最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法
一、实验准备
1．标本制备：
2．最小化非特异性结合：
二、凋亡
1．凋亡的检测方法：网站和其它
2．PI染色法
3．Annexin V 法
4．TUNNEL法
三、细胞因子
1．激活的细胞因子
2．CBA
四、血小板
1．活化
2．活化检测
3．网织血小板
五、红细胞
1．网织红细胞
2．PNH
3．胎儿红细胞
六、肿瘤学
1．DNA 细胞周期
2．蛋白
3．多药耐药
4．微小残留白血病
第一部分标本处理
一、流式细胞术常规检测时的样品制备
(一)直接免疫荧光标记法
取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法
取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法
1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。
3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。
通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。
4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或细胞
与正常血清一起培育应选择优先加入第一抗体。在此情况下，即使在随后的步骤中用完所有的抗体分子，FC受体决定的背景影响已不再重要。
5．其它：已标记的抗体和其他一些内在的免疫球蛋白或加入实验系统中的其它物质的交叉反应也可能会有背景影响。为了降低背景，在多重标记过程中，所有的已标记的抗体应被吸附，避免其他种类蛋白的交叉反应。
第二部分细胞因子
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
一、简介
随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－)与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点：?快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需6-8小时，实际操作时间为1-2小时，快速简便；
?简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs；
?灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统；
?高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析；
?安全：减少样本处理与生物源性污染
?接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映了体内状况。
二、所需仪器
1. 流式上样管及细胞培养皿或板
2. 25%CO2，37℃孵箱
3. 混匀振荡器
4. 离心机
5. 加样器、Tips
6. 流式细胞仪
三、常用的标本类型和处理方法
全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA和ACD 抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后，分离PBMCs，24小时内分析。
组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用Ficoll分离PBMCs，将细胞重悬于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640培养基中，调节细胞浓度为2×106细胞/ml。
细胞系与T细胞克隆：调节细胞浓度2×106细胞/mL于新鲜培养基中。
冰冻全血与PBMCs：使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重悬，－70℃冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。
四、所需试剂
1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂
依据实验需要选择特殊表面标志
CD45圈定所有淋巴细胞
CD3 圈定T淋巴细胞
CD4 圈定T辅助淋巴细胞亚群
CD8 圈定T抑制淋巴细胞亚群
CD19/或CD20圈定B淋巴细胞
CD56圈定NK淋巴细胞
CD14圈定单核细胞
2、荧光标记的细胞因子抗体：R&D提供FITC、PE和APC标记的细胞因子抗体
3、溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素（R&D目录号WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目录号00-4333）溶解红细胞
4、激活剂
①Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)（Alexis，目录号ALX-445-004-M001）
A. DMSO中调节浓度0.1mg/mL
B. 分装(20L)，－20℃储存。勿反复冻融
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液
D. PMA终浓度25ng/mL细胞悬液
②Ionomycin （Alexis,目录号ALX-450-006-M001）
A. 于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL
B. －20℃储存
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液
D. Ionomycin终浓度1g/mL细胞悬液
③Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)
A. 无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL
B. 4℃储存
C. SEB终浓度10g/mL细胞悬液
④CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞
⑤CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml
5、阻断剂
阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内
①Brefeldin-A(BFA) （eBioscience，目录号00-4506）
A. 于DMSO中调节浓度5mg/mL
B. 分装(20L)，-20℃储存。勿反复冻融。
C. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液
D. 激活最后4－5小时BFA终浓度10g/mL细胞悬液。
注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降
②Monensin （eBioscience，目录号00-4505）
6、不含谷氨酰胺的RPMI-1640
7、固定剂：细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目录号00-8222）
8、破膜剂：含1％皂甙、0.05％叠氮化钠的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目录号00-8333）
将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合
9、其它试剂：无菌无叠氮钠PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。
五、细胞培养和刺激的基本方法
细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。
人IFN-
人TNF-
人IL-1
人IL-1
人MIP-1/CCL3
人MIP-1/CCL4
小鼠IL-4方法10
小鼠IL-5方法10
小鼠IL-6方法11
小鼠IFN方法9 or 方法12
小鼠TNF-方法9
为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂(如3uM monensin，10mg/ml的BFA)
方法1: 只使用转染细胞检测
方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.
方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.
方法4: 人的PBMCs或者纯化的CD4＋细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10 ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目录号204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时
方法5: CD4+ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days
方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1 (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)
方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激
方法8: PBMCs细胞使用重组人IFN (10 ng/ml，目录号285-IF-100) 刺激2 小时，然后使用IFN (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.
方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中，使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时
方法10: CD4＋T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体，重组小鼠的IL-2（10 ng/ml，目录号402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目录号404-ML-005）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。
方法11: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时
方法12: 小鼠脾细胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）
1、收获细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时
加蛋白转运抑制剂（参照说明书），混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时
2、阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色
①在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞
的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。
②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化
Ig或者血清进行阻断
3、细胞表面染色
①加适当的细胞表面染色试剂20L于Falcon管中，加入100L激活后的全
血(细胞浓度维持在2×106/mL) 混匀，室温暗处孵育15分钟；
②加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血
不完全。）
③离心500g 5分钟，弃上清
4、固定和破膜
①加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清；
②加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书）
③加23mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。
5、细胞内染色
①加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。
②加23mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500LPBS上机或加入500L
1% PFA固定后再上机
七、注意事项
1. 标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制
钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
2. 刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时
间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin 同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病人的CD4抗原会因PMA 的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析
3. 选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少荧光设置以下对照：
①未刺激对照：激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激
活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。
②激活对照：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未
达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
③同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型
的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
4. Fc受体阻断：使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，在小鼠
可以用纯化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience, 目录号14-0161-81），在大鼠可以用纯化的抗大鼠的CD32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。
5. 荧光素的选择：检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC标记；
单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记；同时检测多种细胞因子时，弱表达的应选用PE或APC，FITC标记最好用于高表达细胞因子如IFN-γ
八、问题与解答
Th1/Th2细胞研究方法
尽管目前提出了较多的Th1/Th2细胞表面标志，但根据淋巴细胞因子谱的异同识别Th1和Th2细胞仍然是目前最有效的手段，特别是细胞内因子标记的流式细胞技术。近来由于细胞因子ELISA试剂盒的不断涌现，为研究Th1/Th2细胞因子谱的变化提供了准确、可靠、快速的测定方法。但研究CD4+淋巴细胞细胞因子谱变化时需要将T淋巴细胞特异克隆。最近发现，在外周血白细胞中，除CD4淋巴细胞外，CD8细胞也存在Th1和Th2样细胞因子谱的变化，甚至酸性粒细胞也具有产生多种细胞因子的能力，如酸性粒细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα、TGF等。因此单纯通过细胞因子谱的变化难以有效识别Th1和Th2细胞。
根据T辅助淋巴细胞(CD4)分泌的细胞因子谱(cytokine profiles)的不同,将CD4细胞分为Th1和Th2亚群。Th1细胞主要分泌γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β),介导细胞免疫应答；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10及IL-13等因子，促进抗体的产生，介导体液免疫反应。在多数免疫反应中，T辅助淋巴细胞并不产生典型的Th1或Th2细胞和相应的细胞因子，而主要是由Th0细胞分泌的混合型的细胞因子。但在疾病的状态下，Th0细胞受特异抗原的刺激时，一方面向Th1方向发展，另一方面可能向Th2方向发展。如在结核感染转状态下可产生Th1和Th2双向免疫反应，在I型超敏反应疾病时主要产生以Th2为主的免疫反应。近几年来研究发现，Th1/Th2平衡失调参与多种疾病过程，如肿瘤免疫、移植免疫及变态反应等，而用流式细胞仪进行Th1/Th2的检测克服了传统方法所得结果为整个群体分泌数值不能区分单个细胞或亚群的反应的不足，通过表面染色多参数分析可以区分表达特定细胞因子的细胞亚群。一般用CD3+/CD4+ 或CD3+/CD8-作表面标记，选择相应的荧光标的抗体，
Th1和Th2细胞分泌细胞因子的情况如下：
全血
标本
经过
刺激
培养、
表面
标记、固定、破膜、胞内染色（IQ，Cytodetect?kit(basic)，CAT方法，IQP-367）后结果如下：
正常全血标本用流式细胞仪检测细胞因子的参考值
一批健康志愿者的全血用PMA+Ionomycin刺激5小时后，按照操作程序测得
第四部分流式细胞术分析血小板
流式细胞术分析血小板
血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病理生理过程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。使用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术，它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法，丰富了血小板功能评估指标。
一、流式细胞仪血小板分析应用范围
1. 通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成，分析血小板活化，血小板对刺激物的反应性。
2. 通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测，
分析血小板止血功能的获得性和遗传性缺陷。
3. 结合血小板大小，检测血小板RNA含量，分析血小板成熟度，计数网织
血小板。
4. 发现血小板抗体，做定性和定量分析。
二、血小板分析的临床意义
1. 血栓性疾病：活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血
事件的危险性，非风湿性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化，胰岛素依赖性糖尿病，子痫前期，外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板，而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA2的体外激活能力降低。
2. 血小板缺陷性疾病：全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来
诊断血小板膜糖蛋白缺陷性疾病，如巨大血小板综合征，血小板无力症等。
最详细地流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2 存在的条件下，将新鲜组织或片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN 3
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞
最新流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/ mL以1mL接种于100mm培养皿内 ↓ 24h后，进行所需的处理（比如加药,照射） ↓ 特定时间后终止培养，进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml 离心管中 ↓ 1000rpm离心5min（短时低速离心） ↓ 弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细胞 悬液内的细胞碎片 ↓ 加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。 ↓ 1000r/min,离心5min ↓
将乙醇吸除，加PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去 ↓ 吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶（0.25mg/ml）(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min ↓ 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机（先开仪器后开软件） ↓ 流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统；②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上
↓ 流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm激 发光源） ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞DNA分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例） ↓ 在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出 结果分析——Modfit软件分析
FACAria流式细胞仪操作程序
、准备工作 1，清洗偏转板，防止盐离子影响电荷加载，电流偏转。 1）用超纯水沾湿医用棉签，擦拭偏转板所有金属物件。再用干棉签擦干。 2）5ml 注射器吸超纯水，清洗缝隙。用滤纸先吸水，再用干棉签擦干。 2，鞘液桶加液 3, 喷嘴超声，喷嘴放入超纯水中，超声2min。用滤纸吸干水分，晾干。 二、开机启动 1, 启动电脑，密码BDIS,点开软件，无密码 2，机箱侧面依次打开总机开关，蓝色、红色激光。 3, 液流启动：Cytometer --- FiuidSetup 1 ）气路（透明管）、液路（蓝色管） ,从乙醇桶上拔下,插到鞘 液桶 2）闭合喷嘴从侧面放入到喷嘴位置,旋转至12 点方向 3）取下闭合喷嘴 4）将超声过的喷嘴放入喷嘴位置。 4, 喷嘴压力切换：菜单栏中Sort---SortSetup --- 70um （选择当前使用的喷嘴大小） 5, 液流调整：
点开电脑界面中70um图标栏里的Stream，从打叉状态变为打勾。查看是否都处于正常状态：1）打开仪器机箱，查看液流是否流到废液槽。如果偏离，拧开两边的螺丝，左右推动使液流到达槽内，拧好螺丝。 2）查看电脑界面，液流图像是否稳定，如果有黑白灰图片变化，用棉签擦拭偏转板上方 3）查看电脑界面，液流是否在中央，如果不是，可以手动调整仪器摄像头，或者重新插好喷嘴。 4）机箱中查看激光束是否完好通过，用干棉签挡住通过位置，如果看到激光射出，则正常。然后关闭主机箱外盖。 调整液流：通过调整振幅来实现。 1）振幅Ampl,数值调大，使液流断滴在上1/3处，即2滴连续液流。 2）频率Freg ，一般不动。 3）Gap：当喷嘴为70um时，数值一般为7、8、9。100um时，为10, 、11 、12。 4）当Ampl和Gap都稳定时，把实际值（后面）手动输入到确定值的框内（前面）。 5）点击StreamSpot ，锁死数值，保持液流稳定。 Dropl :实际值和确定值，变化幅度保持在10以内。 Gap：实际值和确定值，变化幅度保持3以内。此视为稳定液流。 三、手动调补偿： 样品：Negative （双阴管），FITC（单阳），PE（单阳）
《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)
Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。 备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件：CellQuest Pro 软件，选择“联机”。 1.
（2）对实验样本进行命名； （3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。 备注：如果界面被关闭，重新调出步骤： 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形），将 更改横纵坐 备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC 。 （1一般获取10000个细胞。 （2 （ 3）将所有补偿调为0 （4）将非 52 （5）FSC和SSC （6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个 散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过移动通
流式细胞仪操作方法
一、样品制备 1、取样（大约1×106 cells），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl的Rnase（GenScript试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl的PI染液（GenScript试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells， 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow），拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。结束后自动STANDBY，5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H（选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)
流式细胞仪操作方法
—、样品制备 1、取样（大约lx cells）,离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1 ml 70%的冷乙醇固定细胞，-20°C冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100|j 啲Rnase （GenScript试剂A）, 37°C水浴30min,然后再加入400』的PI染液（GenScript试剂B）,在4°C避光条件下孵ff30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2xl04cells, 二、上流式测细胞 1」、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属扌当板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow）,拧紧鞘液桶盖，安上金属扌当板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖, 检查所有管路是否妥善安責。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBYo如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS）,等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、将压力阀責于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowce呻的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流岀）。结束后自动STANDBY, 5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest,最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis, X参数和丫参数分别取FSC-H、SSC-H （选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type选择Acq-onalysis, X 参数选择FL2-H 1024（此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光，本实验使用PI作为荧光染料，故选择FL2-H） Y Parameter Plot Source： |< Select File... X Parameter Mie：| Acquisition
流式细胞仪使用方法
流式细胞仪的使用方法及相关资料 仪器名称：流式细胞仪 生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司 使用方法： 一．开机程序 1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。 2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。排出过滤器内的气泡。 4．如果需要打印，打开打印机电源。 5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。 6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。 7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。 做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。 二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files) 1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。 2．选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的x轴和y轴参数。 3．选取屏幕左列绘图工具中的Histogram，同上法可绘出Histogram（直方图）。4．将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。 本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest \EXP文件夹中，ACQ用于细胞DNA检测，EXP用于细胞表面标志分析。 三．用CELLQuest进行仪器的设定和调整 1．从苹果画面中选取CELLQuest，进入CELLQuest后在File指令栏中打开合适的获取模式文件。 2．从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Connect to Cytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机。将出现的Acquisiton Control对话框移至合适位置。3．从Cytometer指令栏中，开启Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status 等四个对话框，并将它们移至屏幕右方，以便获取数据时随时调整获取条件。也可以用+1，2，3，4获得此四个对话框。 4．在Detectors/Amps对话框中，先为每个参数选择适当的倍增模式(amplifier mode)：线性模式Lin或对数模式Log。一般进行细胞表面抗原分析如分析外周
流式细胞仪
1、流式细胞术(英文flow cytometry)是一种生物学技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。这种技术可以用来对流过光学或电子检测器的一个个细胞进行连续的多种参数分析。 目录 * 1 原理 * 2 流式细胞仪(flow cytometer) * 3 应用 * 4 参见 原理 一束单色光（通常是激光）照到流体力学聚焦的一股流体上。若干个检测器瞄向流束和激光相交的这个点，其中一个和激光在同一直在线（称作前散射(FSC)），其它几个和激光垂直（旁散射(SSC)和一个或几个荧光监测器）。当每个悬浮颗粒通过光束时会按某种方式把光散射，同时所带有的荧光化合物被激发并发射出频率低于激发光的荧光。这些散射光和荧光的组合数据被检测器记录，根据各检测器亮度的波动（每个细胞会显出一个散射或荧光的峰）就能够推算出每个颗粒的物理和化学性质。前散射与细胞体积相关，而旁散射取决于颗粒的内部复杂程度（比如核的形状、胞质内颗粒的种类或者末的粗糙程度）。 可以检测的参数有： 细胞的体积和形态复杂程度、细胞中的色素、DNA（细胞周期分析、细胞动力学、细胞增殖等）、RNA 染色体分析和分选（文库构建、染色体涂染）、蛋白质、细胞表面抗原（CD标记）、胞内抗原（各种细胞因子(cytokine)、次级媒介等）、核抗原、酶活性、pH，胞内离子化的钙、镁，膜电势、膜流动性细胞凋亡(apoptosis)（定量检测DNA降解、线粒体膜电位、通透性变化）、细胞存活能力、监测细胞电通透性、氧爆作用(oxidative burst) 、研究癌细胞中的多重耐药性(multi-drug resistance, MDR) 、谷胱甘肽、各种组合（DNA/表面抗原等等） 流式细胞仪(flow cytometer) 流式细胞仪又称荧光激活细胞分选器、荧光活化细胞分类计（FACS，Fluorescence Activated Cell Sorter）。现代的流式细胞仪每秒可以实时检测几千个颗粒，并且可以主动分离具有不同特性的颗粒。 流式细胞仪和显微镜比较像，但能够对大量的单个细胞利用一组参数进行高通量的自动量化。固体组织需要在检测前制备成单细胞的悬浮液。 一个流式细胞仪包括五个组成部分： * 细胞流动系统：液流（鞘液(sheath fluid)）携带细胞，使颗粒以串流形式通过光束。 * 光源：有通常的灯（汞或氙）、高功率水冷的激光源（氩、氪、染料激光）、低功率气冷激光（氩(488nm)，红氦氖(633nm)，绿氦氖，氦镉(紫外)）、偶极激光（蓝、绿、红、紫）。 * 检测和模数转换(analogue-to-digital conversion, ADC)系统：产生前散射、旁散射光和荧光的信号。 * 放大系统，线性或对数放大。 * 计算机，用于分析信号。 早期的流式细胞仪主要是实验设备，但目前仪器和相关的试剂有了很广的市场。不同厂商的仪器特性也不同，主要的厂商和品牌如下： * Beckman-Coulter (ex-Coulter): Epics XL/XL-MCL; Epics Altra (Hypersort) (IBM-PC compatible platforms) * Becton, Dickinson: (FACS's): FACSCAlibur, FACScan, FACSort, FASCSVantage (Mac OS platform) FACS Canto, LSRII, Aria, DiVa (PC PLatform) * Cytomation: MoFlo, Cyan (IBM-PC platform) * Partec/Dako: Galaxy; PAS; CCA; PA (IBM-PC compatible platforms) 应用 流式细胞术在很多领域中都有应用，包括分子生物学、病理学、免疫学和海洋生物学等。在分子生物学中，
流式细胞仪操作方法
一、样品制备 1、取样（大约1×106cells ），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl 的Rnase（GenScript 试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl 的PI染液（GenScript 试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells ， 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3 满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLo）w，拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput ）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDB。Y如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell 中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。结束后自动STANDB，Y 5 分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQues，t 最大化，选散点图标，打开，Plot type 选择Acq-analysis ，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H （选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type 选择Acq-analysis ，X参数选择FL2-H 1024（此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实 验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H）
流式细胞仪试验方法2
第四部分流式细胞术分析血小板 流式细胞术分析血小板 血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板减少症等疾病的病理生理过程与血小板相关。血小板功能检测包括黏附、聚集和活化功能试验。使用流式细胞仪检测全血中血小板表面相关标志物是一种新技术，它拓宽了血小板相关疾病的诊断与功能研究方法，丰富了血小板功能评估指标。 一、流式细胞仪血小板分析应用范围 1.通过分析信号传递、细胞骨架结构、颗粒释放、糖蛋白构形、膜磷脂、与抗凝因子的结合和微粒形成，分析血小板活化，血小板对刺激物的反应性。 2. 通过分析受激后表面结合蛋白触发凝血链式反应和表面糖蛋白缺陷检测，分析血小板止血功能的 获得性和遗传性缺陷。 3. 结合血小板大小，检测血小板RNA含量，分析血小板成熟度，计数网织血小板。 4. 发现血小板抗体，做定性和定量分析。 二、血小板分析的临床意义 1. 血栓性疾病：活化血小板的检测能预测冠状血管成形术后发生急性缺血事件的危险性，非风湿 性心房纤颤患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化，胰岛素依赖性糖尿病，子痫前期，外周血管疾病等均可测出血小板活力增加和(或)循环中存在活化血小板，而早产儿的血小板对凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA2的体外激活能力降低。 2. 血小板缺陷性疾病：全血法流式细胞术提供了一个简单、迅速的方法来诊断血小板膜糖蛋白缺 陷性疾病，如巨大血小板综合征，血小板无力症等。前者是由于GPIb-IX复合物先天缺陷所致的血小板形态巨大，功能异常的出血性疾病。后者由于GPⅡb/Ⅲa复合物先天缺陷，导致血小板聚集功能障碍 3. 贮存池疾病：原发性贮存池疾病（δ-SPD）常规用血小板聚集法检测，但特异性和灵敏度均不理想。 检测血小板致密颗粒的阿的平荧光显微镜法，主观性大，操作繁琐，而且一次检测的血小板数目有限。 全血法流式细胞术为δ-SPD的诊断提供了一个简单、迅速的方法，一次能定量检测5 000个以上阿的平染色的血小板。与正常人相比，δ-SPD患者阿的平染色显著下降(从49%降至15%)。常在骨髓增殖异常综合征和晚期肾衰中出现的获得性致密颗粒贮存池疾病，也能用全血法流式细胞术进行检测和诊断。 4. 血小板减少性疾病：破坏过多或生成减少均能导致血小板减少。血小板相关抗体（PAIg）是反 映血小板的破坏的指标，虽然其临床意义仍有争议。PAIg的检测有多种方法，但流式细胞术法有其优越性。流式细胞仪能测定单个血小板上的PAIg，只要测定104甚至103个血小板，在统计学上就能精确地得出PAIg的平均水平，因而用血量少，只要1 ml血液制备的血小板就足够。流式细胞术还能同时测定其他一些反映血小板破坏的指标，如PAIgG、PAIgM、C3等。血小板的生成与巨核细胞有
流式细胞仪操作流程
查看文章 流式细胞仪-细胞凋亡检测Ⅰ 2008-11-01 10:20 一PI单染色法 基本原理 其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面： 1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。 2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。 试剂与仪器 l PBS溶液（配制方法见附录）； l PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4℃避光保存。 l 70%乙醇 l 400目筛网 l 流式细胞仪 实验步骤 1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去
FACSC精编ibur流式细胞仪操作维护规程
F A C S C精编i b u r流式 细胞仪操作维护规程 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
FACSCalibur流式细胞仪操作维护规程 1.目的 规范流式细胞仪FACSCalibur操作维护规程，正确使用和维护仪器，保证检测工作顺利进行和设备安全。 2.适用范围 适用流式细胞仪FACSCalibur的使用操作。 3.职责 操作人员按照本规程操作仪器，对仪器进行正常维护，并作使用记录。 保管人负责监督仪器操作是否符合规程，并对仪器进行定期维护和保养。 仪器管理人以及科室负责人负责仪器综合管理。 4.操作程序 安全操作注意事项和特别提示： 4.1.1该仪器必须有专人保管，使用前需通读仪器说明书。 4.1.2严格遵守操作规程，如仪器出现故障，应马上停止使用，并立即向保管人、仪器管理人以及科室负责人报告，严格按照单位有关制度实施，不得擅自“修理”，查明原因，处理后仪器保管人应及时做好故障情况及维修记录。 设备每日开机程序： 设备质控程序：
4.3.1.1取试剂盒中的Unlabeled试剂，充分混匀，加一滴到装有1ml鞘液的试管中，混匀，标记为unlabeled。 4.3.1.2取FITC、PE、PerCP、Unlabeled试剂，充分混匀，各加一滴到第二支装有3ml鞘液的试管中，混匀，标记为mixed。 上机操作： 4.3.2.1按电脑桌面的FacsComp进入质控程序。 4.3.2.2在出现的“Signin”窗口中输入操作者姓名、单位、领导姓名等相关信息，计算机将保存这些信息；单击“Accept”。 4.3.2.3在试验选项中，选择Lyse/No-Wash(LNW)：免洗程序。 4.3.2.4在CalibriteBeadsLotIDs中,根据每种颜色的beads所对应的LotIds，输入编号，此编号在Calibritebeads试剂盒内，打开新买的试剂盒，里面有一张橙色胶纸，取出贴在试剂盒的背面，标题是Calibritebeads3BatchNO,选择FACSFlowSheath下的编号(右侧的编号)。APCLotID(此栏不能空，即使是三色校正试剂)。 4.3.2.5在右侧的保存选项中文件会自动保存,路径Facstation\BDfile\FACSComp\DDMMYY,还可以单击“Location”改变文件保存路径。 4.3.2.6按Run开始上样，在仪器面板上按RunHi。高速运行，速度不能低于400个细胞/秒，速度过低可在管中加一滴微球。
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。 备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件：CellQuest Pro 1.软件，选择“联机”。 Acq Connect （1）在弹出的界面中的选择数据存储路径（Directory 菜单）；
流式细胞仪操作方法
流式细胞仪操作方法
一、样品制备 1、取样（大约1×106 cells），离心弃上清，以PBS洗两遍，逐滴加入1ml 70%的冷乙醇固定细胞，﹣20℃冻存过夜。分析时，离心弃上清，以PBS洗两遍，加入100μl的Rnase（GenScript试剂A），37℃水浴30min，然后再加入400μl的PI染液（GenScript试剂B），在4℃避光条件下孵育30min后即可上FCM检测。每个样品至少获取2×104cells， 二、上流式测细胞 1.1、打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，将鞘液桶加至2/3满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFLow），拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲。检查废液桶，将废液桶的气路和液路的快速连接阀打开，倒掉废液（加鞘液一定要倒废液）向废液桶中倒入400ml浓度为10%的次氯酸钠溶液，合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。 1.2、依此接通电源、打开稳压器电源（指示灯由bypass变Ac putput）、变压器电源，稳定5分钟。将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY。如果需要打印，打开打印机电源。打开电脑（密码：BDIS），等待屏幕显示出标准的苹果标志（先开仪器，后开电脑主机）。 1.3、将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关。若滤器管路中有气泡，打开连接头，挤出鞘液，以排除气泡。关闭液流抽屉。执行仪器PRIME功能一次，以排除Flowcell中的气泡（反向压力使鞘液从进样针中流出）。结束后自动STANDBY，5分钟后即可进行试验。 2.1、从苹果画面中选取CELLQuest，最大化，选散点图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X参数和Y参数分别取FSC-H、SSC-H（选择散点图主要是确定所需细胞的细胞群）。选择单参数图标，打开，Plot type选择Acq-analysis，X 参数选择FL2-H 1024(此属于荧光,根据荧光染料的波长范围选择不同的荧光,本实验使用PI作为荧光染料,故选择FL2-H)
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤之欧阳家百创编
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤 欧阳家百（2021.03.07） 取对数生长期的A549细胞，按1×106 cells/mL以1mL接种于100mm培养皿内 ↓ 24h后，进行所需的处理（比如加药,照射） ↓ 特定时间后终止培养，进行下一步的实验 ↓ 收集原培养液，洗后的PBS和消化后的细胞，将三者混匀放入 15ml离心管中 ↓ 1000rpm离心5min（短时低速离心） ↓ 弃上清，用1.5ml预冷PBS，1000rpm离心5min后去除PBS和细 胞悬液内的细胞碎片 ↓ 加入1.5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3.5ml无水乙醇，混匀后，于4℃固定30min,或-20℃长期保存。 ↓ 1000r/min,离心5min ↓ 将乙醇吸除，加PBS清洗混匀 ↓ 1000r/min,5min再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去 ↓
吸除离心管内PBS，加入200ul PBS和2ul的RNA酶 （0.25mg/ml）(37℃下孵育30min) ↓ 加入0.5ml的50ug/ml的PI溶液室温下避光染色30min ↓ 将离心管内的细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS的EP管中（PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团），标记EP管 ↓ 提前一天网上预约 ↓ 开机（先开仪器后开软件） ↓ 流式细胞仪的结构一般分为5部分：①流动室及液流驱动系统； ②激光光源及光束成形系统；③光学系统；④信号检测、存贮、显示、分析系统；⑤细胞分选系统。 ↓ 检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上 ↓ 流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱 ↓ 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm 激发光源） ↓ 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞
BD FACSCalibur流式细胞仪操作手册
BD FACSCalibur流式细胞仪 FACS101 Handbook 本课程介绍「表面抗原流式分析」有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅FACSinformation电子报https://www.wendangku.net/doc/806379710.html,/bdb/index.html。如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载https://www.wendangku.net/doc/806379710.html,/bdb/10-5-3-1.html。 如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载https://www.wendangku.net/doc/806379710.html,/bdb/10-5-4-1.html。 一、BD FA CSCalibur基本结构 1.1仪器本体： 1. 电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。 2. 光学系统：BD FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子雷射 以BD FACSCalibur 基本型为例 FSC Diode 只收488 nm波长散射光 SSC PMT 只收488 nm波长散射光 FL1 PMT 荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm） FL2 PMT 荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm） FL3 PMT 荧光光谱峰值落在深红色范围（波长 >650 nm）
3. 仪器面板： 仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。 流速控制： LO：样品流速：12 μl /min MED：样品流速：35 μl /min HI: 样品流速：60 μl /min 功能控制： ?RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。） ?STANDBY：无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率自动降低。 ?PRIME：去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME 结束，仪器 恢复STANDBY状态。 4. 储液箱抽屉： 在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤器Sheath Filter，及空气滤网 Air filter。请注意气路减压阀VENT TOGGLE之位置。