产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定

本科开放项目

题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定

学生姓名：指导教师：学院：专业班级：

2016年3月

产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定

摘要

纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。

关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株

目录

第1章绪论 (1)

1.1 实验原理 (1)

1.2 实验仪器及试剂 (2)

1.2.1 实验材料 (2)

1.2.2 实验仪器 (2)

1.2.3 培养基 (2)

第2章实验步骤 (3)

2.1 采样培养 (3)

2.2 初筛 (4)

2.3 复筛 (4)

2.4 酶活的测定 (4)

2.4.1原理 (4)

2.4.2溶液配制 (4)

2.4.3实验步骤 (5)

第3章实验结果 (7)

3.1 标准曲线的绘制 (7)

3.2 菌株复筛结果 (8)

3.3 测定纤维素酶活力结果 (9)

结束语 (10)

参考文献 (11)

第1章绪论

1.1 实验原理

自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：

1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx 酶、CMC酶、EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；

2.外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC

3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；

3.Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。

只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。

本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。

以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种；刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。

1.2 实验仪器及试剂

1.2.1 实验材料

土样取自湖南省长沙市岳麓山上、中南大学校本部草地15—20cm深处；

1.2.2 实验仪器

试管、烧杯、移液管、平板、锥形瓶、玻璃珠、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、高压灭菌锅等；

1.2.3 培养基

（1）培养基

A、纤维素富集培养基（1L）：NaCl 6g，MgSO4 0.1g，KH2PO4 0.5g，CaCl2 0.1g，

(NH4)SO4 2.0g，K2HPO4 2.0g，琼脂1.5%，CMC-Na 0.5%，pH调至7.0。

B、纤维素筛选培养基（1L）：在上述纤维素酶富集培养基中加入酵母粉1g。

C、马丁培养基：葡萄糖1g,蛋白胨0.5g，KH2PO4~3H2O0.1g，MgSO4~7H2O0.05g，

0.1%孟加拉红溶液0.33mL，琼脂1.5g，蒸馏水100mL，自然ph，2%去氧胆酸钠溶

液2mL（预先灭菌,临用前加入），；链霉素溶液10000u/mL 0.33mL（临用前加入）。

（2）溶液

A、刚果红染色液：用蒸馏水溶解刚果红,终浓度为0.1%(w/v)。

B、刚果红脱色液:终浓度为1mol/L的NaCl溶液。

第2章实验步骤

2.1 采样培养

（1）采样：在事先勘察好的取样地土壤15-20cm，取3个点采样；

（2）溶解：将3份土样各10g加入带有玻璃珠的锥形瓶并溶于无菌水中，在摇床上以200r/min振荡30min；

（3）富集：配制100m L 富集培养基中，加入250mL锥形瓶中，取生理盐水中振荡的土样溶液上清取5mL加入富集培养基中，30℃200r/min，培养24h；

（4）稀释：梯度稀释10-1mol/L、10-2 mol/L、10-3 mol/L、10-4 mol/L,10-5 mol/L、10-6 mol/L。

2.2 初筛

初筛：选取10-5mol/L、10-6mol/L两个浓度梯度各0.1mL分别做3个平行，涂布于纤维素富集培养基平板上，30℃恒温培养箱中培养2d。挑取生长良好的形态大小不同的菌落于纤维素液体富集培养基中30℃200r/min，培养24h。

2.3 复筛

（1）复筛：用接种针将分离到的菌株活化后点种于纤维素筛选培养基平板上,30℃恒温倒置培养2d。用0.1%刚果红染色液浸染再用1mol/LNaCl溶液脱色5min。若菌株产纤维素酶,则会在菌落周围出现清晰的透明圈,依据透明圈直径与菌落直径的比值大小选择产酶菌株

（2）将筛选获得的产纤维素酶的菌株接种到马丁培养基中，30℃培养4d,能在该培养基中生长良好的为真菌,不能生长的为细菌。

2.4 酶活的测定

2.4.1原理

纤维素经纤维素酶水解后生成的还原糖能将3，5-二硝基水杨酸(DNS)中的硝基还原为氨基，生成棕红色的氨基化合物。在一定的浓度范围内,还原糖的量与棕红色的深浅呈正比关系。可用比色法测定。

2.4.2溶液配制

（1）CMC-Na底物溶液的配制浓度1% 热水煮ph 4.5

（2）DNS的配制总量为250ml配方

称取3，5-二硝基水杨酸(2.5±0.1 g)，置于约150mL水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，在再依次加入酒石酸钾钠50g、苯酚(重蒸)0.5g和无水硫酸钠1.25g，待全部溶解澄清后，冷却至室温，用水定容至250mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。

但是一定要注意，3，5-二硝基水杨酸和NaOH的加入时间一定要很近，或者是先加入NaOH。否则会产生难溶的沉淀，导致配制溶液失败。且配置过程中，溶液加热温度不宜超过50摄氏度。

（3）3.200mL 0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液ph 4.5

（4）酶活定义1mL液体酶在指定温度50 ，pH=4.5，每分钟水解CMC-Na底物，产生相当于1μg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以ug/mL*min表示。简写为CMC-Na。

2.4.3实验步骤

（1）绘制葡萄糖标准曲线葡萄糖标准液浓度10mg/mL

A、向25mL容量瓶中按下表加入相应体积的葡萄糖储液。

B、取0.5mL各个浓度的葡萄糖标准溶液，再加入3mL DNS试剂混匀，沸水浴10min

后终止反应，定容至25mL，在540nm处测定吸光度。每管取3个平行样。

C、所得平行吸光度取均值，对应葡萄糖标准液浓度，吸光度为横坐标，葡萄糖质量

为纵坐标作图，作线性拟合，得到葡萄糖标准曲线。

（2）空白管的测定：同DNS法，将0.5mL酶液改成0.5mL缓冲液

（3）制备粗酶液

A、取发酵液1mL 8000r/min 常温离心10min，取上清液为粗酶液；

B、取粗酶液依次稀释至10-1mol/L、10-2 mol/L、10-3 mol/L。

（4）DNS法测酶活力

参照DNS法，取0.5mL稀释后的酶液，加入到2mL的CMC-Na底物缓冲液溶液。50℃水浴反应30min后，立即加入3mLDNS试剂混匀，沸水浴10min后终止反应，冷却后定容至25mL。在540nm处测定吸光度，以空白作为对照调零值，每管取三个平行样。

第3章实验结果3.1 标准曲线的绘制

3.2 菌株复筛结果

3.3 测定纤维素酶活力结果

复筛之后测定酶活没有得到预想的结果，分析原因如下：

（1）复筛挑选的菌株不准确，培养得到的菌株不是产纤维素酶的菌株；（2）取样地点有限，取样地菌落可能不符合实验要求；

（3）稀释梯度太大，富集之后得到的菌株太少；

（4）操作过程中无菌不是很严格，可能发生了染菌。

结束语

地球上每年生产超过5000亿吨的纤维素，因而纤维素是储藏极为丰富的资源。它的生产对人类生存环境和可持续发展有着举足轻重的影响。纤维素酶的微生物的发酵研究主要为菌种的选育以及工艺优化两方面。实验室规模的纤维素酶生产的研究主要集中于原料预处理和发酵过程。纤维素酶的生产主要存在酶活力和产酶量不足的问题，运用各种科学方法提高纤维素酶的活力和产量已成为科学研究的重要方面。当前纤维素酶研究的一个重要课题就是选育新菌株以提高纤维素酶的产量和质量从而达到工业化生产

的要求。万事开头难，第一次实验报告也是如此，实验原理论述长，实验数据处理麻烦，课后思考题做着纠结，牢骚也发了，但还是耐着性子一项一项的完成了。慢慢地也就没有了那种排斥感，更多的是当做一种习惯，当作实验后的一种总结——把实验时得到的一些简单数字变成说服人的道理。

这次实验对我而言并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底

地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。

我明白了实践远远高于理论的道理，很感谢学校老师给了我们这么好的机会，能让我们及时地把生物课堂上学习的理论结合上实践。我也渐渐掌握了用已学的知识去处理数据，制作合适的表格，并用自己的语言去总结。不再是高中时看老师做实验，被动地记录数据，得出结论。在这样的课上，我感受到的是我们每个人都是主体，我们要靠自己课前的预习知识和基础知识，要靠自己的思考和探究。因此我们学会了做好课前预习，锻炼了思考的灵性和深度。当然另一方面，我还深深感到自己动手能力的不足，有些实验做着总感觉没别的同学来得快，可能还是练得少的缘故。孰能生巧，我相信通过不断的练习，实验会进行得更加顺利。

参考文献

[1] 梅玉峰.纤维素酶产生菌的选育[J]吉林农业，2005，28（1）：64-67

[2]张壮志.高效纤维素分解菌的筛选、鉴定及其生长条件和产酶活性的研究[D].山东农业大学硕士学

位论文,2009.

[3]韩立荣，张双玺，祝传书，张兴.高效纤维素降解真菌的筛选和鉴定[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2008,0~174.

[4]汪金萍,徐尔尼,史立康等.高产纤维素酶生产方法的研究[J].食品科技,2007(2)：73~76.

[5]Wang J P,Xu E N,Shi L Ket a1．Study on the method of increasing cellulose production[J]．Food Science and Technology,2007(2):73-76．(in Chinese)

[6]朱玉玺.纤维素优良降解菌的筛选分离及其特性研究[D].西安建筑科技大学硕士学位论

文.2005,5~8.

[7]Woodward J,M．Lirna'M,Lee,Biochem.J.1988,255:898-899.

实验一腐乳产蛋白酶菌株的筛选1

实验一腐乳产蛋白酶菌株的分离 一、实验目的与要求 了解涂布分离和平板划线法从食物中分离食源性微生物的原理和方法，并熟练掌握该操作方法。 二、实验原理 微生物是蛋白酶的最佳来源，与动物和植物相比，微生物作为蛋白酶的来源具 有更多生理生化上的优越性。微生物来源的蛋白酶都是胞外酶，易于分离纯化，更 重要的是微生物易于培养和发酵，有广泛的生物化学多样性和遗传操作的感受性。 通过稀释涂布法或划线分离法在选择性平板上可以对产蛋白酶菌株进行分离。 稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养 而进行微生物分离纯化的方法；平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一 微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较 多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分 离微生物的“纯种”。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分 离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 根据透明圈的大小来筛选目的菌株，透明圈越大的菌具有较强的产酶能力。对分离到的菌株进行纯化，得到高产蛋白酶菌株。 三、试验材料 1、材料与试剂 豆腐乳：市购豆腐乳 2、主要仪器与设备 无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅、振荡培养箱 四、实验步骤与方法 1、培养基的制备 可溶性淀粉1%、酵母膏0.5%、酪蛋白1%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、琼脂2.0%，pH值为中性 配制方法：称取酪蛋白 1.0g，先用少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量 的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH，灭菌备用。 2、菌株纯化分离（涂布法和划线法每组选一种方法进行操作） （1）稀释法分离：采用无菌水，10倍梯度稀释豆腐乳的菌悬液到10-8，吸取

从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤

从土壤中分离产几丁质酶的真菌 作者：王春学号:11101680 摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株. 1 材料与方法 1.1 培养基 1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7. 2.(2)纯几丁质培养基:胶体 几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂 1.2 菌株的分离 1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h. 1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养. 1.3 菌种的鉴定 1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r?min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用. 1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’. 1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水1 2.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol?L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol?L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol?L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU?L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min. 1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果. 1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到

微生物综合试验——产淀粉酶细菌菌株的筛选和培育

产淀粉酶细菌菌株的筛选和选育 邢大鹏 （合肥工业大学生物与食品工程学院2008级食品科学与工程专业08-1班） 摘要：从合肥工业大学校园内的土壤中筛选到一株产淀粉酶的细菌菌株。形态及生理生化特征测定结果表明，菌株与芽孢杆菌属(Bacillaceae)中的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCohn)种的特征基本一致。然后利用划线分离法和富集培养制备一定量的枯草芽孢杆菌，最后利用DNS法测定其产酶活力。 关键词：淀粉酶，产酶，细菌，枯草芽孢杆菌 Amylase production screening and selection of bacteria strains Xing Dapeng Abstract: From the Hefei University of Technology campus in the A strain of soil amylase producing bacteria strains. Morphological, physiological and biochemical characteristics of test showed that, strains and Bacillus (Bacillaceae) in Bacillus subtilis (BacillussubtilisCohn) basically the same kinds of characteristics. Then use the train crossed separation and enrichment of preparation of certain bacillus subtilis, finally, using the DNS method for determining the enzyme production vigor. Key words: amylase, enzyme production, bacteria,Bacillus,stubtilis. 芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。 1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。

蛋白酶产生菌的筛选复习课程

蛋白酶产生菌的筛选

蛋白酶产生菌的筛选 组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌

二、实验内容 蛋白酶产生菌的分离 三、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、 45mL无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、 摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌 移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏 斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜 纸。

五、操作步骤 （一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试 管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细 菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉 膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养 24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透 明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否 为芽孢杆菌。 （三）筛选

测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案

DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案 目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。 目前实验室采用测酶活方法： 1、葡萄糖标准曲线制作： 530nm比色。 2、酶活测定方法：

考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。 单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000 1 )/(???=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug. 以下是近期所做的实验结果： 葡萄糖标准曲线 两种产纤维素酶细菌不同测试结果

测定结果 实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。 根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。 刚果红染色法：常用的刚果红染色法有两种， 一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板 时就加入刚果红。方法一在长出茵落的培养基上，覆盖质量浓度为1 mg ／mI。的CR溶液，10～15 min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为l mol／I。的NaCI溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的 茵落周围将会出现透明圈。 方法二配制质量浓度为10 mg／mI。的CR溶液，灭菌后，按照每200 mI。培养基加入1 mI。的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长 出茵落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。 两种刚果红染色法的比较刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经 有超过20年的历史，课本中给出了两种方法。 方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间 发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。 方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于在纤维素 粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出

高效产纤维素酶菌株ZJW-6发酵条件优化

高效产纤维素酶菌株ZJW-6发酵条件优化 摘要:在筛选出纤维素酶高产菌株的基础上,对纤维素酶高产菌株ZJW-6采用单因素试验进行不同条件下的液体发酵培养,使用DNS法对发酵后的菌悬液进行酶活力测定从而获得其最优发酵条件?结果表明,菌株ZJW-6产纤维素酶的最优发酵条件是以蛋白胨+(NH4)2SO4为氮源培养基,在30 ℃?pH 6下振荡培养48 h? 关键词:纤维素分解菌;发酵条件;纤维素酶;酶活力 Research on the Optimum Fermentation Conditions of High-Yield Cellulolytic Enzymes Strain ZJW-6 Abstract: The optimum fermentation conditions of high-yield cellulolytic enzymes strain ZJW-6 were studied in this paper. The strain was cultured under different liquid fermentation conditions and enzymes activity of bacteria suspension was determined using DNS method. The results showed that the optimum fermentation conditions of ZJW-6 was as follows: peptone and (NH4)2SO4 as nitrogen source, shaking for 48h at 30℃ and pH 6. Key words: cellulose-decomposing microorganisms; fermentation conditions; cellulose; enzyme activity 纤维素酶是指能降解纤维素生成纤维素二糖和葡萄糖等小分子物质的一组酶的总称?随着人们对纤维素酶研究的深入,纤维素酶在食品?饲料?环境保护?能源和资源开发等各个领域中发挥着越来越大的作用,因而引起了全世界的关注,其研究也取得了很大进展?但是纤维素酶的生产仍然存在着酶活力低?生产周期长等问题,大大限制了其大规模工业化生产[1]?对高产纤维素酶菌株ZJW-6采用单因素试验法进行不同条件下的液体发酵培养,使用DNS法对发酵后的菌悬液进行酶活力测定从而获得最优发酵条件,旨在为其工业化发酵生产打下基础? 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种菌种为邢台学院生物化学系微生物实验室筛选并保存的产纤维素酶菌株? 1.1.2 培养基液体培养基:羧甲基纤维素钠10.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,磷酸二氢钾1.0 g/L,硫酸铵0.2 g/L,氯化钠10.0 g/L,去离子水1 000 mL,pH 7.0[2]?

实验十一 产蛋白酶菌株的筛选-2013

实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013 实验十一产蛋白酶菌株的筛选 碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一、基本原理 , 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。 , 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 , 碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 , 原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋 白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶 活大小。 二、实验目的 , 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 , 学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术

, 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三、实验器材 1(菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2(溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，NaCO，Folin 试剂，硼砂，23 酪氨酸，水等 3(仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四、操作步骤 1. 培养基和试剂的配制 (1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 (2)发酵培养基:玉米粉4%，黄豆饼粉3%，NaHPO 0.4%，KHPO 0.03%，3 mol/l NaOH 调节2424 pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 (3)pH11硼砂- NaOH缓冲液:硼砂19.08克溶于1000ml水中;NaOH 4g，溶于1000 ml水中，二液等量混合。 (4)2%酪蛋白:称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4?冰箱中保存，使用期不超过一周。 2. 酶活标准曲线的制作

从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤

从土壤中分离产几丁质酶的真菌 摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株. 1材料与方法 1.1培养基 1.1.1平板培养基(1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7. 2.(2)纯几丁质培养基:胶体 几丁质5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2摇瓶培养基(1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂 1.2菌株的分离 1.2.1菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h. 1.2.2菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养. 1.3菌种的鉴定 1.3.1细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r?min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用. 1.3.216SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’. 1.3.3聚合酶链反应(PCR)检测PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水1 2.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol?L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol?L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol?L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU?L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min. 1.3.4扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果. 1.3.5序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到

蛋白酶产生菌的筛选

蛋白酶产生菌的筛选 组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌

二、实验内容 蛋白酶产生菌的分离 三、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL 无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇 床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液 管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂 瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。 五、操作步骤

（一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试 管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉 膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明 的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 （三）筛选 1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。

高产纤维素酶菌株的诱变育种

湖南农业大学课程论文 学院：生物科学技术学院班级： 姓名：学号： 课程论文题目：纤维素酶高产菌株的诱变育种 课程名称：工业微生物育种学 评阅成绩： 评阅意见： 成绩评定教师签名： 日期：年月日

纤维素酶高产菌株的诱变育种 ( ) 【摘要】纤维素酶是一种重要的工业酶制剂，是一种复合酶，它将纤维素及类似物水解成葡萄糖。近年来，对产纤维素酶菌株的鉴定、诱变育种、筛选等方面取得了长足的进展。本文对这些研究进展进行了归纳和总结. 【关键词】产纤维素酶菌株；纤维素酶；筛选；诱变育种 Mutation Breeding of Cellulase High-yield Strain TAO Mi-lin (College of Biological Science and Technology, Hunan Agriculture University, Hunan 410128) 【Abstract】Cellulase is a kind of complex enzyme. Due to the ability of hydrolyzing cellulose or the similarity of cellulose into glucose. A great effort has been made until now on the research such as identification, mutation breeding and filter of cellulose-producing strain. This paper focused a brief induction and summary on advancing about these aspects. 【Key words】cellulose-producing strain ; cellulase ; filter ; mutation breeding 随着石化燃料由短缺变枯竭，能源是人类面临的共同问题。寻找新的能量来源关系到经济的可持续发展乃至人类的生存问题。纤维素与石化燃料不同，它是一种可再生的资源。地球上每年光合作用可产生大于100亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素。另外，人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素，如农业废物( 稻草、稻壳、麦杆、花生壳、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等)、食品加工废物(果皮、果渣等)、木材废物(木屑、树皮)以及城市废弃物(40%~60% 固体废物是垃圾和废纸)等。如果能有效地利用生物转化技术将这些纤维素转化成简单糖，再发酵产生乙醇等能源物质，不仅可以变废为宝，而且还可以避免由于化石燃料燃烧所带来的环境污染，更重要的是可以缓解或解决石化能源短缺乃至枯竭所带来世界性能源危机。纤维素酶的特异性高，反应条件比较温和，可避免化学转化所导致的环境污染等，是将这些纤维素物质转化成简单糖的关键。因此，在再生能源利用方面具有很广阔的应用前景。另外，自然界中细菌、真菌、某些无脊椎动物，直至高等植物中都有纤维素酶的存在，因此，纤维素酶的研究还具有普遍的生态意义。 1、纤维素酶 纤维素酶最早由Seilliere于1906年研究发现，我国约从20世纪70年代开始纤维素酶的研究，且已被正式批准为饲料添加剂在动物生产中应用。 1.1 纤维素酶的结构 不同来源的纤维素酶理化性质不相同，纤维素酶分子一般由球状的催化结构域(CD)、连接桥(Linker)和纤维素结合结构域(CBD)3部分组成。纤维素酶是由葡聚糖内切酶(endo-1,4-β-D-glucanases，EC3.2.1.4，简称EG)、葡聚糖外切酶

产蛋白酶乳酸菌的筛选【开题报告】

毕业论文开题报告 食品科学与工程 产蛋白酶乳酸菌的筛选 一、选题的背景与意义 乳酸菌（lactic acid bacteria,LAB)指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。相当多的乳酸菌是益生菌，是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前，随着人们生活水平的不断提高，乳酸菌在农业、医学、兽医以及食品工业等方面发挥越来越重要的作用。 乳酸菌蛋白酶的主要作用：第一，分解蛋白质分子产生多肽、氨基酸，利于宿主的消化吸收；第二，利于分解牛乳生成的乳酸增加胃内酸度提高胃蛋白酶的活性，利于胃肠道内乳酸菌等有益菌的生长；第三，借助蛋白酶敏感机制，促进损伤的肠黏膜上皮修复，防止致病菌在肠上皮细胞间移位。因此，乳酸菌蛋白质水解能力是影响乳酸菌益生作用的重要因素和开发含有乳酸菌的乳制品时，筛选性质优良，稳定性强的工业生产菌株的重要指标。但目前关于乳酸菌代谢产物的研究报道却很少，尤其是关于产蛋白酶乳酸菌的研究报道只有寥寥几篇。产蛋白酶乳酸菌的筛选工作还远未涉及到所有乳酸菌，还具有很大的发展空间。通过对乳酸菌产蛋白酶能力进行筛选可以为乳酸菌开发利用过程中筛选出品质优良、性质稳定的乳酸菌菌种提供依据；可以为蛋白酶的生产提供依据；可以为鲳鱼饲料的生产提供依据……总之，产蛋白酶乳酸菌的筛选可以为我国乳酸菌相关行业提供有力的支持，会大大促进我国乳酸菌相关行业发展。 二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： 1、研究基本内容 ①从泡菜、酸奶、豆腐乳等实验材料中分离纯化乳酸菌； ②将分离出的乳酸菌进行增值培养； ③对增值培养的乳酸菌进行产蛋白能力测定，筛选出产蛋白能力最强的乳 酸菌菌种； ④菌种鉴定。 2、拟解决的主要问题 ①乳酸菌菌种的来源； ②菌种鉴定方法。 三、研究的方法与技术路线：

产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定模板

本科开放项目 题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 学生姓名： 指导教师： 学院： 专业班级： 2016年3月

产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定 摘要 纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。 关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株

目录 第1章绪论 (1) 1.1 实验原理 (1) 1.2 实验仪器及试剂 (1) 1.2.1 实验材料 (1) 1.2.2 实验仪器 (1) 1.2.3 培养基 (2) 第2章实验步骤 (3) 2.1 采样培养 (3) 2.2 初筛 (3) 2.3 复筛 (3) 2.4 酶活的测定 (3) 2.4.1原理 (3) 2.4.2溶液配制 (3) 2.4.3实验步骤 (4) 第3章实验结果 (6) 3.1 标准曲线的绘制 (6) 3.2 菌株复筛结果 (6) 3.3 测定纤维素酶活力结果 (7) 结束语 (8) 参考文献 (9)

从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案解析

土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

土壤纤维素酶活性测定(3,5- 二硝基水杨酸比色法)

土壤纤维素酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸比色法） 一、原理 纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。纤维素酶解所生成的还原糖与?3,5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可 用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。 二、试剂 1）甲苯 2）1%羧甲基纤维素溶液：1g羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。 3）pH5.5醋酸盐缓冲液： 0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L； 0.2mol/L醋酸钠溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至1L； 取11ml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀即成PH5.5醋酸盐缓冲液。4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml2mol/LNaOH和125ml 水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天）。 5）葡萄糖标准液（1mg/mL） 预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。 若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。 三、操作步骤 葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，

产纤维素酶细菌的筛选及培养

产纤维素酶细菌的筛选及培养 一、筛选步骤 1、菌种的采集 采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40g左右，用研钵研成粉末称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，加入99mL无菌水摇匀静置。 2、菌种初筛 （1）按照配方配制200mL CMC培养基，取1 X 250mL空锥形瓶和6 X 15mL试管，塞上棉塞并用报纸、棉线包扎，用报纸、棉线将试管包扎成一捆；取12套培养皿码齐包扎。将上述器材与培养基、无菌水121℃高压蒸汽灭菌20min。 （2）于无菌台上倒9个CMC培养基备用。 （3）另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液（上清液）加入1号试管，加无菌水。混匀后吸取加入2号试管，重复上述操作，进行6次梯度稀释。 （4）待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106倍稀释液于CMC 培养基上稀释涂布，每种稀释液涂布三份。 （5）将上述培养基置于37℃培养箱中培养24小时，标记菌落并记录各菌落形态（菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理等）。 （6）配制200mL刚果红家别培养基，与三套培养皿一起121℃灭菌20min。 （7）在无菌操作台上倒3个鉴别培养基备用。 （8）将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，37℃培养24h，挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛。 3、菌种复筛 （1）配制500mL基础发酵培养基，分装到5只250mL的锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。

（2）将初筛得到的菌株用接种环接种于液体培养基上（2环），37℃、150r/min 下培养2—3天，转入4℃冰箱保藏。 二、培养方法 1清洗实验器具 2灭菌 3配培养基（纤维素作唯一能量源的培养基） 4倒平板 +选择培养原菌（可能会用摇床） 5稀释菌样 6涂布平板或平板划线 7放入恒温箱（调制均适宜的温度）12-24h ，之后就可以收获细菌了 8观察记录（数量、分布等） 三、培养基种类及其组成 1、初筛 CMC培养基：CMC 5g、蛋白胨 1 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、NaCl 0.25 g、琼脂粉10g 于1000mL锥形瓶中加蒸馏水至500mL、调节pH 7．2～7．6，加棉塞121℃灭菌20min。 刚果红培养基： (NH4)2S04 2 g，MgS04·7H20 0.5 g，K2HP04 1 g，NaCl 0.5 g，微晶纤维素2 g，刚果红0.4 g，琼脂20 g，加水至1000 mL。 无菌水：取1只1000mL的锥形瓶，各加水1000mL，加棉塞与CMC培养基一起灭菌20 min。另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用。 2、复筛 基础发酵培养基：羧甲基纤维素钠10g，蛋白胨10g，KH2PO419，MgSO4 0．29，Nacl 10g水1000mL，pH调至7，121℃灭菌20min

产淀粉酶菌株筛选综述

微生物与转基因技术 摘要微生物目前已是生物技术领域主要的模式生物之一，微生物可以为转基因技术提供工具酶、基因载体；微生物本身也常作为目的基因的受体细胞。通过转基因的方式，可以将人类所需要的基因转移到特定物种上，从而表达出人类想要的性状。本文综述了转基因微生物在食品、农业、医药以及环境保护、传统工业改造等领域研究与应用的国内外现状。在食品生产领域，转基目微生物主要用于食品用群制剂的生产，如凝乳酶．淀粉酶，蛋白酶等，转基因酵母也应用于啤酒的生产．在农业生产领域，转基因微生物主要用于微生物农药、微生物肥料和饲料酶制剂的生产．在医药生产领域，转基因微生物主要用于兽用和人用疫苗的生产，以及利用转基因镟生物生产某些药物。此外，转基因微生物在环境保护，传统工业的改造、印染业，以及新能薄开发等方面也有应用，本文也同样大致介绍了一些目前国内外关于微生物转基因方面的前沿研究。 关键词微生物转基因，DNA重组技术，目的基因，基因载体 1引言 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段[1]的来源可以是提取 特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。1980年代以来，现代生物技术迅速发展，在医药、农业、食品、化工、环境和能源等领域发挥了巨大的经济效益和社会效益。自1982年美国FDA批准了世界上第一例基因工程药物重组人胰岛素的正式生产以来，以基因工程药物为主的各种基因工程产品陆续实现商品化生产。其中，转基因微生物是基因工程产品的重要组成部分，在农业生产、食品加工、医药生产以及环境保护等领域得到了广泛的应用。 2微生物与转基因技术 1.微生物与转基因工具酶 转基因技术中，需要一些基本的工具酶，如对供体生物的DNA进行切割以获得目的基因的限制性核酸内切酶、DNA聚合酶类、DNA连接酶、核酸外切酶、反转录酶等。 DNA聚合酶类包括DNA聚合酶Ⅰ、KlenowDNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶等。耐热DNA聚合酶是一类在高温下具有聚合活性的DNA聚合的，来自于嗜高温的细菌，方要应用于PCR反应中，具体种类有产自嗜热水生菌的TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、TthDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶，其中Taq DNA聚合酶，使DNA的体外复制变得异常简便和常规化，大大加快了生物工程、基因组等分子生物学研究的进程，年销售利润达到上亿美元。 依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶、T4噬菌体RNA聚合酶或T7噬菌体RNA聚合酶，这类酶无需引物，但识别DNA上特异性位点（启动列），合成RNA。 核酸酶S1，来源于米曲霉，具有3’->5’外切核酸酶活性，能特异性降解单链DNA或RNA 的核酸酶，基因工程中用于黏性末端的平切。 核酸酶BAL31，来源于交替单胞菌BAL31，对单链DNA和RNA具有类似核酸酶S1的催化活性，能同时从3’-端和5’-端降解双链DNA并使其缩短大约25%长度，催化反应需要Ca2+。基因工程中用于缩短DNA和构建嵌套缺失体也应用于限制酶图谱制作等。 2.微生物与转基因载体

蛋白酶产生菌的分离汇总讲解

蛋白酶产生菌的分离、活化选育、发酵及酶活力的测定 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其它微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈做初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其它蛋白酶产生菌。本实验主要包括：蛋白酶产生菌的分离纯化、产酶微生物菌种的选育、产酶微生物的发酵与酶活力的测定、蛋白酶产生菌的生长及生长曲线、培养基优化。 通过本实验项目，使学生学会从自然界中分离蛋白酶产生菌的方法，菌种的纯化技术、高产菌的选育技术；了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线；学会培养基优化的方法；了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理；掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法。 1 实验材料 1.1 实验样品 校园内土壤样品 1.2实验仪器与材料 牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液番红；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、血球计数板、试管、三角烧瓶、烧杯、量筒、，玻棒、电子天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（ pH 5．5—9．0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、培养皿、胶头滴管、分光光度计（应符合GB9721的规定）等。 2实验方法与步骤 2.1 培养基的配制方法 1.称量 按培养基配方比例依次准确地称药品放入烧杯中。 2.溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。 3.调pH 4.分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。 5．包扎 塞好棉花的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆扎，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。