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细胞工程思考题参考答案

第一章绪论课后习题答案

1. 动物细胞工程主要有哪些内容?这些技术有何用途?

答:1. 组织和细胞培养技术2. 细胞融合与单克隆抗体技术3. 细胞核移植技术4. 胚胎工程技术5. 干细胞技术6. 转基因技术7. 染色体工程

细胞工程的应用有:A. 单克隆抗体的应用:疾病诊断与治疗、微量大分子物资的检测、贵重生物活性物的分离与提纯、特殊疾病治疗、与药物交联治疗疾病;B. 转基因技术的应用:建立疾病的动物模型、品种改良和抗病育种、“乳腺生物发应器”、基因代替治疗、异种器官移植、基因功能研究;C. 细胞与组织替代治疗;D. 治疗人类不孕症;E. 优良品种繁育;F. 生产转基因家畜;G. 保护濒危动物。

2.追踪动物细胞工程研究与应用的最新进展,并预测其发展趋势。

第二章细胞培养

1、体外培养细胞有哪些类型?其生长特点有什么区别?

答:体外培养的细胞根据其生长方式,主要分为贴壁生长型细胞和悬浮生长型细胞。离体细胞必须贴附于底物上才能生长的细胞称为贴壁生长型细胞。有机体的绝大部分细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长。动物细胞培养中,大多数细胞必须贴附在固相表面才能生长,当细胞布满表面后即停止生长。从生长表面脱落进入液体得细胞通常不再生长而逐渐退化,这种细胞称为单层附壁细胞。贴壁生长的细胞在活体体内时,形态各异,而体外培养状态下则在形态上比较单一而失去其在体内时原有的特征。

按照培养细胞的形态,主要可分为以下几类:成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞;少数细胞类型在体外培养时不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长,包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞,如血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞等,这些细胞在悬浮中生长良好,可以是单个细胞或为细小的细胞团,观察使细胞呈圆形。由于悬浮生长于培养液中,因此其生存空间大,具有能够提供繁殖大量细胞、传代方便、易于收获细胞等优点,易于大规模生产,便于过程的控制。

2、细胞系的生长过程包括哪些主要阶段?每一生长阶段各有什么特征?

答:进行正常细胞培养时,不论细胞的种类和供体的年龄如何,细胞系的生长过程都经历原代培养期、传代培养期和衰退期(或永生化)三个阶段。

①原代培养期也称初代培养期,即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段,一般持续1~4周,此期细胞呈活跃的移动,可见细胞分裂,但不旺盛。原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动相似性较大,细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞,在软琼脂培养基中进行培养时,细胞克隆形成率很低,即细胞独立生存性差。

②原代细胞生长一定时间后,如是贴附型细胞就会连接成片而铺满瓶底,这时需将原代细胞分开至多个新的培养瓶中,这个过程称为传代。初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。此期细胞增殖旺盛,可见细胞分裂相,并能维持二倍体核型。传代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动发生较大改变。一般情况下当传代10~50次左右,细胞增殖逐渐缓慢,以至完全停止,细胞进入第三期。

③衰退期的细胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;细胞形态轮廓增强,最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段,少数情况下,在以上三期任何一点(多发生在传代末或衰退期),由于某种因素的影响,细胞可能发生转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性。细胞永生性也称不死性,即细胞获持久性增殖能力,这样的细胞群体称无限细胞系,也称连续细胞系。

3、每代细胞的生长曲线包括哪几个主要时期?各期细胞有何特点?

答:每代细胞从开始接种到分离再培养,一般要经过以下阶段:潜伏期、指数(对数)生长期和停止期(平台期)。

①细胞接种培养初期,历经悬浮、贴壁及生长加速的阶段。细胞接种培养后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩,胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上,称贴壁,贴壁出现标志悬浮期结束。细胞贴附于支持物后,会发生一系列变化,然后还要经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时,可有生长活动,基本无增殖,少见分裂相。潜伏期后,细胞分裂出现,并逐渐增多,标志细胞进入指数生长期。

②又称对数期。此时细胞生长增殖旺盛,细胞成倍增长,活力最佳,最适合进行实验研究。细胞分裂相增多。(细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。)

③在细胞数量达饱和密度后,细胞停止增殖,进入停止期。此时细胞数量持平,故也称平台期。停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动,可继续存活一段时间。该时期细胞形态轮廓增强,最后开始衰退死亡。

4、什么是原代培养与传代培养?原代细胞培养有哪些方法?各自的适用范围是什么?

答:原代培养也称初代培养期,即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段,一般持续1~4周。传代培养是指原代细胞生长一定时间后,如是贴附型细胞就会连接成片而铺满瓶底,这时需将原代细胞分开至多个新的培养瓶中,这个过程称为传代,初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。(课本55页)原代细胞培养的方法有:组织块培养法、单层细胞培养法、悬浮细胞培养法。组织块培养法特别适合于组织量少的原代培养;单层细胞培养法尤其适用于细胞建系和大量组织的培养,用于少量培养工作时稍显繁琐;悬浮细胞培养法对悬浮生长的细胞如白细胞、骨髓细胞和胸水、腹水等癌细胞,可直接接种进行原代培养。

5、常用的组织细胞分离方法有哪几种?

答:分散组织的方法有机械法分离和消化分离法两种;根据组织种类和培养要求,宜采用相应的方

法。(1). 机械分离法:A.离心分离法B.切割分离法C.机械分散法;(2). 消化分离法:A.胰蛋白酶消化法B.胶原酶消化法C.EDTA(螯合剂)消化法

6、贴壁细胞传代时采用何种方法?其技术关键是什么?

答:贴壁细胞传代时采用消化分离法,其技术关键是把握好传代时机,消化时间要适度,消化液浓度要适宜,传代的细胞接种数量可适当多一些,使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖,部分贴壁生长细胞不经消化处理直接进行吹打也可使细胞从壁上脱落下来,而进行传代。

7、常用的细胞克隆化方法有哪些?简述其主要技术环节

答:主要方法有:稀释铺板法、饲养层克隆法、琼脂克隆法、毛细管克隆法、荧光激活分选法等。稀释铺板法:也称为有限稀释法。其原理是通过适当的稀释达到分离单个细胞的目的。将培养的细胞进行计数,用培养液进行稀释到5~10个细胞/ml后,在多孔培养板(一般为96孔板)各孔内分别加入细胞悬液0.1~0.2 ml,使孔内落入细胞的几率为每孔一个细胞。镜检每孔所含细胞数,标记含单个细胞的孔,培养一段时间后,凡在已标记的孔中有生长增殖的细胞群即为克隆细胞。常规使用中,一般不进行镜检,多采用多次克隆化培养得到单细胞的克隆系。

饲养层克隆法:对一些生长缓慢的细胞(如杂交瘤细胞) ,单个细胞或密度极低时细胞难以存活和增殖,在培养皿中加入能贴壁生长的其他细胞(称为饲养细胞),这些细胞不仅能起到饲养作用,还能清除培养体系中的死、伤细胞及其碎片。饲养细胞的存在可以促进单个细胞生长为细胞克隆,达到克隆化目的。常用的饲养细胞有成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞。巨噬细胞不仅能起饲养作用,还能清除培养体系中死、伤细胞及其碎片。

琼脂克隆法:将细胞培养在软琼脂形成的半固体培养基上,单个细胞可在半固体的培养基上增殖形成集落。常用的软琼脂法是在培养皿中先铺一层0.5%的琼脂,待凝固后再铺一层0.25%的软琼脂,加入的细胞数要在几率上使长出的集落是一个细胞的后代。长出集落后,再转移到其他培养器中进行扩增分析。

毛细管克隆法:毛细管克隆细胞法是最早的单细胞分离培养技术。其基本过程是:在倒置显微镜下,用弯头毛细管或借助显微操作仪将细胞逐个吸出,分别放入96孔板内培养形成克隆。本法虽比较精确,但过程较繁琐,成功率低,现已少采用。

荧光激活分选法:将细胞标上荧光,当细胞悬液流经激活分选仪喷嘴时形成含有单细胞的液滴,细胞受激光照射发出荧光和前向散射光。通过仪器分析,使细胞带上电荷并使细胞流动方向发生偏移,各个含单细胞的液滴被分别收集在96孔板各孔内,以达到克隆化的目的。

8、常用的动物细胞大规模培养主要有哪些操作模式?各有哪些优缺点?

答:操作模式:可采用分批式操作、流加式操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作等多种操作方式进行培养。

分批式操作:将细胞扩大培养后,一次性将细胞和培养液投入生物反应器内进行培养,在培养过程中其体积不变,不添加其他成分,待细胞增长和产物积累到适当的时间,一次性对细胞、产物、培养基进行收获,从中分离所需物质。该操作简单、培养周期短、污染和细胞突变的风险小,既能直观地反应细胞生长代谢的过程,又可直接放大,是进行动物细胞培养工艺条件研究常用的手段。流加式操作:细胞持续生长至较高的密度,整个培养过程没有流出或回收,细胞或产物达到所需指标后终止培养,一次性回收整个反应体系,分离纯化产品。

半连续式操作:培养物的体积逐步增加;可进行多次收获;细胞可维持指数生长,并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平,培养过程可持续到很长时间。

连续式操作:细胞维持持续指数增长,产物体积不断增长,可控制衰退期和下降期。其不足是,由于是开放式操作,加上培养周期较长,容易造成污染,在长周期的连续培养中,细胞的生长特性以及分泌产物容易变异,对设备、仪器的控制技术要求较高。灌流式操作:细胞截留系统可使细胞保留在反应器内,维持较高的细胞密度,提高产品的产量;连续灌流细胞使细胞稳定地处于较好的营养环境中,有害代谢废物得以及时清除;反应速率容易控制,培养周期较长,可提高生产率,目标产品回收率高;产品在灌内停留时间短,可及时回收,有利于保持产品的活性。

9、什么是细胞系、细胞株?

答:细胞系(cell line): 原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。如果细胞系不能继续传代或传代次数有限,称为有限细胞系,它由原代培养中的许多细胞系列组成;如细胞系可连续传代,则称为连续细胞系,即已建成的细胞系。

细胞株(cell strain):通过筛选或克隆化,且有特异标记的细胞,这些特性在以后的培养中必须持续存在。这些特性包括具有一定的标记染色体,对某种病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。

10、动物细胞培养中常见的微生物污染有哪些?如何排除这些污染?

答:在组织和细胞培养中常见的微生物污染包括:细菌、真菌、支原体和病毒。细胞培养中用抗生素是杀灭微生物的主要手段,但迄今尚无对抗支原体特效抗生素,加温除菌法,动物体内接种除菌法,巨噬细胞吞噬法。

第三章细胞融合与单克隆抗体

1、简述细胞融合技术的主要方法与技术原理。

答:促细胞融合的方法有:病毒融合剂诱发细胞融合,化学融合剂诱发细胞融合,电融合法。

细胞融合的基本技术:细胞融合实际上包含多个过程:首先是两个亲本细胞并列,以后膜组织局部破坏,最终形成包围融合细胞的连续胞膜。融合细胞表现的特征性变化,有膜成分和胞质成分的交流以及细胞内电导率的连续性。

2、简述筛选融合细胞的主要方法与原理(各种方法的原理???)。

答:利用酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、形态和行为等标志,建立了多种选择选择系统,最

常用的是酶缺陷型HAT选择培养法。

酶缺陷型:将长期培养系突变为HGPRT或TK酶缺陷型的细胞系,在和正常细胞融合后,未经融合或自身融合的骨髓瘤细胞在HAT培养液中死亡;未融合或自身融合的正常细胞在体外生存能力有限最终也死亡。因此存活下来的只有融合细胞。

营养缺陷型:营养缺陷型是指一些细胞在合成某些营养物上有缺陷,在缺乏必须营养物的培养基中难以生存。将不同营养缺陷型的细胞生成杂交细胞,这些细胞通过融合后基因互补得以在缺乏相应营养物的培养基中得以生存,而未融合细胞由于代谢受阻而死亡,由此可以将融合细胞分离出来。温度敏感性:培养的哺乳动物细胞可在32℃~40℃之间的范围内存活(最适温度为37℃),利用突变获得不能在非许可温度(如38℃~39℃)中生长的温度突变型细胞,利用与温度敏感突变细胞融合的杂交细胞,采用非许可温度下进行选择培养,就可将融合的杂交细胞筛选出来。

形态和行为标志:若亲本细胞形态明显不同,识别异核细胞并不困难。例如,鸡红细胞与HeLa细胞融合,它们的核不仅大小和形态不同,而且鸡红细胞的核相当浓缩;HeLa细胞核染色质则比较弥散。由这两种细胞融合产生的异核细胞,就很容易鉴别。利用细胞生长或贴壁行为不同的特点,也可用来筛选杂种细胞。例如,鸡红细胞离体时不再生长,但可与其它细胞(如HGPRT-的人细胞)杂交。在HAT培养液中,HGPRT-细胞死亡,鸡红细胞也不生长,只有杂种细胞增殖。

3.简述单克隆抗体的制备过程及主要原理。针对某一抗原物质A设计一个研究方案,并制备相应的单克隆抗体。

答:原理:在体液免疫反应中,一个抗原分子上可能含有许多抗原决定簇(即表位),每个淋巴细胞都会产生针对一个抗原决定簇的特异性抗体,若能把此B细胞由脾脏中挑出来,单独培养成细胞株,则可得单一种类的抗体,只会对一种抗原决定簇反应,其专一性极高。大量培养此细胞株,即可有质量一定、纯度均一的抗体,此即为单克隆抗体。基本过程:先免疫动物,分离脾细胞,准备骨髓瘤细胞的准备,细胞融合,筛选与克隆融合细胞,最后大量制备单克隆抗体。

方案:免疫动物:将处理好的抗原多次注射到BALB/c小鼠体内,每隔2天注射一次,第3~5天进行试采血检验血清中的抗体,同时可用脾内注射培养基轻轻挤压使淋巴细胞逸出的方法采集淋巴细胞(大多为B细胞)。B细胞富集:将抗原包被在培养板或其他基质上,然后与脾细胞结合,那些表面具有特异性抗体的B细胞与抗原结合使得B细胞黏附于培养板或基质上,轻轻洗涤除去不黏附的细胞,留下的细胞为具有特异性抗体的B细胞,骨髓癌细胞的准备:用BALB/c小鼠的653。细胞融合:用PEG诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞间进行融合,操作在10 min 内完成;融合后马上以HA T 培养,能活下来的大多为 B 细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。未融合的骨髓瘤及骨髓瘤细胞间相互融合的细胞在HAT中因DNA 合成抑制而死亡。未融合的B细胞及B细胞相互融合的细胞在体外培养因无法增殖会渐渐死去。使用抗原结合法对杂交瘤细胞产生的抗体专一性进行筛选采用有限稀释法或软琼脂法对杂交瘤细胞进行细胞克隆化,获得来自单个细胞的克

隆;并对单个细胞生长出的群落,再次以ELISA 筛选专一性抗体,获得可产生特异性抗体的单克隆细胞株。用体内法大量制备单克隆抗体:可把筛选出来的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔,诱导小鼠产生大量腹水,然后以针头收集所产生的腹水,通常每次可取得3~5 mL左右。

4.HAT的选择原理是什么?

答:HAT系统为次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)的缩写。它是根据嘌呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂种细胞特殊的培养基。细胞内核苷酸的生物合成有两条途径:一条是主要途径,该途径中叶酸及其衍生物是必不可少的,氨基喋呤可抑制二氢叶酸还原酶活性,从而阻断细胞中DNA的合成;另外一条是补救途径,该途径需要两种酶参与。一种是HGPRT酶(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶) ,另一种酶是TK酶(胸腺嘧啶核苷激酶) 。它们可以分别利用次黄嘌呤催化产生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化产生的脱氧胸苷来合成DNA。H、T为应急途径时提供外源核苷酸“前体”。在氨基喋呤存在时,阻断了核苷酸的从头合成IMP的途径,细胞只能通过HGPRT使次黄嘌呤酸化形成次黄苷酸,再依次转化为AMP及GMP,即通过“补救途径”依赖外源来合成核苷酸。因此,一个HGPRT-或TK-的细胞株不可能在含HA T的培养液中生长。但这样的细胞与能提供HGPRT或TK酶的细胞相融合,则杂交细胞能在含HA T培养液中存活下来。如果融合细胞的亲本之一是一个能在体外长期生存的骨髓瘤细胞系,而另一个亲本细胞是体外增殖能力有限的正常细胞。如将长期培养系突变为HGPRT或TK酶缺陷型的细胞系,在和正常细胞融合后,未经融合或自身融合的骨髓瘤细胞在HAT培养液中死亡;未融合或自身融合的正常细胞在体外生存能力有限最终也死亡。因此存活下来的只有融合细胞。

5.利用细胞工程制备人源性单克隆抗体的方法主要有哪些?它们的优势与难点何在?

答:主要有:EB病毒转化技术,人-鼠杂交瘤单克隆抗体,人-人杂交瘤单克隆抗体,利用基因组工程构建转人Ig基因组小鼠,严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体。

优势和难点:

1、利用类似于疱疹病毒的EB病毒在体外直接感染人外周血淋巴细胞,使之转化获得永生能力得到人B淋巴细胞系,这些细胞可在体外分泌人抗体。

2、人-鼠杂交瘤的单克隆抗体分泌性能不稳定,多数情况下由于人染色体的丢失导致杂交瘤细胞失去分泌抗体的能力。

3、人-人杂交瘤单克隆抗体可供利用的人骨髓瘤细胞种类非常有限,人的骨髓瘤细胞在融合率、非分泌型方面仍不及小鼠骨髓瘤细胞,而且人不能像小鼠那样进行高度免疫,B淋巴细胞常限于取自外周血(小鼠取自动物脾脏),激活状态不适合做融合;故人-人杂交瘤细胞在融合、融合后的筛选以及融合细胞分泌抗体方面仍不理想。

4、基因组工程构建转人Ig基因组小鼠:改造过的抗体除了构成抗原识别与抗原结合部位的三个互补决定区(CDR)是鼠源的以外,其余部分均是人源的。以后仅需免疫小鼠制作单克隆抗体,但获得

的是人抗体而非小鼠抗体。该技术难度较大,但已有成功的报道。

5、严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体:将人免疫干细胞移植到SCID小鼠体内,SCID小鼠获得了人的免疫系统。这种小鼠可用任何抗原免疫,从激活的淋巴细胞中富集抗原特异性人源性B淋巴细胞,进一步进行细胞融合或制备抗体库

6.简述单克隆抗体在临床诊疗中的应用。

答:理论研究,构建B淋巴细胞杂交瘤可用于分析B细胞的多样性及其产生机理,并能分析免疫应答中抗体的多样性。利用单克隆抗体可进行表位分析:利用单克隆抗体的交叉反应,能帮助找出大分子之间在重要结构和生物学上的关系,因为对一种单克隆抗体起反应的几种大分子一定具有相同和相似的抗原决定簇。

诊断试剂中的应用,针对HIV、乙肝等疾病的单克隆抗体,测定妊娠的hCG单克隆抗体、测定排卵的LH单克隆抗体在市场上大量供应。

疾病治疗上的应用,单克隆抗体有可能作为体内应用的单克隆靶向制剂的载体。

第四章哺乳动物胚胎工程

1.什么是胚胎工程?其主要内容包括哪些?

答:胚胎工程(embryonic engineering) 是指对配子或胚胎进行人为地干预,使其环境因素、发育模式或局部组织功能发生量和质的改变。与基因工程、细胞工程、蛋白质工程等一样,是生物工程的一个分支。研究的对象主要是雌雄配子(卵和精子)以及早期胚胎。

其主要内容包括:体外受精技术,胚胎移植技术,胚胎分割技术,早期胚胎体外培养技术,胚胎冷冻保存技术,动物性别控制技术。

2.什么是体外受精技术?它与人工授精技术有何不同?

答:体外受精( IVF)是指在体内或体外成熟的卵母细胞同体内或体外获能的精子,在体外环境中完成其受精的技术过程,受精卵经体内或体外培养、移植后妊娠产仔。由于精卵结合的受精过程是在实验室进行的,故又称为“试管动物” (test tube animal)。包括:卵母细胞的采集、卵母细胞的体外成熟、精子的获能处理、体外受精、受精卵的体外培养、胚胎移植。

人工授精(AI)也称为人工输精,是指通过人为的方法将动物(或人)的新鲜或冷冻精液输入到雌性动物(或人)的生殖道内,使之受孕,以代替自然交配过程。

3.简述胚胎移植技术的原理与一些关键技术的特点。

答:胚胎移植(embryo transfer, ET)是指一头(只)雌性动物(供体)发情排卵并经配种后,在一定时间内从其生殖道(子宫或输卵管)取出胚胎;或者是由体外受精获得的胚胎,然后把这些胚胎移植到另外一头与供体同期发情,但未经配种的受体动物生殖道的相应部位(子宫或输卵管),外来

胚胎在受体子宫着床并继续生长发育,最后出生供体的后代,即通常所说的“借腹怀胎”。

胚胎移植技术主要技术环节:供体动物的超数排卵,供体、受体动物的同步发情,供体母畜的配种或人工授精(人工输精),胚胎的采集(包括手术回收和非手术回收),胚胎的检查与质量鉴定,胚胎移植(包括手术移植和非手术移植),受体动物的观察和饲养管理

4.胚胎分割和胚胎嵌合技术有何不同,这些技术的原理是什么?

答:胚胎分割是哺乳动物胚胎工程的重要组成部分。胚胎分割就是将一枚胚胎通过显微操作的方法分割为二、四或八,经体内或体外培养,然后移植入受体,以获得同卵双胎或同卵多胎后代。也即把一枚胚胎无性繁殖为多枚,是最简单的动物克隆方法。嵌合体技术在胚胎工程领域中,是指由两枚或两枚以上的胚胎(同种或异种动物)的全部或部分细胞聚合在一起,使之构成一个新的胚胎,并将胚胎移植到受体动物让其继续发育形成一个嵌合体后代的技术,出生的动物具有亲本动物的全部或部分性状。

胚胎分割主要方法:A. 显微操作仪分隔法;B. 徒手分割法

嵌合体制作方法:

A.卵裂球(胚胎)聚合法:该法是用两枚或两枚以上发育阶段相同或不同的胚胎卵裂球(或

胚胎)相聚合培育嵌合体个体。该方法要求相互聚合的胚胎发育时期不能相差太远,ES

细胞无法用该方法得到嵌合体。

B. 细胞注入法:该法是用显微操作的方法将供胚细胞或内细胞团注入受体胚的囊胚腔内发

育成嵌合体。该方法操作繁琐但效率高,可以用于发育时期相差甚远的胚胎和ES细胞制作嵌

合体。该方法可以用来定向制作由不同来源的ICM和滋养外胚层细胞够成的嵌合胚。

5. 制备嵌合体动物的主要技术方法有哪些?试述其主要技术过程。

答:嵌合体制作方法:

A. 卵裂球(胚胎)聚合法:该法是用两枚或两枚以上发育阶段相同或不同的胚胎卵裂球(或胚胎)相聚合培育嵌合体个体。该方法要求相互聚合的胚胎发育时期不能相差太远,ES细胞无法用该方法得到嵌合体。

B. 细胞注入法:该法是用显微操作的方法将供胚细胞或内细胞团注入受体胚的囊胚腔内发育成嵌合体。该方法操作繁琐但效率高,可以用于发育时期相差甚远的胚胎和ES细胞制作嵌合体。该方法可以用来定向制作由不同来源的ICM和滋养外胚层细胞够成的嵌合胚。主要有ICM注入法和ICM重组法两种。(1) ICM注入法——通过显微操作将供体胚的内细胞团(ICM) 或分离的ICM的单个细胞注入受体的囊胚腔,以此培育成嵌合体个体。(2) ICM重组法——为了解ICM的发育分化潜力及其影响因素,采用从受体囊胚中去掉原有的ICM,移入新的ICM,称为囊胚重组(Reconstitution of blastocyst),或称ICM置换(ICM exchange)。

6、胚胎培养中:血清——是胚胎培养中添加的主要蛋白质,在保持细胞的存活、促进生长、维持

细胞pH及渗透压的稳定、增加细胞弹性及膜的完整性方面都有重要作用。牛血清白蛋白是培养液中常添加的一种蛋白源物质,牛血清白蛋白能结合培养液中的一些胚胎毒性物质,对胚胎有保护作用。

7、卵母细胞和胚胎的冷冻保存,广义讲,就是设法在体外或体内把卵母细胞或胚胎暂时贮存起来而不使其失去活力。狭义讲,卵母细胞和胚胎保存是指把卵母细胞和胚胎放在低于正常发育温度下,使细胞的新陈代谢和分裂速度减慢,甚至完全停止,使其处于暂时停顿状态;一旦恢复到正常发育温度时,卵母细胞和胚胎又能继续发育下去。

8、卵母细胞和胚胎的超低温冷冻保存主要有四种方法:慢速冷冻、快速冷冻、一步冷冻和玻璃化冷冻。

9、胚胎冷冻效果的鉴定:形态学鉴定、染色鉴定、培养鉴定、移植鉴定。

10、卵母细胞和胚胎冷冻保存的意义:1、保存种资资源,对珍稀、濒危动物的保护具有重要意义;

2、促进胚胎移植的应用与推广,使胚胎移植可以在任何时间、任何地点进行

3、实现了胚胎的远距离运输,解决了活体大家畜引种的困难,同时减少了疾病的传播,促进了国际间良种的交换;

4、卵母细胞的冷冻保存为体外受精、核移植、基因转移等技术的研究提供了充足的卵母细胞,促进这些技术的发展。

第五章干细胞与组织工程课后习题答案

1.依据细胞的分化潜能干细胞可分为哪几种类型?各类干细胞有何特性。

答:依据干细胞的分化潜能,可分为三种类型:全能性干细胞(Totipotency Stem Cells)、多能性干细胞(Multipotency Stem Cells)、单能干细胞(Monopotency Stem Cells) 。

全能性干细胞具有形成完整个体的分化潜能;多能性干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能,但却失去了发育成完整个体的能力,发育潜能受到一定的限制;单能(定向)干细胞(也称专能或偏能干细胞),这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化,多数的组织或器官干细胞属于这一类。

2.什么是胚胎干细胞?常用的胚胎干细胞分离方法有哪些?

答:胚胎干细胞(Embryonic stem cell)是指受精卵分裂发育成囊胚时,内层细胞团(Inner Cell Mass) 的细胞经分裂培养,即得到胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性,可以自我复制(或更新)并具有分化为体内所有组织的能力。它是一种高度未分化细胞,具有发育的全能性,能分化出成体动物的所有组织和器官,包括生殖细胞。包括畸胎瘤细胞(teratocarcinoma cells, EC)胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES)原始生殖细胞(primordial germ cells, PGC或EG)。

常用的胚胎干细胞分离方法有:A. 来源于早期胚胎的内细胞团;B. 从原始生殖嵴分离培养;C. 利用体细胞核移植的方法建立;D. 利用细胞融合方法;E. 利用单个卵裂球制备胚胎干细胞;F. 来源于孤雌生殖胚胎;G. 利用基因转移技术从成纤维细胞诱导产生。

3.胚胎干细胞有何特性,如何验证胚胎干细胞的全能性?

答:胚胎干细胞具有全能性,可以自我复制(或更新)并具有分化为体内所有组织的能力。胚胎干细胞的鉴定:

①形态学检测:细胞呈圆形、核大、胞浆少;细胞排列紧密,呈集落形生长;集落常呈岛状、

巢状。

②遗传学检测:为正常的二倍体核型;

③酶活性检测:ES细胞内端粒酶和碱性磷酸酶活性高;

④细胞表面标志物检测:ES细胞膜表面有特殊的标记:如,OCT-4,SSEA-3, SSEA-4等;

⑤体内分化潜能:植入裸鼠皮下,可诱发形成畸胎瘤;可分化为三个胚层的细胞;能参与嵌

合体的形成;

⑥体外分化潜能:可形成类胚体,可在体外诱导分化为三个胚层的细胞。

4.什么是成体干细胞的可塑性?成体干细胞的可塑性有何用途?

答:来源于各种组织的成体干细胞事实上并未定型,它们的分化潜能远较先前所认为的要宽,一旦处于一个新的微环境中,它们将有可能分化为其它类型的细胞;干细胞生物学家们将这种现象称为成体干细胞的“可塑性” (plasticity),也有人称为干细胞的“横向分化”或“跨系分化” (transdifferentiation)。

成体干细胞的可塑性给干细胞生物学的研究注入了新的活力。与胚胎性干细胞相比,它避开了胚胎干细胞研究所面临得伦理道德问题,吸引了更多的人力和财力,有关它的研究报道也日益增多。

第六章核移植与动物克隆

1.简述细胞核移植技术的主要类型及其主要操作技术。

答:细胞核移植(nuclear transfer 或nuclear transplantation)是指通过显微操作的方法,将供体细胞的细胞核放入预先去核的成熟卵母细胞或早期合子内,形成一个新的核质重组体,移入的核在受体胞质的作用下,发生发育程序重编(reprogramming),使得核质重组体与正常受精卵一样,经细胞分裂、分化并在母体内发育成一个新的个体。

依据供体细胞类型分为:胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植、体细胞核移植;依据供体细胞与受体卵母细胞的来源分为:同种核移植、种间核移植。

主要操作技术:1. 受体卵母细胞的准备:超数排卵、活体采卵、屠宰后母畜卵巢上采卵(体外成熟)2. 供体细胞的准备:16-32 期胚胎、供体卵裂球。3. 卵母细胞的去核与注射4. 重组胚的融合:构建的重组体用直流电脉冲进行电融合5. 重组胚的激活:电激活、乙醇激活、钙离子和钙离子载体激活、离子霉素(ionomycin)激活、Sr2+ 激活6. 重组胚的培养与胚胎移植。

2.讨论核移植技术的应用现状及其发展前景?

答:1. 体细胞克隆在生产转基因动物和医学领域的应用;2. 体细胞克隆技术在农业生产中的应用;3. 商业性克隆动物;4. 体细胞克隆在珍稀、濒危动物保护中的应用;5. 体细胞克隆在人类再生医学上的应用;6. 体细胞克隆在基础研究中的应用

3.分析影响动物核移植成败的关键因素。

答:影响体细胞核移植成功率的因素有:供体细胞的因素;受体卵母细胞的因素;核移植方

法的影响;激活方法的影响;体外培养系统的影响;受体动物管理及胚胎移植的影响;新生

动物护理及管理的影响。

第七章基因转导与转基因动物

1、什么是转基因动物?

答:转基因动物(trnasgenic animal):是指借用基因工程技术将外源基因导入动物染色体内,使外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增,在动物体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。生产转基因动物的方法主要有原核(显微)注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、精子载体导入法、细胞核移植法等,应用较多的方法为原核(显微)注射法。

2、制备转基因动物有哪些主要方法?简述其主要原理和技术过程。试比较这些方法的优劣。

答:主要有:生产转基因动物的方法主要有原核(显微)注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、精子载体导入法、细胞核移植法等,应用较多的方法为原核(显微)注射法。

显微注射法:基本原理——通过显微注射仪将外源基因直接注射到受精卵的雄原核内,使使外源基因整合到DNA中,发育成转基因动物。步骤:①目的基因的制备与纯化;②卵供体母体和假孕母体的准备;③超排卵与取卵;④基因显微注射;⑤受精卵移植;⑥目的基因的表达整合鉴定和检测;

⑦建系。优点:外源DNA分子大小基本不受限制,外源DNA在宿主动物染色体上整合率高,方法相对简单,导入直观。但利用DNA显微注射法得到的转基因动物都是随机整合的,用该方法很难得到同源重组动物。

逆转录病毒法;P144 胚胎干细胞转导法;P145 精子载体法;P145 细胞核移植法P145

3、追踪转基因动物研究的发展,并预测其应用前景。

答:自1981年,第一次成功地将外源基因导入动物胚胎,创立了转基因的动物技术。1982年获得转基因小鼠。转入大鼠的生长激素基因,使小鼠体重为正常个体的二倍,因而被称为"超级小鼠"。以后相继在10年间报道过转基因兔、绵羊、猪、鱼、昆虫、牛、鸡、山羊、大鼠等转基因动物的成功。由于转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离,使基因能在种系关系很远的机体间流动,它将对整个生命科学产生全局性影响。因此转基因动物技术在1991年第一次国际基因定位会议上被公认是遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术,被列为生物学发展史上126年中第14个转折点。

应用前景:改良动物的性状,培育新品种制作“生物反应器”,生产医用蛋白基因治疗和建立人类疾病的动物模型,生产人类器官移植的代用品,基因治疗,基础理论研究中的应用(1). 基因表达与调控研究(2). 基因功能的研究

5、动物克隆技术于转基因技术结合将发挥哪些特殊的优势?

6、简述主要胚胎工程技术间的联系。

7、简述近年来动物细胞工程方面的重大研究进展,说明其意义何在?

第八章动物染色体工程

1、什么是染色体工程?动物染色体工程主要包括哪些内容?

答:染色体工程(chromosome engineering)是人们按照一定的设计,有计划地应用染色体组合并、单条染色体或染色体片段的附加、代换、消除和易位等技术,实施对生物的染色体组或染色体结构进行改造,从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。动物染色体工程主要包括:人工诱导多倍体,指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体而言。由于多倍体动物具有生长速度快,成活率高及抗病能力强等特点,所以人工诱导多倍体、改善动物经济性状倍受重视。雌核发育,是单性生殖的一种,指卵子依靠自己的细胞核发育成个体的生殖行为。雄核发育,是指通过物理和化学等方法破坏卵核的遗传物质,使其失去活性,依靠精子核发育成胚胎的生殖方式。人工染色体,基于ARS、CEN、TEL是线性染色体稳定的功能序列,人们利用这些序列构建载体,重组后的DNA 以线性状态存在,这样不仅稳定,而且大大提高了插入外源基因的能力,并且可以像天然染色体一样在寄主细胞中稳定复制和遗传,称为人工染色体,包括:酵母人工染色体,细菌人工染色体,哺乳类人工染色体。

2、动物染色体加倍技术主要有哪些?比较它们各自的特点及其适用对象。(P157)

答:化学方法:秋水仙碱:可以抑制细胞分裂中纺缍丝的形成,因而抑制有丝分裂。细胞松驰素B:能抑制肌动蛋白聚合成微丝,从而抑制细胞的胞质分裂。其它药物:麻醉剂N2O 、聚乙二醇等。物理学方法:温度休克法——包括冷休克法和热休克法两种,即用略低于或略高于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。此法廉价、易操作,是诱导动物细胞多倍体化的常用手段,也有利于养殖场大规模生产使用。一般来说,冷水鱼类(如鲑科)应用热休克法,而温水鱼类用冷休克效果好。静水压法——就是采用较高的静水压(65kg/cm2)来抑制第二极体的排出或第一次卵裂产生多倍体。此种方法诱导率高(90%~100%)、处理时间短(3~5min),对受精卵损伤小、成活率高。但该法需要专门的设备——水压机,成本较高,其样品室容量有限,处理卵的量有限,所以不适于大规模生产。生物学方法:Rasch等(1965) 年首次证明了三倍体脊椎动物可以通过杂交产生,

他们将雌核发育的二倍体帆鱂(Poecilia formosa)与P. Vittate杂交,得到三倍体后裔。雌性草鱼(2n=48)与雄性三角鲂( 2n=48)杂交获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体,其中草鱼提供了二倍数目的染色体(48),三角鲂提供了单倍数目的染色体(24)。异育银鲫与兴国红鲤杂交获得的复合四倍体,通过细胞方法证明其产生的原因是受精卵发生了两性融合。

3、简述多倍体育种的鉴定方法。

答:(1) 直接法:染色体计数:鉴定多倍性的最准确、最直接方法DNA含量测定:流式细胞仪(2)间接法:核体积测量:二倍体/三倍体核体积之比为1:1.5,二倍体与四倍体的核体积之比为1:1.74。蛋白质电泳:生化分析:如在关东银鲫中,三倍体红血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍体,比率为1.68;己糖激酶与磷酸果糖激酶活性也较高,比率为1.26和1.35。

4、比较几种人工诱导雌核发育方法的原理及其特点。(P160)

答:一,精子遗传物质的失活:

物理方法:采用物理辐射如 射线、X射线和紫外线等处理,诱使精子染色体断裂,使精子的遗传物质失活。

化学方法:采用化学物质如甲苯胺蓝、乙烯尿素和二甲基硫酸等消除精子染色体遗传活性的方法。显微手术法:采用显微操作,直接去除受精卵中雄性原核并诱导雌原核加倍形成二倍体。

二,细胞分裂的阻止:人工诱导雌核发育除使精子遗传物质失活外,还必须解决雌核染色体二倍化的问题。保留受精卵第二极体或阻碍受精卵早期有丝分裂,是解决二倍体化常见的两种途径。常用温度休克法(冷休克和热休克)、流体静水压法和化学试剂处理(如细胞松驰素B)来阻止极体的排出或有丝分裂,以达到雌核染色体二倍体化目的。

5、何为人工染色体?它的主要构成元件是什么?

答:基于ARS、CEN、TEL是线性染色体稳定的功能序列,人们利用这些序列构建载体,重组后的DNA以线性状态存在,这样不仅稳定,而且大大提高了插入外源基因的能力,并且可以像天然染色体一样在寄主细胞中稳定复制和遗传,称为人工染色体。主要构成元件是:自主复制DNA序列、着丝点DNA序列、端粒DNA序列。

6、酵母人工染色体如何构建?它在基因组研究中发挥了何种作用?

答:酵母人工染色体的构建包括:大片段DNA的获取、Y AC重组体的构建、YAC重组体对酵母的转化、Y AC基因库的鉴定、目的基因Y AC克隆的筛选、目的基因YAC克隆的鉴定。