微生物细胞大小的测定方法

微生物细胞大小测定

一、实验目得

了解目镜测微尺与镜台测微尺得构造与使用原理,掌握微生物细胞大小得测定方法. 二、实验原理

微生物细胞得大小就是微生物重要得形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小得工具有目镜测微尺与镜台测微尺。

目镜测微尺（图－1)就是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍm长度刻成50等分，或把10 mｍ长度刻成1０0等分。测量时，将其放在接目镜中得隔板上（此处正好与物镜放大得中间像重叠)来测量经显微镜放大后得细胞物象。由于不同目镜、物镜组合得放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示得长度也不一样,因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上得镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小方格所代表得相对长度.

镜台测微尺（图２0-2）就是中央部分刻有精确等分线得载玻片，一般将ｌmm等分为10０格，每格长l0μm(即０、0ｌmm）,就是专门用来校正目镜测微尺得.校正时,将镜台测微尺放在载物台上，

图1目镜测微尺图2 镜台测微尺

由于镜台测微尺与细胞标本就是处于同一位置,都要经过物镜与目镜得两次放大成象进入视野,即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数得放大而放大，因此从镜台测微尺上得到得读数就就是细胞得真实大小，所以用镜台测微尺得已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表得长度,然后移去镜台测微尺，换上待测标本片,用校正好得目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。

三、实验器材

1.活材料：酿酒酵母（Sacchaｒomyces ｃerｅvisｉae)、枯草杆菌（Bacｃiｌlｕｓｓubｔili ｓ)染色标本片。

2。器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸。

四、实验方法

１．目镜测微尺得校正把目镜得上透镜旋下，将目镜测微尺得刻度朝下轻轻地装入目镜得隔板上，把镜台测微尺置于载物台上,刻度朝上.先用低倍镜观察，对准焦距，视野中瞧清镜台测微尺得刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺得刻度平行,移动推动器,使两尺重叠，再使两尺得“0”刻度完全重合,定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合得刻度,计数两重合刻度之间目镜测微尺得格数与镜台测微尺得格数.因为镜台测微尺得刻度每格长ｌ0μｍ,所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表得长度.

例如目镜测微尺5小方格正好与镜台测微尺5小方格重叠,已知镜台测微尺每小方格为l0μm，则目镜测微尺上每小方格长度为=5×10μｍ/5＝10μm

用同法分别校正在高倍镜下与油镜下目镜测微尺每小方格所代表得长度。

由于不同显微镜及附件得放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定得显微镜与附件（特定得物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定得情况下重复使用，当更换不同放大倍数得目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表得长度。

2。细胞大小得测定

移去镜台测微尺，换上酵母菌标本片，先在低倍镜下找到目得物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体得长，宽各占几格（不足一格得部分估计到小数点后一位数)。测出得格数乘上目镜测微尺每格得校正值，即等于该菌得长与宽.一般测量菌体得大小要在同一个标本

片上测定10—2０个菌体，求出平均值，才能代表该菌得大小.而且一般就是用对数生长期得菌体进行测定。

同法用油镜测定枯草杆菌染色标本得长与宽。

五、实验报告

将实验结果填入下列表格

表1目镜测微目尺校正结果

表2酵母菌大小测定记录（格）

表3 枯草杆菌大小测定记录 (格）

结果计算长μm＝平均格数×校正值

宽μm=平均格数×校正值

大小表示：宽μm×长μm

微生物得显微直接计数法

一、实验目得

了解血球计数板得构造、计数原理与计数方法，掌握显微镜下直接计数得技能。

二、实验原理

测定微生物细胞数量得方法很多,通常采用得有显微直接计数法与平板计数法。

显微计数法适用于各种含单细胞菌体得纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质,常不易分辨。菌体较大得酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petrof Hausser)细菌计数板。两种计数板得原理与部件相同,只就是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察.而血球计数板较厚,不能使用油镜,计数板下部得细菌不易瞧清。

血球计数板就是一块特制得厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间得平台较宽,其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区,计数区得刻度有两种：一种就是计数区分为16个大方格(大方格用三线隔开),而每个大方格又分成25个小方格;另一种就是一个计数区分成25个大方格(大方格之间用双线分开）,而每个大方格又分成16个小方格。但就是不管计数区就是哪一种构造,它们都有一个共同特点，即计数区都由4０0个小方格组成。

计数区边长为1mm,则计数区得面积为l mm2，每个小方格得面积为1／4０0mm2。盖上盖玻片后，计数区得高度为0、1mm，所以每个计数区得体积为０、1mm3,每个小方格得体积为1/4000mm3。

使用血球计数板计数时,先要测定每个小方格中微生物得数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品）中微生物细胞得数量。

已知：1mm3体积＝10 mm×10 mｍ×10 mm= 1０0０ｍm３

所以：1mm3体积应含有小方格数为１000mm3/1／4０0０mm３＝4×10６个小方格，即系数K＝4×１06。

因此:每ml菌悬液中含有细胞数=每个小方格中细胞平均数（N)×系数(K）×菌液稀释倍数（d)

三、实验器材

1。活材料：酿酒酵母培养液。

２。器材:显微镜、血球计数板、盖玻片(２２mｍ×2２ｍm)、擦镜纸等.

四、实验方法

１。视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释(。

２．取洁净得血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

3.将酵母菌悬液摇匀,用滴管吸取少许,从计数板中间平台两侧得沟槽内沿盖玻片得下边缘摘

入一小滴(不宜过多），让菌悬液利用液体得表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出得多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度得升高.然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。

4．静置片刻,将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后,再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞得折光率与水得折光率相近，观察时应减弱光照得强度。

5。计数时若计数区就是由16个大方格组成,按对角线方位，数左上、左下、右上、右下得4个中方格（即10０小方格）得菌数。如果就是25个大方格组成得计数区，除数上述四个中方格外，还需数中央ｌ个中方格得菌数(即80个小方格)。如菌体位于中方格得双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线,以减少误差.

6．对于出芽得酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2-３次（每次数值不应相差过大,否则应重新操作）,求出每一个小方格中细胞平均数（N），按公式计算出每ｍl(g)菌悬液所含酵母菌细胞数量。

7．测数完毕,取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净,切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干,放入盒内保存。

五、实验报告

将实验结果填入下表中：

实验室环境与人体表面微生物得检查

一、实验目得

1、证明实验室环境与体表存在微生物。

2。比较来自不同场所与不同条件下细菌得数量与类型。

3．观察不同类群微生物得菌落形态特征。?4。体会无菌操作得重要性。

二、实验原理?平板培养基含有细菌生长所需要得营养成分，当取自不同来源得样品接种于培养基上,在适宜温度下培养1~２d内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖,形成一个可见得细胞群体集落，称为菌落.每一种细菌所形成得菌落都有它自己得特点，例如菌落得大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐,菌落透明或半透明或不透明,颜色以及质地疏松或紧密等.因此，可通过平板培养来检查环境中细菌得数量与类型。?三、器材?l。培养基肉膏蛋白胨琼脂平板。?２．仪器或其她用具无菌水，灭菌棉签（装在试管内）,接种环，试管架，酒精灯或煤气灯等.

四、操作步骤

ｌ.写标签?任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，写上班级、姓名、日期，本次实验还要写上样品来源(如实验室空气或无菌室空气或头发等）,字尽量小些，写在皿底得一边，不要写在当中，以免影响观察结果。?培养皿得记号一般写在皿底上。如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿得结果，打开皿盖时,容易混淆。

２．实验室细菌检查

(1）空气将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在当时做实验得实验室,移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中;将另一肉膏蛋白胨琼脂平板放在无菌室或无人走动得其她实验室,移去皿盖。lh后盖上两个皿盖.

(2）实验台与门得旋钮

①用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。

②取棉签左手拿装有棉签得试管,在火焰旁用右手得手掌边缘与小指、无名指夹持棉塞(或试管帽），将其取出,将管口很快地通过煤气灯（或酒精灯）得火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管,用右手得拇指与食指将棉签小心地取出。塞回棉塞(或试管帽)，并将空试管放在试管梁上。

③弄湿棉签左手取灭菌水试管，如上法拨出棉塞(或试管帽)并烧灼管口,将棉签插入水中,再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多得水分,小心将棉签取出，烧灼管口，塞回棉塞（或试管帽）,并将灭菌水试管放在试管梁上。

④取样将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cｍ2得范围．?⑤接种在火焰旁用左手拇指与食指或中指使平皿开启成一缝．再将棉签伸人，在琼脂表面顶端接种,即滚动一下，立即闭合皿盖。将原放棉签得空试管拨出棉塞（或试管帽）,烧灼管口，插入用过得棉签，将试管放回试管架.

⑥划线另取接种环在火焰上灭菌,进行划线，整个划线操作均要求无菌操作,即靠近火焰，

而且动作要快。

3.人体细菌得检查?（1）手指（洗手前与洗手后)?①分别在两个琼脂平板上标明洗手前与洗手后（班级、姓名。日期)。

②移去皿盖，将未洗过得手指在琼脂平板得表面,轻轻地来回划线,盖上皿盖。

③用肥皂与刷子,用力刷手，在流水中冲洗干净，干燥后,在另一琼脂平板表面来回移动，盖上皿盖。?(2)头发在揭开皿盖得琼脂平板得上方，用手将头发用力摇动数次,使细菌降落到玻脂平板表面，然后盖上皿盖。

Ａ、接种时，用左手将平皿开启一缝；B、棉签伸入平板接种；

C、用己灭菌并冷却了得接种环划线；

D、第二部分划线;

E、最后部分划线

（3)咳嗽将去皿盖得琼脂平板放在离口约6～８cm处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。

(４)鼻腔?①按照实验台检查法得步骤②与③,取出棉签,并将其弄湿.

②用湿棉签在鼻腔内滚动数次.?③按实验台检查法得步骤⑤与⑥,接种与划线，然后盖上皿盖。?４.将所有得琼脂平板翻转，使皿底朝上，放37℃培养箱，培养1~2d。?五。结果记录方法?(１）菌落计数在划线得平板上，如果菌落很多而重叠,则数平板最后1/４面积内得菌落数.不就是划线得平板,也一分为四,数ｌ/4面积得菌落数.

(２）根据菌落大小、形状、高度、干湿等特征观察不同得菌落类型。但要注意,如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起,或者限制了菌落生长而变得很小,因而外观不典型，故观察菌落得特点时，要选择分离得很开得单个菌落。?菌落特征描写方法如下：

①大小大、中、小、针尖状.可先将整个平板上得菌落粗略观察一下，再决定大、中、小得标准，或由教师指出一个大小范围.

②颜色黄色、金黄色、灰色、乳白色、红色、粉红色等。?③干湿情况干燥、湿润、粘稠.?④形态圆形、不规则等。

⑤高度扁平、隆起、凹下.?⑥透明程度透明、半透明、不透明。?⑦边缘整齐、不整齐。?六、实验报告

１ .将实验结果记录于下表中。

2 。与其她同学所做得实验结果进行比较。

3 。比较各种不同来源得样品,哪一种样品得平板菌落数与菌落类型最多?

４。人多得实验室与无菌室（或无人走动得实验室）相比,平板上得菌落数与菌落类型有什么区别?您能解释一下造成这种区别得原因吗?

5 。洗手前后得手指培养基平板,菌落数有无区别？

6 ．通过本次实验，在您防止培养物得污染与防止微生物得扩散方面，您学到些什么?有什么体会？

微生物的计数——血球计数板法

微生物得计数——血球计数板法 【摘要】测定微生物细胞数量得方法很多，有分光光度法、显微直接计数法与平板计数法。分光光度法比较简便，易操作，但就是会使数据严重偏大。而平板计数法则会使实验数据严重偏小.?显微计数法适用于各种含单细胞菌体得纯培养悬浮液,如有杂菌或杂质，常不易分辨.菌体较大得酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板,一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(PetｒｏｆHausｓｅr)细菌计数板。两种计数板得原理与部件相同，只就是细菌计数板较薄,可以使用油镜观察。而血球计数板较厚,不能使用油镜，计数板下部得细菌不易瞧清.本实验采用血球计数板法，主要目得就是了解血球计数板法得构造与使用方法，学会用血球计数板对酵母菌细胞进行计数。 一、实验目得与要求 １、了解微生物计数常用得三种方法：分光光度法;平板计数法；血球计数板法。 2、了解血球计数板得构造与使用方法。 3、学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。 二、基本原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数，就是一种常用得微生物计数方法。此法得优点就是直观、快速.将经过适当稀释得菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间得计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室得容积就是一定得（０、1mｍ2），所以可以根据在显微镜下观察到得微生物数目来换算成单位体积内得微生物总数目。由于此法计得得就是活菌体与死菌体得总与，故又称为总菌计数法. 血球计数板,通常就是一块特制得载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间得平台又被一短横槽隔成两半，每一边得平台上各刻有一个方格网,每个方格网共分九个大方格,中间得大方格即为计数室，微生物得计数就在计数室中进行。 计数室得刻度一般有两种规格,一种就是一个大方格分成１６个中方格，而每个中方格又分成25个小方格;另一种就是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论就是哪种规格得计数板,每一个大方格中

土壤微生物生物量的测定方法

土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生 物生物量碳，用一定体积的LK 2SO 4 溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微 生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL 3 ）； 2）L硫酸钾溶液：称取87g K 2SO 4 溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 操作步骤 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 熏蒸 称取新鲜（相当于干土，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO 2 ，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完

全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）※ 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个的滤头，一个才1元）。 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 计算 SMBC=(E C CHCL3—E C CK)*TOC仪器的稀释倍数*原来的水土比/ 2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法） 土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下 基本原理（茚三酮比色法）

微生物细胞大小的测定方法

微生物细胞大小测定 一、实验目的 了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。 二、实验原理 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。 目镜测微尺（图-1）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小方格所代表的相对长度。 镜台测微尺（图20-2）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上， 图1目镜测微尺图2 镜台测微尺 由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 三、实验器材 1．活材料：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、枯草杆菌(Baccillus subtilis)染色标本片。 2．器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸。 四、实验方法 1．目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。

微生物计数方法

微生物的显微直接计数法 一、实验目的 了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握显微镜下直接计数的技能。 二、实验原理 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区（图21-1），计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。 使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。 已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3 所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106。 因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d） 三、实验器材 1．活材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培养液。 2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片（22mm×22mm）、吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。 四、实验方法 1．视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。 2．取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。 3．将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。4．静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。 5．计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的菌数（即80个小格）。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

土壤微生物量碳测定方法

土壤微生物量碳测定方法及应用 土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。 熏蒸提取法（FE法） 由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加 入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用0.5mol·L-1K 2SO 4 提取 液提取的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤 微生物碳的基本方法：该方法用0.5mol·L-1K 2SO 4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏 蒸土壤，提取液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增 加量除以转换系数K EC (取值0.38)来计算土壤微生物碳。 Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。 林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。 对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的 研究。测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的 测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数K EC 取值也不同，如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为0.38（Vance等，1987）和0.45（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的K EC 值有较大不同，其值变化为0.20-0.50（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor 等（1998）研究表明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异，从表层 0-20cm土壤的K EC 为0.41，逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为0.31。 一、基本原理 熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破 坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取 成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。 二、试剂配制 （1）硫酸钾提取剂（0.5mol·L-1）：取871.25g分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。 由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100rev·min-1）12小时即可完全溶解。 （2） 0.2 mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 （分析纯）9.806g 于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解，可加热加快其溶 解。 （3） 0.1000 mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g， 用蒸馏水溶解并定溶至1L。

常见的微生物检测方法

常见的微生物检测 方法

摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同

时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：

实验七 酵母菌细胞大小的测定

实验七酵母菌细胞大小的测定 一、实验目的 1.了解测量微生物大小的原理； 2.学习并掌握接目测微尺的校正方法及微生物大小的测定方法，增强微生物细胞大小的感 性认识。 二、实验材料 1.菌种：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌悬液，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 染色标本片。 2.仪器或其他用具：显微镜，接目测微尺，镜台测微尺，载玻片，盖玻片 三、实验原理 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物细胞个体较小，需要在显微镜下借助于特殊的测量工具—测微尺来测定其大小。测微尺包括镜台测微尺和接目测微尺。 镜台测微尺是一张中央部分刻有精确等分线的载玻片，专门用于校定接目镜测微尺每小格的相对长度。通常，刻度的总长是1mm，被等分为100格，每格0.01mm（即10μm）。镜台测微尺不直接用来测量细胞的大小。 接目测微尺是一块可以放入接目镜的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格的两种。在测量时将接目测微尺放在目镜的隔板上，即可来测量经显微镜放大后的细胞物象。也有专用的目镜，里面已经安放好了接目测微尺。 由于接目测微尺所测量的是经显微镜放大后的细胞物象，因此，在不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度也不一样。所以，在用接目测微尺测量微生物大小之前，必须先用镜台测微尺校定接目镜测微尺，以确定该显微镜在特定放大倍数的目镜和物镜下，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度，然后根据微生物细胞相当于的接目镜测微尺格数，计算出微生物细胞的实际大小。 图7-1测微尺的安装 图7-2目镜测微尺图7-3用镜台测微尺校正接目测微尺

微生物大小与数量的测定实验报告

山东大学实验报告2017年11月27日 ________________________________________ _________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物大小与数量的测定姓名：丁志康 一、目的要求 1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 2.增强微生物细胞大小的感性认识。 3. 明确血细胞计数板计数的原理。 4. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 二、基本原理 一）微生物大小的测定 1.微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物 大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测 微尺和镜台测微尺。 2.镜台测微尺是中央部分可有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格每 格长0.01mm（即10μm）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于 矫正目镜测微尺每格的相对长度。 3.目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有 等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以 测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大 倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺 测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定大放 大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物 细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。 4.球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直 径约为0.8μm，枯草芽孢杆菌大小为0.7~0.8×2~3μm。 二）微生物数量的测定 1.微生物数量的测定有多种方法，本次试验中使用显微镜直接计数法。显微镜直接 计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻 片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前 国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley 计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。 后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间 的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。（除 了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法， 此法一般用于牛乳的细菌学检查。)显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操

微生物大小的测定及微生物数量的直接计数法

微生物大小的测定及微生物数量的直接计数法摘要：本文使用了目镜测微尺和镜台测微尺来测量野生酵母的细胞大小，得到的结果是宽在5.78~11之间，长在8.25~20之间。然后用血细胞计数板对酵母菌进行计数，并绘制其生长曲线，有四个时期，分别是延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。 关键词：细胞大小血细胞计数板酵母菌生长曲线 前言 生产生活中利用微生物时，需要了解微生物的一些基本物理属性，如菌体的大小形状等。本实验利用显微测微尺对野生酵母进行测量，并用血球计数板对酵母菌进行其生长曲线的测定，了解去生长规律。通过此综合性实验加深对无菌操作的印象，并将其掌握。 1实验材料与仪器 1．1实验材料与试剂 麦芽汁培养基、生理盐水、果汁（自制）、活化的酵母菌、酒精 1．2实验仪器 锥形瓶、试管、接种环、移液枪、显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、载玻片、滴管、血细胞计数板、吸水纸、酒精灯 2实验方法 2．1预准备 2.1.1培养基的制备 麦芽汁培养基（130.1g/L）200ml*4瓶 麦芽汁琼脂培养基（145.1g/L）5ml*2支试管150ml*1瓶 生理盐水9ml*20支 （制备后高压蒸汽灭菌121℃，20min） 2.1.2酵母分离纯化 平板划线分离：先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释, 微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少, 并逐步分散开

来。经培养后,可在平板表面形成分散的单 个菌落。但单个菌落并不一定是由单个细 胞形成的，需再重复划线1-2次, 并结合显 微镜检测个体形态特征, 才可获得真正的 纯培养物。 斜面接种是从已生长好的菌种斜面上 挑取少量菌种移植至另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2-3cm的位置。点燃酒精灯。用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。 简述如下：1)手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置。2)旋松管塞：先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。3)取接种环：右手拿接种环(如握钢笔一样)，在火焰上将环端灼烧灭菌。然后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。4)拔管塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。5)接种环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。6)取菌：待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使带菌接种环通过火焰。7)接种：在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，切勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。8)塞管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将管塞旋上。塞棉塞时不要用试管去迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。9)将接种环灼烧灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。

凯氏定氮法：土壤微生物量氮测定

土壤微生物量氮的测定方法 1.试剂配制： (1)混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、 五水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细,贮于瓶中。 (2)密度为1.84浓硫酸。 (3)40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶 解定容至1L。 (4)2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。（按体 积比100:2加入混合指示剂） (5)混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中, 用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。 (6)0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至 1000ml，用基准物质标定之。 (7)0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加 热）定容至1L。 (8)去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗 中，加入200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿倒入分液漏斗中，反复3次。将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，置于暗处保存。 2.试验步骤：。 （1）制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（空白直接称取15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。 （2）测定：滤液要是不及时测定，需立即在-15℃以下保存，此滤液可用于微生物碳氮的测定。微生物碳测定只吸取2ml，采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定。微生物氮吸取滤液10ml于消化管中，加入2g催化剂，在再加5ml浓硫酸，管口放一弯颈小漏斗，将消化管置于通风橱内远红外消煮炉的加热孔中。打开消煮炉上的所有加热开关进行消化，加热至微沸，关闭高档开关，继续加热。消煮至

土壤微生物测定方法

土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL， 加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算

微生物大小及数量地测定

微生物大小及数量的测定 一、实验目的： 1、学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法 2、掌握对不同形态细菌细胞大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细 胞大小的感性认识 3、学习并掌握使用血细胞计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法 二、实验器材 1、菌种： 枯草芽孢杆菌、酿酒酵母 2、溶液和试剂 香柏油、二甲苯、美兰染液 3、仪器和其他用品 目镜测微尺、镜台测微尺、普通光学显微镜、擦镜纸、软布、血细胞计数 板、凹载玻片、盖玻片、接种环、酒精灯、试管、吸管、移液枪 三、实验原理 1、测微尺： 微生物大小的测定，需要借助于特殊的测量工具——显微测微尺，它包括 目镜测微尺和镜台测微尺两个互相配合使用的部件。 镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为是10个小格，共100个小格，每个小格长度为0.01mm，即10μm。刻线外有一直径为φ3，粗线为0.1mm的圆，以便调焦时寻找线条。刻线上还覆盖有厚度为0.17mm的盖玻片，可保护刻线久

用而不受损伤。。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜 测微尺每一格的相对长度。 目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻 度，一般有等分为50个小格和100个小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不一样，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度 也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。 球菌用直径表示大小，杆菌用长和宽来表示大小 2、显微镜计数： 显微镜计数是将少量待测样品的悬浮液置于一种特定的具有确定容积的载 玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接观察、计数的方法。目前国内外常用的 计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们可用于各种微生物单细胞（孢子）悬液的计数，基本原理相同。其中血细胞 计数板较厚，不能用油镜，常用于个体相对较大的酵母细胞、霉菌孢子等的计数，

土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸

. 土壤微生物生物量的测定方法 1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法） 1.1 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LKSO溶液提取土壤，借用有机碳自动分析42仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换 系数（K），从而计算土壤微生物生物量碳。EC1.2 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干 燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL）；32）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g KSO溶于1L蒸馏水中423）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸 称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO，干燥器底部加入少量2水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分 钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完1 / 7 . 全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不※（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）熏蒸对照处理。 1.4.4 浸提过滤聚乙烯

微生物大小测定

微生物的大小测定 胡雪芳 201300261033 【实验目的】 1.了解显微镜测定微生物大小的原理。 2.学习并掌握显微镜下测定微生物细胞大小的技术，包括目镜测微 尺、镜台测微尺的校正技术与测定细胞大小的技术。 【实验原理】 微生物细胞的大小，是微生物重要的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小、只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。 1.目镜测微尺 目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分（如图1所示）。 图1 目镜测微尺 测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校

正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2.镜台测微尺 镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的（如图2所示）。 图2 镜台测微尺 校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 【实验材料】 1.菌株 酵母菌液， 枯草芽孢杆菌斜面培养物

土壤微生物量测定方法

土壤微生物量测定方法 一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法） 1、试剂 （1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 ? 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。 （2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。 （3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h 即可。 （4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH ]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH ，用高纯度去离子水定容至1 L。要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。 ) （5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。 （6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。 （7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（）= 1000 mg C L-1]）：取2.1254 g经105℃烘2～3 h的分析纯邻苯二甲酸氢钾，溶于高纯度去离子水，定容至1 L。 2、仪器设备 碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100 ml）、振荡器（300 r min-1）、可调加液器（50 ml）、可调移液器（5 ml）、烧杯（盛滤液用）（50~100 ml）、聚乙烯提取瓶（100，150 ml），聚乙烯塑料桶（20 L，带螺旋盖），三角瓶（150 ml）、其它常规仪器。 3、操作步骤 ; （1）土样前处理 新鲜土壤应立即处理或保存于4℃冰箱中，测定前先仔细除去土样中可见植物残体（如根、茎和叶）及土壤动物（如蚯蚓等），过筛（孔径< 2 mm），彻底混匀。如果土壤过湿，应在室内适当风干，以手感湿润疏松但不结块为宜（约为饱和持水量的40%）。如果土壤过于干燥，用蒸馏水调节至饱和持水量的40%。将土壤置于密封的大塑料桶内在25℃条件下预培养7～15 d，桶内有适量水以保持相对湿度为100%，并在桶内放一小杯1 mol L-1 NaOH 溶液以吸收土壤呼吸产生的CO2。经过预培养的土壤应立即分析。如需保留，应放置于4℃

土壤微生物数量测定方法整理

土壤微生物的分离鉴定及数量测定 （一）培养基的制备 Ⅰ测定微生物总量培养基： 1. 细菌培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基） 牛肉膏Beefextract 5.0g 蛋白胨Peptone 10.0g NaCI 5.0g 蒸馏水H20 1000m1 琼脂15～20g PH 7.2~7.4 制备步骤： ⑴在100 mL小烧杯中称取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸馏水，置电炉搅拌加热至牛肉膏，蛋白胨完全溶解. ⑵向小铝锅中加入500 mL蒸馏水，将溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入铝锅中并用自来水洗2～3次.加入 5.0gNaC1，在电炉上边加热边搅拌. ⑶加入洗净的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全熔化，补足水量至1000 mL. ⑷用NaOH或HC1调至pH7.0. 用酸度计或用玻棒沾少许液体用精密pH试纸测定其pH值，并用10％NaOH 调至所需pH值，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2，因为高压蒸汽灭菌后，pH常降低。 ⑸根据不同需要，可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基，应装试管高度的1/4左右；固体培养基装试管高度的1/5左右；装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。，塞好棉塞，装入小铁丝筐，然后用旧报纸将棉塞部分包好. 标签表明培养基的名称、配制日期等。 ⑹高压蒸汽灭菌，用0.1Mpa（15lb/in2）121℃灭菌（15-20）30min. 2. 放线菌培养基（改良高氏1号琼脂培养基） 可溶性淀粉20g KNO3 1g K2HPO40.5g MgSO4? 7H2O 0.5g NaCl 0.5g原0.05g FeSO4? 7H2O 0.01g pH 7.2-7.4 制备步骤： （1）计算根据配方计算各种药品所需要的量，然后再分别称量。 （2）称量准确称量各种成分。 （3）溶化配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入少许沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调PH（可不调）。 （4）分装、包扎、灭菌。

土壤微生物生物量的测定方 法(氯仿熏蒸)

土壤微生物生物量的测定方法 1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理 新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。 1.2 实验仪器 自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。 1.3 实验试剂 1）无乙醇氯仿（CHCL3）； 2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中 3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的） 1.4 操作步骤 1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸 称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，

用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。 1.4.2 抽真空处理 熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。（注意：熏蒸后不 可久放，应该快速浸提）※ 1.4.4 浸提过滤 从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部分熏蒸和不熏蒸土均为4g，即，4g土：16ml的硫酸钾溶液，当然这个加入量要根据TOC仪器的进入量决定）300r/min振荡 30min，用中速定量滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分析，请保存在—20℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。 1.4.5 TOC仪器测定 吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定，但是一般情况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）注入自动总有机碳（TOC）分析仪上，测定提取液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，不同的型号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分析仪（Shimadzu Model TOC---500,JAPAN）为例。 1.5 计算