振摇约20min使土样与水充分混合，使细胞分散。用一0.5mL的移液管吸取0.5mL土壤悬液加入盛4.5mL无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5几种稀释度的土壤溶液。
悬液细胞密度适宜，混合均匀。
3、涂布
将上述每种培养基的平皿上标记10-3、10-4、10-5三种稀释浓度，做三个重复。用0.1mL移液管吸取稀释好的土壤悬液按标记分别准确加入，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻涂布均匀。其方法是先沿一条直线来回推动，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，再转动平板涂布边缘。
4、培养
查氏培养基和高氏Ⅰ号培养基的平板倒置于28℃温室培养3—5d，牛肉膏蛋白胨培养基的平板倒置于37℃温室中培养1—2d。
实验五三大类群微生物的菌落形态比较
和放线菌及霉菌的形态观察
一、目的要求
1、初步观察三大类微生物的群落形态特征。
2、学会平板菌落计数的基本原理和方法。
3、掌握放线菌和霉菌的形态特征。
二、基本原理
平板计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上；经过培养后在平板上形成
肉眼可见的菌落。统计菌落数根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。由于待测样品往往不易于分离成单个细胞，平板上形成的单个菌落不一定是由单个细胞繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞，因此，平板计数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位取代以前用绝对菌落数来表示样品中活菌含量的原因。
三、器材
1、菌种：青霉、曲霉、上次课分离纯化的微生物。
2、染液：乳酸石炭酸棉蓝染液。
3、各种装片
四、实验步骤
1、三大类微生物菌落形态比较
观察上次实验课分离得到的细菌、放线菌、霉菌，从菌落含水状态、外观状态、菌落透明度、菌落与培养基结合程度、菌落颜色、菌落正反面颜色差别、气味几个方面比较辨别三大微生物。
2、平板菌落计数
从每种培养基10-3、10-4、10-5三种稀释浓度的平板中选出平板中菌落在50—200的稀释浓度进行计数。按以下公式进行计算：
每毫升样液中菌落形成单位数（cfu）=同一稀释浓度的平均菌落数*稀释倍数*10平均菌落数在五十左右最好。
3、放线菌及霉菌的装片观察
4、霉菌的制片观察
滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染液于载玻片上，用镊子分别取青霉和曲霉，先放在50%的乙醇中浸一下洗去脱落的孢子，然后置于染液中，用解剖针小心将菌丝分开，去掉培养基，盖上盖玻片，在低倍镜和高倍镜下观察。
注意无菌操作，取菌时要带下一些培养基，盖片时要将培养基分离出去，制片要薄。
五、作业
1、平板计数结果.
2、绘制根霉的形态和构造，青霉和曲霉分生孢子头的结构。
实验六酵母菌的形态观察、死活细胞的鉴别
和显微镜直接计数
一、目的要求
1、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞。
2、学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法。
3、学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞数目的方法。
二、实验原理
美蓝染液有两种形式，其氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母菌进行染色后，由于活细胞体新陈代谢力强，染料进入细胞后，细胞可将氧化型美蓝还原为无色的还原型，由此区分酵母菌的死活细胞。
微生物大小的测定需要借助特殊的测量工具—显微测微尺，它包括目镜测微尺和镜台测微尺两个相互配合的部件。
镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其总长度为1mm精确的分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每一小个长度为0.01mm，即10μm镜台测微尺并不直接用来测定微生物的大小，而是用来校正目镜测微尺每一小格的相对长度。
目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜的隔板上，用于测量经显微镜放大后的细胞物像。由于不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。因此用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以测定该显微镜在一定目镜和物镜的组合下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。转换公式如下：
用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的
计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm。则每一个大方格的面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm3(1/10000ml)。计数时。计数时求出每一小格的平均值，然后通过公式，得到lmL菌液中的总菌数。设每个小格的平均菌数为A，菌液稀释倍数为B，则总菌数/ml = 4×106×A×B
三、器材
1、菌种：酵母菌悬液。
2、仪器：目镜测微尺、镜台测微尺、血细胞计数板等。
3、染液：0.1%美蓝染色液。
四、实验步骤
1、酵母菌的形态观察
取一滴酵母菌悬液于载玻片中央，在悬液上滴加一滴美蓝染液混匀，盖上盖玻片，在低倍镜和高倍镜下观察。
2、酵母菌大小的测定
把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺轻轻放在目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下，然后放回到镜筒内。将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，并使两尺左边的一条线重合，向右寻找另外一条两尺相重合的直线。校准目镜测微尺，根据公式计算目镜测微尺每格长度，卸下镜台测微尺，换上酵母菌装片，测定酵母菌的大小。
测量完毕后取出目镜测微尺，将目镜放回镜筒，并将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。
校准目镜测微尺每格长度和测定酵母菌大小要在相同的放大倍数下进行。光线不宜过强。
3、酵母菌计数
在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗并吹干。将洁净的血细胞计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管将摇匀的酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用镊子轻压盖玻片然后将加有样品的的血细胞计数板置于载物台上，先在低倍镜下找到计数室，再在高倍镜下观察，并计数。
取样时先要摇匀菌液，加样时计数室内不可有气泡。计数时，视野要调暗些。不可用刷子等硬物清洗，不可用酒精灯烘烤计数板。
五、作业
1、绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。
2、计算酵母菌养液的浓度，该方法得到的结果与平板菌落计数有何不同？
实验七化学因素对微生物的影响
一、目的要求
1、了解常用化学消毒剂对微生物的作用。
2、学习测定消毒剂对微生物作用效果的实验方法。
二、实验原理
常用化学消毒剂包括有机溶剂（酚、醇、醛等）、重金属盐、卤族元素及其化合物、染料和表面活性剂等。有机溶剂使蛋白质（酶）和核酸变性失活，破坏细胞壁；重金属盐也使蛋白质（酶）和核酸变性失活，或与细胞代谢产物螯合成无效化合物；碘与蛋白质酪氨酸残基不可逆结合使蛋白质失活，氯与水作用形成强氧化剂使蛋白质氧化变性；低浓度染料可以抑制细菌生长，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对染料更加敏感；表面活性剂可以改变细胞膜透性，也是蛋白质变性。
三、实验器材
1、菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
3、溶液或试剂：2.5%碘酒、75%乙醇、5%石碳酸、0.05%龙胆紫、2%过氧乙酸、0.25%新洁尔灭、无菌生理盐水。
4、仪器及其他用具：无菌培养皿、牛津杯、试管、吸管、三角涂棒等。
四、实验步骤
1、倒平板
2、涂菌
吸取0.2mL菌悬液加入到上述平板中，用无菌三角涂棒涂匀。
3、平皿划分
将每种培养基的两个平板底皿分别划分成三等份和四等份，并标注要加的消毒剂名称。
4、放置牛津杯
在无菌操作台中用镊子取一牛津杯放在培养皿各份的中心位置，并用镊子稍稍平压，使牛津杯和培养基充分接触。
5、加样
分别取0.2mL不同的消毒剂加在牛津杯中。
小心加入，不要将消毒剂洒在牛津杯外。
6、培养
将上述加好消毒剂的培养皿放入37℃温室中培养。
培养皿不要倒置，要轻拿轻放，勿使牛津杯翻倒。
7、记录结果
24h后测量抑菌圈的大小，并拍照。
五、作业
1、医院用作消毒剂的乙醇浓度是多少，为何采用该浓度乙醇作为消毒剂？
3、利用牛津杯法测定化学消毒剂对微生物的作用时，影响抑（杀）菌圈大小的因素有哪些？抑（杀）菌圈大小能否准确反映化学消毒剂抑（杀）菌能力的强弱？
3、设计一个简单实验，证明某化学消毒剂对某试验菌起抑菌作用还是杀菌作用。
实验八微生物的生理生化反应
一、目的要求
1、证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2、掌握进行微生物大分子物质水解实验的原理和方法。
3、了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中的重要的作用。
4、掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
二、实验原理
1、明胶水解的原理
明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状态，以固体形式
存在，而在25℃以上明胶会液化。有些微生物可产生一种称作明胶酶的胞外酶，水解这种蛋白质，而使明胶液化，甚至在4℃仍能保持液化状态。
2、糖发酵试验的原理
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化实验，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大差异，有些细菌能分解某种糖，产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等），有些细菌只产酸不产气，不能分解乳糖。发酵培养基含有蛋白胨、指示剂（溴甲酚紫）、倒置的德汉氏小管和不同的糖类。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）转变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
三、器材
1、菌种：枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌。
2、培养基：明胶培养基试管、葡萄糖发酵培养基试管、乳糖发酵培养基试管。
3、仪器：接种针、接种环、试管架。
四、实验步骤
1、明胶水解实验
（1）取3支明胶培养基试管，用记号笔标明各管预接种的菌名。
（2）用接种针分别穿刺接种枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。（3）将接种后的试管置20℃中培养2-5d。
（4）观察明胶液化情况。
2、糖酵解试验
（1）用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名。
（2）取葡萄糖发酵培养基试管3支，分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三只不接菌，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样分别接入大肠杆菌、普通变形杆菌，第三只不接菌，作为对照。
在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。
（3）将接过种和作为对照的6支试管均置于37℃中培养24—48h。
（4）观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。
五、作业
1、记录明胶水解试验结果。
2、记录糖发酵实验结果。
实验九噬菌体的分离纯化及其效价的测定
一、目的要求
1、学习分离纯化噬菌体的基本原理和方法，观察噬菌斑。
2、掌握噬菌体效价测定技术。
二、实验原理
噬菌体是细菌的专性寄生物，自然界中凡是有细菌存在的地方，均可以发现其特异性的噬菌体，噬菌体侵入细菌细胞后，利用宿主细胞的酶系统进行复制和增殖，最终导致细菌细胞裂解，噬菌体从细胞中释放出来，可以进一步侵染细菌细胞。在液体培养基中，噬菌体可以使浑浊的菌悬液变为澄清。在长有宿主细菌的固体培养基平板上，噬菌体可以裂解细菌形成透明的空斑，即噬菌斑，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此可以利用这个性质对噬菌体进行分离和效价的测定。噬菌体的效价是指噬菌体的浓度，即一毫升培养液中所含有的噬菌体数量。噬菌体效价的测定方法多采用双层琼脂平板法。先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计算噬菌斑的数量。
三、器材
1、菌种：大肠杆菌
2、培养基：500mL三角烧瓶内装3倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基10mL，试管液体培养基，上层琼脂培养基（琼脂粉约0.5%，试管分装，每管4mL）,底层琼脂平板（含培养基10mL，琼脂1.5%-2%）.
3.仪器和其它用品：无菌小试管、玻璃涂棒、无菌细菌过滤器，恒温水浴锅和蠕动泵。
4、阴沟污水。
四、实验步骤
1、噬菌体的分离
（1）宿主细胞的培养：用接种环在斜面上挑取少许菌苔接入5mL牛肉膏蛋白胨培养液中，混合均匀后37℃振荡培养过夜。
（2）噬菌体增殖：在10mL 3倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角瓶中加入阴沟污水20mL和大肠杆菌过夜培养物0.3mL，混合后37℃振荡培养12-24h。（3）裂解液制备：将上述混合培养物倒入一支50mL无菌离心管中，经4000r/min 离心15min；将上清液转入另一支无菌离心管中，所得裂解液37℃振荡培养过夜，做无菌检查，此为噬菌体裂解液，还可以加入几滴氯仿，稍作混匀，备用。（4）噬菌体的检测：在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入1mL大肠杆菌菌液，用无菌玻璃涂棒，将菌液均匀的涂布在培养基表面。
待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，37℃培养过夜。如果滴加裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌体斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。2、高效价噬菌体的制备
一般来说，开始从自然环境中分离得到的噬菌体效价不高，需将噬菌体进行增殖。将纯化的噬菌体裂解液与液体培养基按1：10的比例混合，再加入大肠杆菌悬液适量，37℃培养，使噬菌体增殖，如此重复数次，便可得到高效价的噬菌体制品。
3、噬菌体的纯化
（1）取含噬菌体的裂解液0.1mL于一支试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌培养物，混合均匀。
（2）取上层琼脂培养基溶化并冷却到55℃，加入0.2mL上述噬菌体与细菌的混合液，混匀后迅速倒入盛有底层培养基的平板上，铺匀，37℃培养24h。
（3）取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的特征，如不纯需进一步纯化。4、噬菌体效价的测定
（1）噬菌体液的稀释
①将4支含0.9mL液体培养基的试管分别表明10-3、10-4、10-5、10-6字样。
②用1mL无菌吸管吸0.1mL10-2大肠杆菌噬菌体液加入10-3试管中摇匀。
③用1mL无菌吸管吸0.1mL10-3大肠杆菌噬菌体液加入10-4试管中摇匀。以此类推，稀释至10-6管。
（2）噬菌体与菌液混合
①将12支无菌空试管分别标记为10-4、10-5、10-6和对照各3支。
②用无菌吸管吸分别吸取10-4、10-5、10-63种噬菌体稀释液各0.1mL加入相应标记的无菌空试管内，再加入0.1mL大肠杆菌于其中，对照管中只加0.1mL菌液和0.1mL无菌水，轻轻混合。
（3）混合液与上层培养基混合
①将上层培养基溶化，分别标记10-3、10-4、10-5、10-6和对照字样各三支，使其冷却至55℃，并放入55℃水浴锅内保温。
②根据标号分别将混合管和对照管加入上层培养基，摇匀，再快速将试管中的所有培养基和菌液对号倒在含底层培养基的平板上，摇匀，是上层培养基铺满平板。
③凝固后，37℃培养24h。
（4）统计噬菌斑形成单位（Pfu）数：仔细观察平板上形成的噬菌斑，记录结果，根据下列公式计算出样品中噬菌体的效价：
（5）噬菌体效价/ml=Pfu数×稀释倍数×10.
注：本实验为综合设计性实验，学生根据本组情况，自己设计实验方案、采样、分离纯化、测定效价，实验结果综合设计性实验报告形式提交，并准备实验答辩。
实验十枯草芽胞杆菌的分离纯化、鉴定
一、目的要求
1、掌握分离枯草芽胞杆菌的方法。
2、掌握纯化枯草芽胞杆菌的方法。
3、掌握如何鉴别所得菌是否为枯草芽胞杆菌的方法。
二、实验原理
枯草芽胞杆菌是芽胞杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽胞0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽胞形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，
污白色或微黄色。枯草芽胞杆菌为需氧菌，可利用酵素，过氧化氢酶阳性，V.P.反应阳性，所产生的蛋白酶可以分解明胶，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。利用以上菌落形态和生理生化特征，就可以分离纯化，逐步鉴定出所得微生物是否为枯草芽胞杆菌。
三、器材
1、材料：花园土
2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基
3、溶液或试剂：染色液，进行生理生化鉴定的培养基
4、器材和其他用具：显微镜，镜台测微尺，目镜测微尺，培养皿，试管，三角瓶，移液管，涂布棒，接种环，接种针，高压蒸汽灭菌锅，恒温培养箱等。
四、实验步骤
1、菌种的分离和纯化
（1）土样的采集：取校园内的花园土。
（2）取土样若干,放入装有无菌水的三角瓶中，摇动20min，然后加热至沸腾，维持1min，静置5min。采用平板划线或稀释涂布的方法进行分离纯化。
2.菌种的鉴定
（1）菌落形态鉴定
菌落大小、菌落表面特征、菌落边缘特征、菌落透明度及菌落的颜色等。（2）个体形态鉴定
革兰氏染色、芽胞染色及菌体大小的测定等
（3）生理生化鉴定
①过氧化氢酶反应：取一干净载玻片，在上面滴加1滴3—10%过氧化氢，挑取一环培养的菌苔，在过氧化氢中涂抹，若有气泡出现，为过氧化氢酶阳性，或将过氧化氢液直接加在斜面上，观察气泡的产生。
②需氧性实验：枯草芽胞杆菌为需氧型。
③乙酰甲基甲醇实验：枯草芽胞杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸作用，生呈红色化合物，即表现为V.P.试验阳性。
实验方法：将测试菌接种于上述培养液中，30℃恒温培养箱中4—7天。观察结果，在培养4天后，取培养液2mL和等量的40%氢氧化钠相互混匀，加少量肌酸（约0.5-1mg）充分振荡，2-5min后如培养液呈红色，即为V.P.试验阳性，符合枯草芽胞杆菌的特征，继续下一步实验。有时需放置更长的时间才能出现红色。在培养7天后，用精密pH试纸测试培养液pH值，记录结果。
④明胶水解实验：明胶是一种动物性蛋白质，枯草芽胞杆菌所产生的蛋白酶可分解明胶，明胶被分解后，其分子变小，虽然在低于20℃的温度下，也不再凝固。
⑤淀粉水解实验：枯草芽胞杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再变蓝。
实验方法：在牛肉膏蛋白胨培养基中添加0.02%可溶性淀粉，分装三角瓶，0.1MPa20min灭菌，倒平板，凝固后取菌种点种于平板上，每皿点种2点，30℃恒温培养箱中2—4天，形成菌落后，在平板上滴加碘液，以铺满菌落为度，平板成蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即符合枯草芽胞杆菌的特征，透明权的大小，可表明水解淀粉能力的大小。
注：本实验为综合设计性实验，学生根据本组情况，自己设计实验方案、采样、分离纯化、测定效价，实验结果综合设计性实验报告形式提交，并准备实验答辩。
A
* Absorption 吸附
* Acid-fast bacilli 抗酸杆菌Acquired immunity 获得性免疫
* Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS 获得性免疫缺陷综合征
* Actinomyces 放线菌属Acute infection 急性感染* Adenovirus 腺病毒
* Anaerobic bacteria 厌氧性细菌
Anaerobic medium 厌氧培养基
* Antisepsis 防腐
Antiviral protein,AVP 抗病
毒蛋白
Apoptosis 细胞凋亡
* Apparent infection 显性感
染
* Artificial active
immunization 人工主动免
疫
* Artificial passive
immunization 人工被动免
疫
* Asepsis 无菌
Aspergillus 曲霉属
* Assembly and release 装
备与释放
Autotroph 自养菌
* Attenuated vaccine 减毒
疫苗
B
* Bacillus 芽胞杆菌属
* Bacillus anthracis 炭疽芽
胞杆菌
Bacillus cereus 蜡样芽胞杆
菌
* Bacteremia 菌血症Bacterial infection 细菌感染
* Bacterial L form 细菌L型* Bacteriocin 细菌素
* Bacteriophage 噬菌体
* Bacterium 细菌
* Bacteriodes fragilis 脆弱类杆菌
Bifidobacterium 双歧杆菌属
* Binary fission 二分裂
* Bioproduct 生物制品
* Biosynthesis 生物合成Biotype 生物型Blastospore 芽生孢子
* Botulin 肉毒毒素Bovine spongiform encephalopathy,BSE 牛海绵状脑病(疯牛病)
* Bordetella pertussis 百日咳鲍特菌
* Brucella 布鲁菌属
C
* Candida albicans 白假丝酵母菌
* Capsid 衣壳Capsomere 壳粒
* Capsule 荚膜
* Carrier 带菌者
* Carrier state 带菌状态
* Clostridium 梭菌属
* C.botulinum 肉毒梭菌Cell membrane 细胞膜Cellular microbiology 细胞微生物学
Cell wall 细胞壁
* Chlamydia 衣原体Chlamydospore 厚膜胞子* Chronic infection 慢性感染
C.jejuni 空肠弯曲菌* Coagulase 凝固酶
* Coccus 球菌
* Colony 菌落
Colonization 定植
Complex symmetry 复合对
称
* Conditional pathogen 条
件致病菌
* Conjugation 接合
Core polysaccharide 核心多
糖
Coronavirus 冠状病毒
* Corynebacterium
diphtheriae 白喉棒状杆菌
* C.perfringens 产气荚膜梭
菌
* C.pneumoniae 肺炎衣原
体
* C.tetani 破伤风梭菌
* C.trachomatis 沙眼衣原体
* Culture medium 培养基
Cytoplasme 细胞质
D
* Darkfeild microscope 暗
视野显微镜
Decline phase 衰亡期
Defective interfering
particles,DIP 缺陷干扰颗粒
* Defective virus 缺陷病毒
* Dengue virus 登革病毒
* Dermatophytes 皮肤癣菌
* Diplococcus 双球菌
Differential medium 鉴别培
养基
* Disinfectant 消毒剂
* Disinfection 消毒
* Dysbacteriosis 菌群失调
* Dysentery bacterium 痢疾
杆菌
E
E.aerogenes 产气肠杆菌
Electron microscope 电子显
微镜
elementary body 原体
* Encephalitis B virus 乙型
脑炎病毒
Endospore 内芽胞
* Endotoxin 内毒素
* Enterotoxin 肠毒素
* Enterovirus 肠道病毒
* Envelope 包膜
Epidermophyton 表皮癣菌
* Escherichia coli 大肠埃希
菌
* Exogenous infection 外源
性感染
* Exotoxin 外毒素
F
* Facultative anaerobe 兼性
厌氧菌
* Fertility factor,F factor 致
育因子
Filamentous fungus 丝状菌
Filter 滤菌器
* Fimbriae 菌毛
* Flagellum 鞭毛
Fractional sterilization 间歇
蒸气灭菌法
* Fungus 真菌
G
* Generalized infection 全
身感染
Generalized transduction 普
遍性转导
* Gene transfer 基因转移
* Gonococcus 淋球菌
* Gram stain 革兰氏染色
* Growth curve 生长曲线
* Growth factor 生长因子
H
* Haemophilus influenzae 流感嗜血杆菌
* Helicobacter pylori 幽门螺杆菌
* Helical symmetry 螺旋对称
* Hemagglutinin ，HA 血凝素
* HA V, Hepatitis A virus 甲型肝炎病毒
* HBV, Hepatitis B virus 乙型肝炎病毒
* HCV, Hepatitis C virus 丙型肝炎病毒
* HDV, Hepatitis D virus 丁型肝炎病毒
* HEV, hepatitis E virus 戊型肝炎病毒
* HGV, hepatitis G virus 庚型肝炎病毒
Heterotroph 异养菌
* Human immunodeficiency viru ,HIV 人类免疫缺陷病毒
* Human papillomavirus，HPV 人乳头瘤病毒
* Hyaluronidase 透明质酸酶
* Hypha 菌丝
I
* Icosahedral symmetry 二十面体对称
* Inactivated vaccine 灭活疫苗
* Inactivation 灭活
* Inapparent infection 隐性感染
* Inclusion bodies 包涵体* Infection immunity 传染免疫* Influenza virus 流行性感
冒病毒
Initial body 始体
* Innate immunity 天然免
疫
lnsertion sequence, IS 插入
序列
* Integration 整合
Interference 干扰现象
* Interferon 干扰素
* Invasiveness 侵袭
Invasin 侵袭素
K
klebsiella 克雷伯菌属
K.pneumoniae 肺炎克雷伯
菌
Kuru disease 库鲁病
L
* Latent infection 潜伏感染
Lecithinase 卵磷脂酶
* Legionella 军团菌属
L. Pneumophila 嗜肺军团
菌
* Leptospira 钩端螺旋体
Light microscope 光学显微
镜
* Lipid A 类脂A
* Lipopolysaccharide, LPS
脂多糖
Logarithmic phase 对数期
Lyophilization 冷冻真空干
燥法
* Lysogenic phage 溶源性
噬菌体
* Lysogenic bacterium 溶源
性细菌
* Lysogenic conversion 溶
源性转换
* Lysozyme 溶菌酶
M
Macrocomidium 大分生孢
子
* Measles virus 麻疹病毒
Median infective dose ID50
半数感染量
Median lethal dose LD50 半
数致死量
* Microbiology 微生物学
* Meningococcus 脑膜炎球
菌
* Metachromatic granule 异
染颗粒
* Microaerophilic bacterium
微需氧菌
Microcapsule 微荚膜
Microconidium 小分生孢子
Microecology 微生态学
* Microorganism 微生物
* Mycobacterium 分枝杆菌
* M.leprae 麻风分枝杆菌
* Mold 霉菌
* Mycoplasma 支原体
* M. Pneumoniae 肺炎支原
体
* M.tuberculosis 结核分枝
杆菌
Mucor 毛霉
* Mumps virus 腮腺炎病毒
* Mycelium 菌丝体
N
* Negri body 内基小体
* Negative staining 负染
* Neisseria 奈瑟菌属
* N.gonorrhoeae 淋病奈瑟
菌
* N.meningitidis 膜炎奈瑟
菌
Neurotoxin 神经毒素
* Nonpathogenic
bacterium,nonpathogen 非
微生物实验报告(微生物形态观察、分布、灭菌消毒)
微生物实验 微生物实验 细菌形态观察 细菌分布 消毒灭菌
细菌形态观察 一、实验目的 1.掌握光学显微镜（油镜）的使用及日常维护 2.掌握细菌的三种形态 3.掌握临床常见细菌的形态及染色 4.掌握细菌的特殊结构 5.了解支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体及真菌的结构特点 二、实验原理 1. 普通光学显微镜（油镜）的使用 1. 在标本欲检部位滴一滴香柏油，然后转换油镜头 2. 从侧面观察并慢慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时 停止转动，以免碰撞玻片，用双眼观察目镜，同时调节细调节器，直至细菌清晰 3. 根据需要调节显微镜亮度 2. 普通光学显微镜的维护 1.移动显微镜时，用右手持镜壁，左手托镜座，平端于胸前 2.油镜用毕后，要立即用擦镜纸擦去香柏油；再用滴有二甲苯的擦镜纸擦油镜头；最 后，用干净擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去，以免损伤油镜头 3.镜头擦净后，降低接物镜并将其转成八字形，罩好镜罩放入柜内 4.做好使用记录 3．微生物知识 1．细菌按形态分类： 球菌：球形（包括双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌、链球菌等） 杆菌：杆状（包括单杆菌、双杆菌、链杆菌、分枝杆菌、双歧杆菌等） 螺旋菌：螺旋状（包括螺旋菌、弧菌等） 2．细菌的基本结构 细胞壁、细胞膜、细胞质、核质、核蛋白体 3．细菌的特殊结构 荚膜：如肺炎双球菌 鞭毛：又分单毛菌、双毛菌、丛毛菌、周毛菌。如：变形杆菌为周毛菌 菌毛 芽胞：如破伤风梭菌、炭疽芽胞杆菌、肉毒梭菌 4．微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，包括原核类、真核类和非细胞类。 原核类：细菌、放线菌、蓝藻、衣原体、支原体、立克次氏体 真核类：真菌、原生动物、显微藻类 非细胞类：病毒、亚病毒 5．真菌 单细胞：圆形、芽生孢子。如：酵母菌
完整版防腐挑战实验
第一部分防腐挑战实验调研结果1实验样品 样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300go 2微生物挑战性实验 2.1实验菌株 不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表 国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA）推荐的菌种（因其较具代表性，如表更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，表1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株 美国美国英国德国菌株 （药典）（ISP公司）（药典）（Henkel公司）白假丝酵母V V V V 黑曲霉V V V V 红色青霉V 绿色木霉V 绳状青霉 大肠埃希氏菌V V V 镉绿假单胞菌V V V 金黄色葡萄球菌V V V V 粪肠球菌V 产气肠杆菌V 表皮葡萄球菌1）,国内参照美2所示），所以MIC值不同） 德国 （S&M公
日勾维肠杆菌洋葱假单胞菌
肺炎克雷伯氏菌 恶臭假单胞菌 荧光假单胞菌 表2 CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择 种类菌株数量 革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 至少选一种 发酵革兰氏阴性杆菌表皮葡萄球菌肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 大肠埃希氏菌 至少选两种 非发酵革兰氏阴性杆菌 变形菌属 日勾维肠杆菌铜绿假单胞菌洋 葱假单胞菌荧光假单胞菌 至少选一种 酵母 恶臭假单胞菌 黄杆菌属不动杆菌属白假丝酵母 至少选一种 霉菌近平滑假丝酵母 黑曲霉 至少选一种 产芽砲菌 黄绿青霉 枯草芽砲杆菌 供选用 生产现场分离菌适当菌株—*种以上2.2培养基 牛肉膏蛋白月东培养基、琼脂培养基
2.3试验用菌液的配置 （1）标准悬液的配制 1%硫酸9.9ml与1%氯化锁0.1ml,混合后配制成的悬液浓度为3X108clu/ml , 此悬液再做3倍稀释。 （2）细菌菌悬液的配制 实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。将己培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（ 3X 108cfu/ml）相同为止； 此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1 X108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。 （3）霉菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡 摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计 数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190?210,落在此范围内的菌悬液为我们所需的1 X 108cfo/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。 2.4接种 2.4.1接种方式 （1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。 （2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了
国内外微生物肥料的发展概况汇总
国内外微生物肥料的发展概况 一、微生物肥料的定义 微生物肥料是指一类含有活微生物的特定制，应用于农业生产中，能够获得特定的肥料效应。可将微生物肥料分为两类，一类是通过其中所含微生物的生命活动，增加了植物营养元素的供应量，导致村物营养状况的改善，进而产量增加，代表品种是要菌肥：另一类是广义的微生物肥料，其制品虽然也是通过其中所含的微生物生命活动作用使作物增产，但它不仅仅限于提高植物营养元素的供应水平，还包括了它们所产生的次生代射物质，如激素类物质对植物的刺激作用，促进植物对营养元素的吸收利用，或者能够拮抗某些病原微生物的致病作用，减轻病虫害而使作物产量增加。 二、微生物肥料的种类和作用机理 微生物肥料的种类很多，如果按其制品中特定的微生物种类可分为细菌肥料(如根病菌肥、固氮菌肥)、放线菌肥(如抗生菌类、5406)、真菌类肥料(如菌根真菌)等：按其作用机理又可分为根瘤菌肥料、固氮菌肥料、解磷菌类肥料、解钾菌类肥料等：按其制品中微生物的种类又可分为单纯的微生物肥料和复合微生物肥料。微生物肥料的功效主要是与营养元素的来源和有效性有关，或与作物吸收营养、水分和抗病有关，概况起来有以下几个方面： 1、增加土壤肥力，这是微生物肥料的主要功效之一。如各种自生、联合、共生的国氮微生物肥料，可以增加土壤中的氮素来源，多种解磷、解钾微生物的应用，可以将土壤中难溶的磷、钾分解出来，从而能为作物吸收利用。 2、产生植物激素类物质刺激作物生长，许多用作微生物肥料的微生物还可产生植物激素类物质，能刺激和调节作物生长，使植物生长健壮，营养状况和得到改善。 3、对有害微生物的生物防治作用，由于在作物根部接种微生物肥力，微生物在作物根部大量生长繁殖，在为作物根际的优势菌，限制了其它病原微生物的繁殖机会。同时有的微生物对病原微生物还具有拮抗作用，起到了减轻作物病害的功效。 三、我国微生物肥料的概况 我国微生物肥料的研究应用和国际上一样，是从豆科植物上应用根瘤菌接种剂开始的，起初只有大豆和花生根瘤菌剂：50年代，从原苏联引进自生固氮菌、磷细菌和硅酸盐细菌剂，称为细菌肥料：60年代又推广使用放线菌制成的“5406”抗生菌肥料和固氮蓝绿藻肥：70-80年代中期，又开始研究VA菌根，以改善植物磷素营养条件和提高水分利用率：80年代中期至90年代，农业生产中又相继应用联合固氮菌和生物钾肥作为拌种剂：近几年来又推广应用由固氮菌、磷细菌、钾细菌和有机肥复合制成的生物肥料做基肥施用。
(完整word版)微生物挑战性实验方法
微生物挑战性实验方法 1.0目的 新产品防腐效果的测试 2.0 范围 公司新产品 3.0参考： 4 材料与方法 4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6] 营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、 0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等 4. 2微生物挑战性实验 4. 2. 1受试用微生物 测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。 实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。 4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验 此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性 试验检测防腐剂效果的方法。称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。然后
充分混匀, 置于28℃下。在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。此实验用以评判防腐剂的有效与否。评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。 分析与检测 4. 2. 3重复3 次加菌的微生物挑战试验此方法参照国际CT FA（国际化妆品、香精和洗涤剂协会）推荐的微生物挑战性试验。称取受试样品30g , 每隔2 周加菌一次( 即实验的第1、3 和5 周) , 每次加细菌量为1 ×106 ～1 ×107个/ g 样品和霉菌1×105个/ g～1×106 个/ g 样品。在加菌后的0 天、7 天和14 天( 后一次加菌前) 采样分析样品中含菌量, 方法同前。此方法可将受检样品分为三类: ( 1)防腐效果优良( W) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 01% ( 即≤100 个/ g或ml）样品, 通过测试) 。 ( 2)防腐效果尚可( M ) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7 天或14 天时, 存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, ( 即≤1000 个/ g 或mL 样品, 通过测试) 。 ( 3)防腐效果差( P) , 即三次加菌后, 在每次加菌后的第7天或14 天时, 存活菌量>mL样品(不通过测试) 。 5、结果判断 受试样品一次加菌和3 次加菌后, 在检测时间内细菌和霉菌的抗腐能力见表1～4。根据两种方法评判标准, 将8 种防腐体系的防腐效果评判列于表5 。从结果看, 两种加菌方法对防腐体系的评判结果基本一致, 三次加菌还可对有效的防腐体系作出程度之区别: 防腐优良( W: We pr eser vative) 和防腐尚可( M :M ar gina preserv ative) 。此外, 在一次加菌后1～2 周内能将样品中含菌量降低至加入菌量的0. 1%, 可通过3 次加菌实验, 如防腐体系5 和8 对细菌
化妆品微生物挑战试验
化妆品微生物挑战试验 刘树葆臧跃扬桂菊 （天津化妆品科学技术研究皖有强公司） 摘要：本文参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法，研究了不同产品在相同防腐条件下，微生物挑战试验结果的差异性。 关键词：防腐体系，微生物挑战试验，膏霜，乳液，水剂。 目前，化妆品琳琅满目，产品配方复杂多样，通常包含多种成分，尤其许多化妆品中的营养成分非常适合微生物的生长，而微生物存在于我们生活着的世界的每一个角落，从而为化妆品的生产和保存带来困难。微生物污染将导致产品在气味、颜色、粘度、性能上都会发生改变。因此化妆品微生物污染对产品质量、正常使用以及使用者健康来说是一个极大的冒险“’。为防止微生物污染，就对产品的防腐提出了挑战，所以必须建立很好的防腐体系，以保证产品的安全、稳定性“’，为消费者提供安全和高品质的产品。 评价化妆品质量的～个重要指标就是微生物是否达到化妆品卫生规范的要求，本实验参照美国化妆品、盥洗用品和香精协会（ＣＴＦＡ）推荐的防腐体系效能评价方法。’，对相同防腐体系不同功能的膏霜、乳液及水剂产品进行微生物挑战试验，以指导配方师合理添加防腐剂。 １．实验方法 ｉ．Ｉ．ＣＴＦＡ推荐的防腐单次挑战试验 ＣＴＦＡ推荐的经典的为期２８天的防腐单次挑战实验，是将防腐剂混入配方基质中，然后～次性接入若干种类、～定数量的微生物进行挑战，将样品存放于适当的温度下，定期抽样检测其中残存的微生物，并根据微生物的数量变化情况评价样品的抗菌效果。 １．２试验仪器 恒温培养箱：霉菌培养箱：显微镜：灭菌平皿：直径为９ｃｍ；ｐＨ计；高压灭菌锅；酒精灯：锥形烧瓶；量筒：灭菌刻度吸管：ｌＯｍｌ、２ｍｌ、ｉｍｌ；试管。 Ｉ．３．培养基和试剂 生理盐水：ＳＣＤＬＰ液体培养基：卵磷脂、吐温８０一营养培养基：乳糖胆盐培养基：蛋白胨水：靛基质试剂：十六烷三甲基溴化铵培养基；绿脓菌素测定用培养基：硝酸盐蛋白胨水培养基：普通琼脂斜面培养基：血琼脂培养基；甘露醇发酵培养基：血浆：孟加拉红培养基。 ｌ＿４挑战用微生物 测试用菌种由天津市卫生防病中心提供，霉菌和杂菌由实验室从污染产品中分离到的菌珠。 菌种包括：金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌。 实验前，将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。Ｃ（细菌）和２８℃（霉菌）培养箱中培养。细菌培养４８小时，霉菌培养７２小时后，挑选典型的菌落于灭菌的液体培养基中制成～定浓度的细菌和霉菌混合悬液，置于冰箱冷藏备用。 １．５待测样品 选择了８种化妆品基质，其中膏霜２种、乳液２种、水剂２种。按相同的防腐体系常规方法加入基质中，在进行微生物挑战性实验前预先进行细菌总数及霉菌和酵母菌的测定，试验样品的菌落数均应小于１０，作为待测样品。 １．６接种的方式和数量 接种的方式：采用混合接种。因为自然界的微生物有混生杂居的特点，所以混合接种符合实际污染的情况。 接种的数量：将各菌种接种于合适的培养基中，于３７。Ｃ（细菌）和２８。Ｃ（霉菌培养箱中培养。
微生物学实验
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
微生物菌肥自我介绍
我是微生物菌肥，我的功能大家应该进一步了解，我对土壤有修复功能，对作物病害有预防、缓解功能，并对连茬种植作物根系有很好的保护作用。下面我给你介绍我的功能特点。 1）微生物菌：能够杀灭粪便中的病毒、病菌、虫卵、杂草种子等，有效遏制土壤中的病虫 害发生，减少农药用量。无异臭味，不烧根苗。 （2）改良土壤、利于吸收：增加土壤有益微生物活动，使其产生生物调节物质刺激根系生长和促进养分吸收，有效的提高营养物质的吸收利用率。施入土壤后，能保持土壤良好的团粒结构，其中的有机质和生物活性菌，能刺激作物体内各种酶的活性，加快作物的生长，减少病害，改善农作物产品品质. （3）缓速增效，增产增收：活化土壤，改善土壤板结和养分流失，提高土壤通透性和可耕性，疏松土壤，增加土壤含水量，减少养分吸收阻力，促进营养物质向作物的根际转移。增强抗旱能力。 （4）培肥地力，均衡营养：增强地力，提高肥料利用率，较高的有机质及腐殖质含量，能提高根际阳离子交换量，提高根际环境的缓冲能力。促进作物新陈代谢，改善品质，增强抗病能力，减少农药的使用量。均衡供应作物所需各种养分，提高肥料利用率，避免长期施用单质化肥引起的土壤营养失调，恢复土壤生命力。 （5）成本低：标美力克肥业有限公司研制的微生物菌肥，最大的特点是活菌包膜技术，让微生物菌在土壤内具备最大的繁殖条件，使用量比较小，防治效果而且很高，亩只需投入几 十元钱就，就能达到理想肥沃的土壤，提高作物产量，增加收入。 炭神奇 微生物菌肥 活菌包膜、疏松土壤、生根壮苗 调节土壤碳氮比、抗病增产 净含量：40公斤 主要功能： 1、有机碳复合微生物菌肥，培养微生物菌的繁殖，抑制土壤有害病菌，效果迅速，增强土壤、种子、根系抗病菌能力 2、改善土壤团粒结构，调节土壤碳氮比，平衡酸碱度，培肥土壤。固氮、解磷、解钾，减少20%大化肥施用量，增产增收。 3、增加土壤有机碳，控释氮肥，增效磷钾，螯合微量元素，维持营养均衡，刺激作物根系生长，增强抗病抗旱抗寒能力。 4、炭神奇在土壤内、根系周围分泌抗病菌和酶，保护根系，促进果实提早成熟，提高商品率。 使用方法： 基施：推荐亩施40-125公斤；追施、冲施：亩用量50-100公斤，与大化肥一起使用。（根据土壤状况增减使用量） 适用范围：各种果树、瓜果蔬菜、大田作物
细菌截留验证指导程序
细菌截留验证程序和方案形成 应使用标准方法确证膜过滤器的微生物截留能力。然而，对于某种产品来说，仅证明缺陷假单胞菌在水溶液中被截留，而不是在特定产品中，不足以验证此产品的除菌过滤工艺。 为了确定正确的挑战测试方法，应将测试微生物直接接种在承载流体（产品或替代品）中以证明其生存性。微生物应以与挑战实验中使用的同等方式培养，以保留其生物形态特征和生理特征。用于生存性研究的测试暴露时间应该等于或超过实际工艺过滤时间。 当测试微生物在产品中的生存性已经完成测试，就应该形成挑战方法和方案了。细菌挑战实验的条件应模拟实际生产工艺。既然细菌挑战实验通常都在实验室里进行，那么方法的规模也应相应调整。通量应调整到每单位面积的流速，表示为基于滤芯表面积的形式(ml/min)/cm2。如果过滤过程按压差控制，则挑战实验压差至少等同于最大工艺压差。如果制订方案过程中遇到关于测试方法可接受性的问题，则建议联系相关管理机构以获取指导。图1列出了在为特定过滤器和产品/工艺组合选择合适的验证策略时需要考虑的关键步骤。 （1）非杀菌性的工艺和流体 直接在产品中接种测试微生物是测试除菌级过滤器微生物截留能力的首 选方法。当产品和工艺流体被证明在产品和工艺条件下没有杀菌效力的时候，这样是可行的。在这些工艺中，应使用足够浓度的挑战微生物在产品中接种，而且要在实际工艺条件下，包括时间、压差、流速和其它关键变量（例如温度），应尽量减少稀释，以避免不必要的产品改变。 （2）抑菌的/杀菌的/非分散的挑战流体 在杀菌性的产品中进行细菌截留测试，使得与验证相关的一些问题更难回答，例如：产品对过滤器有什么影响，产品对其中的生物菌落有什么影响。在杀菌性产品中或是在不利于微生物活性的条件（例如，温度上升）下进行的细菌截留测试不一定能得到正确的结果。 为了评估产品/工艺对过滤器的潜在影响，可以使用产品和实际的工艺条件，包括流速、压差、温度和时间，对过滤器进行预处理。这种预处理可在一个闭路系统中将产品循环通过测试过滤器或者单路通过测试过滤器，接着对滤
微生物菌肥报告
生物菌肥的研究现状及进展 1.生物菌肥简介 生物菌肥又称微生物肥料。它是一种含有活体微生物,通过其生命活动增加植物营养元素的供应量,有的还能产生植物生长激素或抑制有害微生物的活体制品。微生物菌肥的作用机理主要表现为微生物肥料可以通过提高土壤供应营养元素的能力,改善植物营养条件,增 强根系活力,刺激植株生长,增加叶绿素含量和叶面积,减少呼吸作用,最终使作物获得增产；其次是微生物在生长、繁殖过程中所生成的植物激素,通过激素作用,使作物根系活力增强,光合作用效率提高,使作物获得充分的营养成分,最终提高产量。促成作物增产的另一因素 是通过改善作物的营养环境和释放的激素能够增强植物抗逆性,对植物病虫害也具有一定 的抑制作用,从而降低了产量损失。 2.生物菌肥的特点 生物菌肥作为一种生物产品,其与化学肥料相比具有如下几个特点： (1)不破坏土壤结构，不污染环境,且对人畜无害； (2)改善土壤肥力，肥效持久； (3)能促进某些作物的生长，增加产量，改善农产品的品质； (4)大多数生物菌肥原料多为废弃物、果渣、垃圾等。易于获取,变废为宝"而且配套生 产设备的要求不高，成本较低； (5)其使用效果要受到环境条件(如营养、水分、温度、pH等)的影响；当前由于生产技 术不够成熟，产品质量不高以及具体作用机制仍不十分清楚等原因，我国在生物菌 肥领域仍仅处于一个尝试性阶段，真正投入到大田生产应用的生物菌肥并不多，但 其已受到了许多农业生物专家的关注。 3.国内目前生物菌肥的发展现状 我国微生物肥料的研究和应用始于根瘤菌接种剂，近十年进入了稳定发展期。伴随着 菌种、剂型的不断开发，产业规模不断扩大，生产和检测标准体系不断完善。 近年来，随着对微生物类群的不断研究，微生物肥料所采用的菌种种类不断扩大。目 前所使用的菌种已达到110多种，包括细菌、真菌、放线菌及蓝藻等。菌种的开发直接促 进了新型微生物肥料种类的产生。据统计，我国现有的微生物肥料产品主要包括：根瘤菌 制剂、自生及联合固氮菌类制剂、溶磷细菌制剂、溶磷真菌制剂、硅酸盐细菌制剂、促生 细（真）菌制剂、光合细菌制剂、有机物料腐熟剂、土壤（水体）生物修复剂、放线菌制
微生物实验报告
微生物实验报告 一环境中的微生物的检测和分离纯化 实验目的： 1 学习并掌握无菌操作技术原理和方法 2 学习用稀释涂布法分离微生物 3 认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的原理 实验材料： 1 土样溶液0.5ml，无菌生理盐水 2 取液器(1000μL一支，100μL一支)，培养箱，培养皿(12个)，无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000μL无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架 实验步骤： A培养基的制备(已提前制备好) B周围环境中的微生物的检测，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上作如下实验 1 取三个平板，用100μL的取液器分别吸取100μL的河水、豆浆、豆奶，均匀加在三个培养基上，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。 2 再取三个平板，三个同学分别用手指(未洗过)在培养基上涂抹几秒钟，一个同学对应一个平板。 3 再取一个平板，其中一个同学将手用肥皂洗过后，再在培养基上涂抹。 4 再取一个平板，打开皿盖，一个同学对着培养基咳嗽，使口腔中的气流和飞沫落到培养基上。 5 再取一个平板，打开皿盖，在空气中放置10min左右，关上皿盖。 6 将上述9个平板放置在35℃的培养箱中培养24h。 C土壤中分离微生物 1 采土样，制备土壤稀释液(已准备好) 2 取三个平板，每个培养基上用取液器添加100μL的土壤稀释液，并用无菌玻璃涂棒涂布均匀(要多涂几次，时间约1-2分钟，使细菌均匀分布)。 3 将平板依旧放在35℃的培养箱中培养24h。 D菌落计数 培养24h后，取出培养平板，算出每个平板上的菌落数量。其中，土样中的微生物含量可用以下式子计算 土壤中的细菌含量(个/g土壤)=菌落平均数×10×稀释倍数 实验结果及数据： 实验结果如附图。
微生物方法学验证范本
编码：VP-C01-MM-01 XXXX软膏微生物限度检查 方法学验证方案 起草人：年月日 审核人：年月日 年月日 年月日 批准人：年月日 目录 1.验证立项表 2.验证内容 2.1验证目的 2.2验证范围 2.3 验证要求 2.4 验证方法 2.4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 2.4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容 2.4.3 金黄色葡萄球菌验证内容 2.4.4铜绿假单胞菌验证内容 3. 验证报告 验证立项表（REC） 立项题目 立项部门申请人
申请日期要求完成日期 验证类别负责部门 参与部门及人员 验证原因 质量部审核意见审核人：日期： 验证领导小组 审批人：日期：审批意见 备注 XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案 编码：VP-C01-MM-01品名验证依据2005版药典 规格验证日期年月日数量报告日期年月日验证项目细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌 1.验证目的XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。根据《中国药典》（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。 2.验证范围本公司XXXX软膏的微生物限度检测。
3.判定标准 3.1验证小组成员 姓名职务职责 组长负责验证方案、报告的批准 项目负责人负责验证方案、报告的起草与具体实施 验证小组成员负责验证试验及填写记录 3.2细菌、霉菌及酵母菌在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%，假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q，则0.7≤Q≤1.3。 3.3金黄色葡萄球菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。 3.4铜绿假单胞菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。 4.验证方法 4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 4.1.1试验样品：XXXX软膏三批，批号为、、。4.1.2稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。配法：照（05版药典附录XIII C）配制； 0.9%无菌氯化钠溶液的配制：取氯化钠9.0g，加1000ml使完全溶解，分装，灭菌。 4.1.3实验仪器：无菌培养皿（直径9.0cm）、净化室、灭菌锅、无菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴锅，试管（18×180）,具塞三角瓶。 4.1.4验证用培养基营养琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、玫瑰红钠培养基。 4.1.5验证用微生物名称及编号 菌珠名称传代次数 大肠埃希菌MCC(B)44102 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501
微生物学实验复习题及其答案
微生物学实验复习题 一、选择题 1.革兰氏染色的关键操作步骤是： A. 结晶紫染色 B. 碘液固定 C. 酒精脱色 D. 复染 2.放线菌印片染色的关键操作是： A. 印片时不能移动 B. 染色 C. 染色后不能吸干 D. A和C 3.高氏培养基用来培养： A. 细菌 B. 真菌 C. 放线菌 4.肉汤培养基用来培养: A. 酵母菌 B. 霉菌 C. 细菌 5.无氮培养基用来培养: A. 自生固氮菌。 B. 硅酸盐细菌 C. 根瘤菌 D. A、B 均可培养 E. A、B、C 均可培养 6.在使用显微镜油镜时，为了提高分辨力，通常在镜头和盖玻片之间滴加: A. 二甲苯 B. 水 C. 香柏油 7.常用的消毒酒精浓度为: A. 75% B. 50% C. 90% 8.用甲醛进行空气熏蒸消毒的用量是: A. 20ml/M3 B. 6ml/M3 C. 1ml/M3 9.实验室培养基高压蒸汽灭菌的工艺条件是: A. 121℃/30min B. 115℃/30min C. 130℃/30min
10.巴氏消毒的工艺条件是: A. 62-63℃/30min B. 71-72℃/15min C. A.B. 均可 11.半固体培养基的主要用途是: A. 检查细菌的运动性 B. 检查细菌的好氧性 C. A.B. 两项 12.半固体培养基的琼脂加入量通常是: A. 1% B. 0.5% C. 0.1% 13.使用手提式灭菌锅灭菌的关键操作是: A. 排冷气彻底 B. 保温时间适当 C. 灭菌完后排气不能太快 D. A-C 14.目镜头上的“K”字母表示: A. 广视野目镜 B. 惠更斯目镜 C. 补偿目镜 15.目镜头上的“P”字母表示: A. 平场目镜 B. 广视野目镜 C. 平场补偿目镜 16.物镜头上的“PL”字母表示: A.正低相差物镜 B.正高相差物镜 C.负高相差物镜 17.物镜头上的“UVFL”字母表示。 A. 无荧光物镜 B. 照相物镜 C. 相差物镜 18.镜头上标有“TC”字母的镜头是: A. 相差调整望远镜 B. 摄影目镜 C. 相差目镜 19. “PA”表示: A. 马铃薯培养基 B. 高氏培养基 C. 肉汤培养基 20.无菌室空气灭菌常用方法是: A. 甲醛熏蒸 B. 紫外灯照射
微生物菌肥的秘密原来在这里
微生物菌肥的秘密原来在这里 一般讲的微生物肥料，其实是一种菌剂，是一类微生物群体。这类微生物菌剂能够提供一种或多种对作物生长有益的微生物群落。由于农业上应用的微生物菌剂常常和草炭、泥炭、有机肥料等有机质含量较高的基质混合在一起，所以习惯上把微生物菌剂称为微生物肥料，人们俗称为“菌肥”- 沃宝生物科技。 微生物肥料的作用机理根本不同于化学肥料。能够提供一种微生物群落的叫“单一微生物肥料”或“专一微生物菌剂（肥料）”；能够提供两种以上多种微生物群落的叫“复合微生物菌剂（肥料）”。根据微生物的作用划分，可以将微生物菌剂划分为“固氮细菌（菌剂）”、“解磷细菌（菌剂）”、“解钾细菌（菌剂）”、“腐解细菌（菌剂）”等。这些微生物菌剂都可以选择性地为农业生产服务。 微生物肥料的作用主要是提供对作物生长有益的“微生物群落”，而不是“营养元素”。这些有益的微生物施到土壤中后，能产生各种不同作用。 1、以固氮细菌为主的微生物肥料能通过细菌的活动，固定空气中的氮元素，供作物生长时吸收利用——即“固氮”作用； 2、以解磷细菌为主的微生物肥料则通过细菌的活动，分解土壤中部分不能被作物吸收的磷元素，使磷从土壤中分解出来，供作物生长时吸收利用——即“解磷”作用； 3、以解钾细菌为主的微生物肥料主要作用是，通过细菌的活动，分解土壤中部分不能被作物吸收的钾元素，使钾从土壤中分解出来，供作物生长时吸收利用——即“解钾”作用。 同时，微生物在土壤中的生活、活动，可产生很多代谢产物或分泌物，这些分泌物对作物的生长有刺激作用。 总的来讲，微生物菌肥的作用就是细菌的固定、分解、分泌作用，影响到土壤中的营养养分的变化。土壤中营养养分变化了，生长在土壤中的作物的生长情况当然也要变化。 所以，微生物的作用是“作用”于土壤中、“反应”在作物上。如果土壤养分太低， 一、性菌剂 主要成分：固氮菌、解磷解钾菌 介绍： 产品所含的固氮菌定植土壤后产生大量固氮酶，可轻易地切断束缚氮分子的化学链，把氮分子变为能被植物消化、吸收的氮原子；所含的解磷解钾菌在生长代谢中会产生有机酸类物质，可将土壤中的长石、云母、磷灰石、磷矿粉等矿物的难溶性磷钾溶解出来为作物和菌体本身利用，菌体中富含的磷钾在菌死亡后又被作物吸收。除此以外，这些有益复合微生物还可释放土壤中原有的钙、镁、硅、
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第一部分防腐挑战实验调研结果 1实验样品 样本要求新鲜，没有被微生物污染，一般每个样本为300g。 2微生物挑战性实验 2.1 实验菌株 不同国家、组织、企业对挑战实验选择的测试菌种有一定差异（如表1），国内参照美国化妆品、香精和洗涤剂协会（CTFA ）推荐的菌种（因其较具代表性，如表 2 所示），所以更为恰当。（注意菌株来源问题：同属一个种的细菌来源不同，菌株不同，MIC 值不同）表 1 某些国家、组织、企业用于化妆品微生物挑战试验的测试菌株 美国美国英国德国德国菌株 (药典 ) (ISP 公司 ) (药典 ) (Henkel 公司 ) (S&M 公司 ) 白假丝酵母√√√√√ 黑曲霉√√√√√ 红色青霉√ 绿色木霉√ 绳状青霉√ 大肠埃希氏菌√√√√ 镉绿假单胞菌√√√√ 金黄色葡萄球菌√√√√√粪肠球菌√ 产气肠杆菌√ 表皮葡萄球菌√ 日勾维肠杆菌√ 洋葱假单胞菌√√
肺炎克雷伯氏菌√恶臭假单胞菌√荧光假单胞菌√ 表 2 CTFA 化妆品微生物挑战试验的菌株选择 种类菌株数量 金黄色葡萄球菌 革兰氏阳性菌至少选一种 表皮葡萄球菌 肺炎克雷伯氏菌 阴沟肠杆菌 发酵革兰氏阴性杆菌大肠埃希氏菌至少选两种 变形菌属 日勾维肠杆菌 铜绿假单胞菌 洋葱假单胞菌 荧光假单胞菌 非发酵革兰氏阴性杆菌至少选一种 恶臭假单胞菌 黄杆菌属 不动杆菌属 白假丝酵母 酵母至少选一种 近平滑假丝酵母 黑曲霉 霉菌至少选一种 黄绿青霉 产芽孢菌枯草芽孢杆菌供选用生产现场分离菌适当菌株一种以上
2.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基 2.3 试验用菌液的配置 （1）标准悬液的配制 1%硫酸 9.9ml 与 1%氯化钡 0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×108cfu/ml ，此悬液再做 3 倍稀释。 （2）细菌菌悬液的配制 实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36 摄氏度恒温培养48 小时。将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3× 108cfu/ml ）相同为止； 此时的稀释菌液再做 3 倍稀释，即为所需的 1×108cfu/ml 的菌悬液，做细菌 总数确定细菌数。 （3）霉菌菌悬液的配制 将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10 倍稀释，每次的稀释用血球计 数板计数，必须 5 个中格的霉菌总数在190～ 210，落在此范围内的菌悬液为我 们所需的 1×108cfu/ml 的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。 2.4 接种 2.4.1 接种方式 （1）单菌接种：每种测试菌株单独做一个挑战试验。这种方法的优点是容 易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考 价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自 然界的微生物常常不是单一的种类）。 （2）混合菌接种：西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了
微生物菌肥简介
微生物菌肥简介 微生物菌肥是根据土壤微生态学原理、植物营养学原理、以及现代“有机农业”的基本概念而研制出来的。微生物肥料是以微生物的生命活动导致作物得到特定肥料效应的一种制品，是农业生产中使用肥料的一种。其在我国已有近50年的历史，从根瘤菌剂——细菌肥料——微生物肥料，从名称上的演变已说明我国微生物肥料逐步发展的过程。 土壤主要由矿物质、有机质和微生物三大部分组成，土壤微生态区系的微生物的活性大小，对植物根部营养非常重要，因为土壤中的有益微生物直接参与土壤肥力的形成，包括土壤中物质和能量的转化、腐植质的形成和分解、养分的释放、氮素的固定等等。但纯自然状态下有益微生物数量不够，作用力也有限。因此，采用“人为方式”向土壤中增加有益微生物数量，就能够增强土壤中微生物的数量和整体活性，从而明显提高土壤的肥力。这就是施用沃益多菌肥可以提高土壤肥力、减少化肥用量的科学原理。 沃益多-a的两种土壤接种菌，是阿坤纳斯科研团队经过数年从繁杂的菌群种严格筛选出的优秀的土壤接种菌，应用固定化细细胞培养技术生产，阿坤纳斯拥有该菌种及生产技术的多项专利。 沃益多---HYT(High Yield Technology“高产技术” 产品)是源于美国，来自墨西哥，由挪威Agrinos AS 全球推广的高效微生物菌肥系列产品。 沃益多(HYT)是由美国生物学家团队，经过数年研究开发出的高活性土壤微生物菌种，在上世纪90年代开始推广应用，在过去20年中不断发展成熟。沃益多产品实现了生物学和土壤微生物技术上的重大突破。 以挪威海德鲁集团公司高级副总裁、世界肥料工业协会主席托雷 福·安格博士（Dr. Thorleif Enger ，Agrinos董事会主席）领衔的世界顶级肥料营销团队---挪威阿坤纳斯公司，整合了全球在肥料领域的研发、生产和推广的各路精英，包括美国微生物学家威廉霍·普金斯博士（Dr. William Hopkins，Agrinos研究及发展总监），在微生物应用方面有20多年实践经验并取得重要研究成果的卡尔·菲克先生（Karl Fick，Agrinos 技术总监），商界精英亚伦·帕沃斯先生（Aaron Powers，Agrinos公司CEO），在对沃益多(HYT)产品进行了数年跟踪研究，在世界各地获得了大量的实验数据，得到满意的增产效果之后，证实“沃益多”产品是集营养转换吸收、抑菌防病和改良土壤等功效为一体的高新技术产品，对应对全球气候变化，减少化肥用量,降低温室气体排放，提高农作物产量和品质具有重要意义。 挪威阿坤纳斯公司（AGRINOS AS）是从事生物技术研发、生产的跨国公司。公司通过全资收购、兼并美国专业生物技术公司，在美国、墨西哥和马来西亚投资建厂，使其迅速发展成为全球领先的生物技术企业。
微生物学实验报告.
微生物学实验报告 实验一普通光学显微镜的使用及细菌染色与形态观察 第一部分：显微镜的使用 一、目的要求 1．熟悉普通光学显微镜的构造、油镜的使用原理和显微镜的维护方法。 2．学会正确使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造。 3．了解各种显微镜的主要特征。 二、实验原理 （一）光学显微镜的构造 微生物实验室中最常用的是普通光学显微镜，它的构造可分为机械部分和光学部分。 1、机械部分 普通复式光学显微镜的机械部分通常包括以下几个部分：目镜、镜筒、基座回转器、物镜、载物台、光圈、聚光器、光源、镜臂、细调节器、粗调节器等。 2、光学部分：目镜、物镜、聚光器、光圈、光源。 （二）放大倍数 标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。 物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短，这时光圈就要打开得愈大。 显微镜的性能受物镜的分辨距离或分辨力所限制。分辨距离即透镜所能分辨的两个物点之间的最小距离，分辨距离愈小，透镜的分辨力愈高，物像也就愈清晰。因此常以分辨距离来衡量显微镜的分辨力。 R=0.61λ/N.A 式中：R-----分辨距离； λ------作用光的波长； N.A------数值口径。 一些介质的折射率
介质折射率 空气 水玻璃香柏油 1 13 55 1.56 三、实验内容 （一）材料：显微镜，香柏油，擦镜纸。 （二）方法： 细菌很小，须使用油镜方可观察到。油镜是显微镜上最重要的部件之一，观察时与玻片非常接近，稍不小心即可压碎玻片，更严重的是损坏镜头，故必须极其仔细地学习油镜的使用方法： 1、为使低倍镜取得最适之光源，可将低倍镜头调节到离载物台约1cm的高度，将聚光器提高，光圈完全打开，然后调节电压旋钮至视野最合适。 2、滴一滴香柏油，固定于载物台上，用推动器调节到载物台正中。在双目侧视下，下旋粗调节器，使油镜头浸入油中几乎与标本片相接触。然后眼睛从目镜观察（如光线不足，可适当增大电源电压），徐徐上旋粗调节器至看到模糊物像之后，再用细调节器调节以使物像清晰。如镜头已离开油面还未看到物像，则再重新操作。 3、更换标本时应先提高油镜头，再更换玻片，切勿随意移动显微镜的位置。 4、油镜观察完毕后，按“显微镜保护”中（6）项处理。 5、最后将油镜各部分还原，聚光器下降，反光镜垂直于镜座，镜头转成八字形， 以免与聚光器发生碰撞。 四、思考题 1、使用显微镜时为何调节下列构造？反光镜，光圈，聚光器，粗调节器，细调节器，镜头回转器。 答：聚光器的位置之升降可影响视野的明亮度，上升则视野明亮，下降则光线减弱。光圈的放大或缩小也可控制视野明亮程度。粗调节器和细调节器均是调节焦距的装置。镜头回转器为装置物镜和转换物镜之用。 2、使用不同放大倍数的物镜时，工作距离与光圈的关系。如何利用这一原理用好显微镜？ 答：物镜的放大倍数愈大，其工作距离（物镜镜头到标本片之间的距离）愈短。标本首先经物镜放大，在目镜的焦距平面上形成一个实像，再经过目镜放大成最终的虚像。总的放大倍数是物镜放大倍数与目镜放大倍数的乘积。 3、为何要选用与玻璃折射率相似的香柏油作为油镜的介质？油镜的原理是什么？ 答：香柏油只在使用油镜头时（100倍物镜）使用，因为当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n= 1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55μm。当使用数值孔径为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42μm；而使用数值孔径为1.25的