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农杆菌介导转化法的概述

农杆菌介导转化法的概述
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农杆菌介导转化法的概述

自从1983年转基因植物诞生以来,植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因,通过各种方法转移到植物的基因组中,使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状,如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。[1]

目前,应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性,容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点,而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定,是最常用的转基因技术[2]。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,近年来,农杆菌介导转化法在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。

1 关于农杆菌

农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。

1.1根癌农杆菌

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤;Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质,为双链共价闭合环状DNA分子,大小约200-250kb。

依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同,根癌农杆菌可分为4种类型:章鱼碱型(Octopine)、胭脂碱型(Nopaline)、农杆碱型(Agropine)和琥珀碱型(Succinamopine)。

原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区:

1.1.1T-DNA区(Transfer—DNA region):不同来源的菌株,T-DNA的长度在12~24 kb,它是在农杆菌侵染细胞时,从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T-DNA本身的转移与整合无关.T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列.其中14 bp 是完全保守的,分10 bp(CAGGAATATAT)和4 bp(GTAA)不连续的2组.左右2个

边界(LB和RB)是T—DNA转移所必需的,只要其存在,T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中,转移的方向是从右向左,T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用,因此,尤以右边界更为重要。

1.1.2毒性区(vir区):位于T-DNA以外的1个30-40kb的区域内,该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中,但对T-DNA的转移和整合非常重要。这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。目前,对章鱼碱型农杆菌Ti质粒pTi15955和胭脂碱型农杆菌Ti质粒pTiC58的vir区进行了全序列分析,在章鱼碱型Ti质粒的vir区发现了8个操纵子,分别为virA-vjrH,共包括23个基因(virA,virB1-virB11,virC1,virC2,virD1-virD4,virE1,virE2,virF,virG,virH).而胭脂碱型Ti质粒的vir区不含vjrF和virH操纵子,它含有另一个基因tzs ,也有学者认为有大约35个vir基因成簇排布于vir区。

1.1.3接合转移区(Con区):该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra),调控Ti质粒在农杆菌间转移。

1.1.4复制起始区(ori区):该区段调控Ti质粒的自我复制。

在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外,还有农杆菌染色体基因.染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD以及chvB.它们大多编码一些膜相关蛋白,负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。

1.2 发根农杆菌

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)含有Ri质粒,能够诱导被侵染的植物细胞产生毛发状根。其侵染植物是将其Ri质粒上的T-DNA插入到宿主植物基因组中,这一点与Ti质粒相类似。转移机制也类似,所不同的是vir区和T-DNA 区所含基因及其同源性不同。发根农杆菌由于宿主植物损伤部位产生的酚类化合物而附着在植物的细胞壁上,virA的产物是一种跨膜蛋白,进一步激活virG的产物。T-DNA区的TL区具有较高的稳定性,TR区具有与生长素合成有关的基因tmsl和tms2及农杆碱或甘露碱合成基因。TR区可进行改造,这样Ri通过农杆菌细胞膜特定“孔道”进入宿主植物细胞核,进而使T-DNA整合到植物基因组中。

2 转化过程

农杆菌介导的T-DNA的转移和整合是细菌和植物细胞相互作用发生生物学效

应的过程,兼具原核生物中的细菌结合转移及真核细胞加工修饰的特点。其转化过程[6-8]如下:

2.1 细菌在植物伤口处附着,使受伤的植物组织产生酚类化合物,诱导Ti质粒内vir基因的表达.

在植物受到创伤后,创伤组织的细胞释放出酚类化合物信号,如乙酰丁香酮(As)。当农杆菌接受到此类信号时,其vir区基因可被诱导转录。另一类诱导化合物是组成植物细胞壁的一些特异单糖,As和单糖可协同诱导Ti质粒上vir 区基因的表达。Vir区基因的活化首先是从virA基因开始的。VirA蛋白是一种结合在膜上的化学受体蛋白,可直接对植物产生的酚类化合物感应,其感应部位可能位于胞质区域。VirA蛋白的胞质区域有自激酶的功能,自身被磷酸化激活后,使VirG蛋白活化。VirG 蛋白是DNA 结合活化蛋白,可以以二体或多体形式结合到vir启动子的特定区域,从而成为其它vir基因转录的激活因子,打开VirB、virC、virD、virE、virH等几个基因。virC、virD、virE参与T-DNA复合体的形成和转移.ChvE可结合一些单糖,也可直接与VirA周质区相互作用,以加强As 对Vir基因的诱导。

2.2 vir基因表达的产物作用于T-DNA产生T-DNA链,进而转化形成T-DNA复合体,随后在植物及细菌蛋白的共同作用下被摄入细胞核内。

VirD基因编码的两个产物VirD1和VirD2直接参与加工过程.VirD1蛋白是一种拓扑异构酶,可将超螺旋型DNA变成松弛型DNA.VirD2蛋白具有特异剪切单链DNA 的内切酶活性,它可以识别T-DNA底链边界重复序列上的特定位点,并在底链24 bp重复序列和第四个碱基之间切割,将T-DNA从Ti质粒上剪切下来,称T-链。切开T-DNA后,VirD2蛋白与T一链的5’端共价结合,避免核酸外切酶降解T 一链.新的T-DNA底链以此链为模板,从右端产生的DNA缺口处以5’-3’方向进行合成。被取代的旧链游离出来,与许多VirE2蛋白分子结合组成T-DNA复合体。此外,VirD2作为一个导向蛋白,可以指导整个T-DNA复合体从农杆菌进入到植物细胞核。

2.3 T-DNA整合进入植物基因组并表达产生生物学效应.

T-DNA整合进宿主细胞基因组,是转化过程中最重要也最关键的步骤。T-DNA 在寄主细胞染色体上的整合是随机的,但对转录活化区域有所偏好。T-DNA通过

与事先断裂的寄主DNA双链(DSB)发生重组来完成整合,进而进行表达。

3转化方法

目前农杆菌介导转化单子叶植物最常用的方法是共培养法。利用农杆菌与植物离体组织共培养进行转化,一般需要经过严格的组织培养过程以再生植株,因而转化周期比较长。共培养前农杆菌感染愈伤组织的方式有:①将整块愈伤组织浸泡于菌液中静置培养。②将整块愈伤组织浸泡于菌液中摇动培养。③将菌液加至愈伤组织上。通常使用的是第一种方式。

现将农杆菌介导的植物遗传转化常采用的方法[9],简要介绍如下:

3.1 叶盘法

选取健康的无菌苗,用打孔器打出叶圆盘,将带有新鲜伤口的叶圆盘与载有目的基因的农杆菌液进行短期共培养,农杆菌通过伤口使携带外源目的基因的Ti或Ri质粒进入植物细胞,使外源目的基因整合到植物基因组中。它是双子叶植物较为常用也较为简单有效的方法。

3.2真空渗入法

该法转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中,经真空处理,造伤,使农杆菌通过伤口感染植株,在农杆菌的介导下,发生遗传转化。它是一种简便、快速、可靠而且不需要经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转移方法,具有良好的研究与应用前景。

3.3 原生质体法

在原生质培养的早期,将携带外源目的基因的农杆菌与原生质体共同培养,农杆菌的Ti或Ri就会随着外源信号分子的诱导而导入原生质体的核内,T-DNA 就可能整合在受体基因组上。

此外,作为载体法,新的转基因方法有:基于Ac/Ds转座系统建立的转化载体;利用噬菌体P1Cre-lox位点的特异性重组系统;利用酵母线粒体I-Scel核酸内切酶特异性诱导植物DNA双链断开引起的同源重组系统;利用双链细菌人造染色体载体系统等,能够提高转化率或转基因位点质量。

4 研究现状

关于禾谷类单子叶植物农杆菌介导的遗传转化,早期的研究多采用其幼胚来评估不同条件下被农杆菌侵染的可能性。结果显示,T-DNA向禾本科植物中的转

化没有明显障碍,但人们对整合过程的了解十分有限,同时存在相当大的争议。在此基础上,人们利用大量实验去测试不同谷类植物的不同外植体对农杆菌侵染的反应能力,以期获得稳定的转化细胞或植株。Grimsley等(1987)首先将玉米条纹病毒(maize streak virus)的cDNA通过根癌农杆菌转入玉米,转入植株表现出感染症状;Gould等(1991)用根癌农杆菌感染玉米芽尖,得到少量转基因植株;Shen等(1993)观察到农杆菌介导的gus基因转入玉米芽后β-葡糖苷酸酶的表达;Mooney等(1991)采用根癌农杆菌感染小麦胚得到转化细胞;Rainer 等(1990)和Chan等(1992)通过根癌农杆菌感染未成熟胚得到少量水稻转基因植株。以上研究工作得到的转化频率很低,且没有足够的分子和遗传证据,这些研究成果很少为大家接受并承认,却是鼓舞人心的,为单子叶植物尤其是禾谷类作物转基因研究的进一步开展奠定了基础。1993年-1994年取得了重大突破,Chan等(1993)以水稻开花授粉后10-12天的幼胚为受体,经农杆菌感染后获得了转基因植株;Hiei等(1997)以水稻成熟胚愈伤组织和未成熟幼胚为受体,获得了较多有严格分子生物学证据的转基因植株,并对农杆菌介导法转化水稻的影响因素进行了详细研究,建立了比较成熟的农杆菌转化水稻的技术体系,为农杆菌介导法转化单子叶植物开辟了先河。从此,农杆菌介导法的转化范围扩展到了许多重要的单子叶植物,包括香蕉、玉米、大麦、小麦、甘蔗、大蒜、洋葱、高梁和黑麦(Chenget al 1997;Ishida et al 1996)[10-13]。

5 存在问题与展望

5.1植物受体因子与农杆菌间的作用机理

目前对农杆菌介导转化的机理及分子调控已研究比较深入,但对有关植物因子的作用机理还知之甚少。许多研究表明,农杆菌介导单子叶植物遗传转化已具备了与双子叶植物相似的农杆菌本身的必要条件,但单子叶植物的转化相比较而言困难得多,这可能不仅是农杆菌一方的因素,单子叶植物的植物因子也可能起着关键作用,也不排除农杆菌和这些植物因子的相互作用[14]。

5.2 转化率

大多数单子叶植物的转化受其基因型、外植体来源、组织培养难易程度等因素的影响,比较难,以至在重要禾谷类作物中的应用受到一定的限制,与双子叶植物相比,农杆菌转化单子叶植物还存在较大差距,其中烟草、葡萄等双子叶植

物的转化效率高达60%以上,而单子叶植物中转化效率较高的禾本科植物还不到30%(蒋玉宝等2005;孟芮等2006)。据统计,单子叶植物用农杆菌转化获得成功的遗传转化率玉米为5%-30%、水稻为29%、籼稻为22%,接近双子叶植物(任永霞等2005) [15]。目前农杆菌介导遗传转化的方法主要有原生质体法、叶盘法和整株感染法等。对于大多数单子叶植物的转化,常受基因型、外植体来源、组织培养难易程度等因素影响而很难成功,因此在许多重要禾谷类作物中的应用受到限制。

5.3 Ti载体容量

禾谷类作物的一些性状,如抗病、抗虫、抗逆、高产优质等,或是数量性状,或是质量性状相关的基因成簇排布,定位在较大的DNA片段。这些性状的改造就需要一个能将大片段DNA导入植物细胞并稳定表达的转化体系。能携带大片段DNA的双元细菌人工染色体和具转化功能人工染色体分别对烟草和拟南芥的成功转化(Hamilton et al 1997;Liu et al 1999),无疑对实现禾谷类作物中导入大片段DNA并进行遗传改良具有重要意义(李卫等2000)。

农杆菌介导的遗传转化也存在不足[15-16]。如农杆菌感染过程会对植物材料造成损伤,T-DNA整合时其边界可能会发生截断(Hamid et al 1996),T-DNA以串连形式整合,基因依赖性较高(Lee et al 1999),甲基化等原因造成基因表达失活(Kumpalta et al 1997,1998;Pawlowski et al 1998),转移T-DNA区的两个基因未必共表达等(Hamid et al 1996)。

另外,考虑到转基因作物及其产品的安全性问题,培育具有安全选择标记或无选择标记的转基因植物也将成为植物基因工程研究的热点之一。

6 结束语

随着转基因技术的迅猛推广,农杆菌介导植物遗传转化在转化机理、转化范围、转化方法、转化策略等方面的进一步深入研究,农杆菌介导法已在植物转基因领域中被广泛应用,成为获得转基因植物最常用的方法。

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农杆菌介导的遗传转化在水稻基因工程中的应用

中国稻米 专论与综述 2007年第3期 农杆菌介导的遗传转化在水稻基因工程中的应用 摘要:农杆菌作为一种天然的遗传转化系统,在水稻基因工程中倍受重视。本文概述了农杆菌介导转化水稻的原理、影响因素、遗传改良上的应用及存在的问题。 关键词:农杆菌转化系统;原理;影响因素;遗传改良 (1湖南农业大学生物安全科技学院,湖南长沙410128;2湖南农业大学水稻基因组学实验室,湖南长沙410128; 3 美国俄亥俄州立大学植物生理实验室,美国俄亥俄州43210) 潘素君 1,2 戴良英 1,2 刘雄伦 2 王国梁 2,3 收稿日期:2007-01-18 水稻是全世界最重要的粮食作物之一,其栽培面积和总产量仅次于小麦。水稻不仅作为食品支持26亿人的生命,还是禾谷类作物中开展分子生物学研究的“模式植物”。随着分子生物学和分子遗传理论的迅速发展,利用遗传工程手段,有目的地将外源基因或DNA 构建导入水稻基因组,通过外源基因的直接表达,或通过内源基因表达的调控,获得抗病、抗虫、抗逆、高产优质的优良品种已成为水稻育种的重要手段。农杆菌介导法因其简单易行、转化率高、可导入较为完整的基因、整合位点稳定、拷贝数低、外源基因表达比较稳定而在水稻的遗传转化中得到广泛应用。 1农杆菌介导的遗传转化原理 农杆菌转化系统是一种天然的基因转化系统,转化植物细胞的农杆菌有两类,即根癌农杆菌和发根农杆菌。根癌农杆菌所含质粒是T i 质粒,发根农杆菌所含质粒是Ri 质粒。在水稻转化中,常用的是T i 质粒。 T i 质粒上含有可转移DNA (T-DNA )区、结合区(C on )、 复制起始区(Ori )和毒性区(V ir )。其中与冠瘿瘤生成有关的是V ir 区和T-DNA 区。T-DNA 区左右边界各有 25b p 的重复序列,左边界缺失仍可致瘤,而右边界缺 失则不能致瘤。两个边界之间是生长素和细胞分裂素合成基因以及冠瘿碱合成基因。V ir 区为30b p ,V irA 、 V irB 、V irC 、V irD 、V irE 、V irG 、V irH 等七个操纵子24个基 因起共调控作用。当植物受到伤害时,将分泌一些酚类化合物,这些酚类化合物一方面通过染色体基因的介导促使农杆菌向植物受伤的部位移动并附着于植物细胞表面。另一方面V irA 作为受体蛋白接受酚类诱导物,自身磷酸化并激活V irG 蛋白,V irG 蛋白是一种 DNA 转录活化因子,被激活后可以特异性结合到其它V ir 基因启动子区上游的V ir 盒(V ir box )的序列,启动 这些基因的转录。 V irD1和V irD2共同作用,由T-DNA 右边界开始 向左边界切割产生一条T-DNA 链(T-链),T-链5′末端与V irD2结合,其余部分与V irE2结合,组成T-复合体。T-复合体被转移到农杆菌外,通过植物细胞壁上由V irB 蛋白组成的通道进入到植物细胞内。V irD2和V irE2上的核定位信号(N LS )被转运蛋白识别,经过主动运输过程通过核孔进入细胞核内,转入细胞核的 T-DNA 以单拷贝或多拷贝的形式整合到植物染色体 上。 2农杆菌介导转化水稻的影响因素 2.1 菌株和载体 选取合适的农杆菌菌株和高效的载体系统对转化 至关重要。目前,用于水稻转化的农杆菌菌株较为普遍的有A281、A656、LBA4404、EHA101、EHA105、AG L1。 H iei [1] 等用菌株LBA4404、EHA101与载体p IG 121Hm 、 p T OK 233做试验,发现在T sukinohikari 培养基中 LBA4404(p T OK 233)比LBA4404(p IG 121Hm )和EHA101(p IG 121Hm )介导转化效果要好,在K oshihikari 培养基 中LBA4404(p l G 121Hm )最有效,EHA101(p T OK 233)对水稻的转化频率最低。LBA4404(p T OK 233)对爪哇稻转化频率较高。比较LBA4404、EHA105、AG L1这三种农杆菌菌株对水稻愈伤组织的转化能力,EHA105的转化效果最好,LBA4404次之,AG L -1最差[2,3] 。李双成 [4] 将 EHA105和AG L1的菌液按体积2∶1混合用于共转化, 表明两者对转化具有协同作用。 2.2 转化受体 在外植体的选择上,Sm ith 和H ood [5]认为,用农杆 菌转化单子叶植物,应选择处于适宜生理状态的那些组织,其特点是:能够产生vir 基因活化分子;内源激素 ?10?

农杆菌的活化培养及介导的遗传转化

农杆菌的活化培养及介导的遗传转化 一、目的要求 通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。 二、基本原理 农杆菌共培养法最早是由Marton 等(1979 年)以原生质体为受体建立起来的,经过一系列改进后,目前已经成为最常用的转化方法。共培养法是利用Ti 质粒系统,将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。 三、材料及方法 1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。 2.植物幼苗。 (一)细菌培养液直接浸染法 操作︰ (1)无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料,有两种来源。取自无菌试管苗。 取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后,70%乙醇洗45 秒,0.1%升汞消毒6~8 分钟,无菌水冲洗三遍,无菌滤纸吸干水分。 (2)受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘,无菌胚轴、睫切成约0.8~1cm 长的切段,接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养,注意叶片近轴面向下︰预培养2~3 天,材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。 (3)农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落,接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基(pH7.0)中,在恒温摇床上,于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6~0.8。 取OD600 为0.6~0.8 的菌液,按1%~2%的比例,转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中,可在与上相同的条件下培养6 小时左右,OD600 为0.2~0.5 时即可用于转化;或同时加入100~500μmol/的AS; (4)侵染︰于超净工作台上,将菌液倒入无菌小培养皿中(可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释)。从培养瓶中取出预培养过的外植体,放入菌液中,浸泡适当时间(一般1~5 分钟,不同材料处理时间不同)。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。 (5)共培养︰将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上(烟草为MS 十 IAA0.5mg/L + BA2.0mg/L) ,在28℃暗培养条件下共培养2~4 天(光对某些植物的转化有抑制作用,故需暗培养,共培养时间因不同植物而异)。

农杆菌介导转化法的概述

农杆菌介导转化法的概述 自从1983年转基因植物诞生以来,植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因,通过各种方法转移到植物的基因组中,使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状,如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。[1] 目前,应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性,容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点,而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定,是最常用的转基因技术[2]。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,近年来,农杆菌介导转化法在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。 1 关于农杆菌 农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。 1.1根癌农杆菌 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有Ti质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤;Ti质粒是农杆菌染色体外的遗传物质,为双链共价闭合环状DNA分子,大小约200-250kb。 依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同,根癌农杆菌可分为4种类型:章鱼碱型(Octopine)、胭脂碱型(Nopaline)、农杆碱型(Agropine)和琥珀碱型(Succinamopine)。 原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区: 1.1.1T-DNA区(Transfer—DNA region):不同来源的菌株,T-DNA的长度在12~24 kb,它是在农杆菌侵染细胞时,从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T-DNA本身的转移与整合无关.T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25 bp的重复序列.其中14 bp 是完全保守的,分10 bp(CAGGAATATAT)和4 bp(GTAA)不连续的2组.左右2个

农杆菌介导转基因的原理

农杆菌介导转基因的原理? 转基因技术的飞速发展为生物定向改良和分子育种提供了一种较佳的方法,并使其成为基因工程和育种的最有效途径,目前应用较广泛的转基因技术有农杆菌介导法、花粉通道法、显微注射法、基因枪法、离子束介导法等等,其中农杆菌介导法以其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐。农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体,通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触,以完成可遗传细胞的转化,然后利用组织培养的方法培育出转基因植株,并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒,其上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中。因此,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,然后通过细胞和组织培养技术,再生出转基因植株。 农杆菌转化的详细机理已有大量综述, 并介绍新进展. 野生型根癌农杆菌能够将自身的一段DNA转入植物细胞. 因为转入的这一段DNA含有一些激素合成基因, 因而导致转化细胞自身激素的不平衡从而产生冠瘿瘤. 这些致瘤菌株都含有一个约200 kb的环状质粒, 被称为Ti(tumor inducing)质粒, 包括毒性区(Vir 区)、接合转移区(Con区)、复制起始区(Ori区)和T-DNA区4部分. 其中与冠瘿瘤生成有关的是Vir区和T-DNA区. 前者大小为30 kb, 分virA~J等至少10个操纵子, 决定了T-DNA的加工和转移过程. T-DNA可以将携带的任何基因整合到植物基因组中, 但这些基因本身与T-DNA的转移与整合无关, 仅左右两端各25 bp的同向重复序列为其加工所必需, 其中14 bp是完全保守的, 分10和4 bp不连续的两组. 两边界中以右边界更为重要. VirA作为受体蛋白接受损伤植物细胞分泌物的诱导, 自身磷酸化后进一步磷酸化激活VirG蛋白; 后者是一种DNA 转录活化因子, 被激活后可以特异性结合到其他vir基因启动子区上游的一个叫vir框(vir box)的序列, 启动这些基因的转录. 其中, virD基因产物对T-DNA进行剪切, 产生T-DNA单链. 然后以类似于细菌接合转移过程的方式将T-DNA与VirD2组成的复合物转入植物细胞], 在那里与许多VirE2蛋白分子(为DNA单链结合蛋白)相结合, 形成T链复合物(T-complex). 在此过程中VirE1作为VirE2的一个特殊的分子伴侣具有协助VirE2转运和阻止它与T-DNA链结合的功能. 实验表明, 转基因植物产生的VirE2蛋白分子也能在植物细胞内与VirD2-T-DNA形成T链复合物. 之后, 这一复合物在VirD2和VirE2核定位信号(NLS)引导下以VirD2为先导被转运进入细胞核. 转入细胞核的T-DNA以单或多拷贝的形式随机整合到植物染色体上. 研究表明T-DNA优先整合到转录活跃区, 而且在T-DNA的同源区与DNA的高度重复区T-DNA的整合频率也比较高. 整合进植物基因组的T-DNA也有一定程度的缺失、重复、填充和超界等现象发生, 例如在用真空渗透法转化的拟南芥中有66%出现超界现象, 甚至有整个Ti质粒整合进植物基因组的报道, T-DNA超界转移现象的机理尚不完全清楚, 可能与其左边界周边序列有关. 现在, 对农杆菌感染过程中其本身因子的转录与调控已研究得相当深入, 但

农杆菌介导水稻快速转化-Bio-protocol

农杆菌介导水稻快速转化 Agrobacterium-mediated Rapid Transformation of Rice 崔莹,蔡朝霞,林拥军,陈浩* 作物遗传改良国家重点实验室,华中农业大学,武汉 *通讯作者邮箱:hchen@https://www.wendangku.net/doc/8e732990.html, 引用格式:崔莹,蔡朝霞,林拥军,陈浩. (2018). 农杆菌介导水稻快速转化. Bio-101 e1010176. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010176. How to cite: Cui, Y., Cai, C. X., Lin, Y. J. and Chen, H. (2018). Agrobacterium-mediated rapid transformation of rice. Bio-101 e1010176. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010176. (in Chinese) 实验原理:Toki等(2006)发现,水稻成熟胚在诱导愈伤1 d后可以被农杆菌侵染,诱导愈伤5 d后可以被高效转化。Toki (1997)研究表明在32 °C、光照条件下,水稻愈伤组织可以快速分裂。在该条件下进行筛选培养,14 d可以得到明显的抗性愈伤组织。本实验的目的是在实验室已有的遗传转化方法基础上,参考Toki等(1997,2006)发表的部分实验参数,建立快速的水稻转化方法,以缩短遗传转化周期。本实验在32 °C、光照条件下诱导愈伤,对诱导5 d的水稻愈伤组织进行侵染,随后在32 °C、光照条件下以潮霉素作为筛选剂进行筛选培养,14 d后获得了抗性愈伤组织,对抗性愈伤组织进行分化培养,获得稳定的转化植株。从愈伤组织诱导到转化再生植株生根,整个实验周期约为50 d。 关键词:水稻成熟胚,农杆菌介导,快速转化 材料与试剂 1. 滤纸 2. 水稻种子 3. 75%酒精 4. 吐温20 5. 农杆菌菌株EHA105 (携带含目的基因载体) 6. 6-Benzylaminopurine (6-BA) (Sigma, catalog number: B-3408) 7. Kinetin (KT) (Sigma, catalog number: K-0753)

农杆菌介导转化法的概述

农杆菌介导转化法的概 述 集团公司文件内部编码:(TTT-UUTT-MMYB-URTTY-ITTLTY-

学年第学期 2014级硕士生生物化学期末论文任课老师: 开课学院: 课程名称: 学院: 专业: 学号: 姓名: 2015年6月20日

农杆菌介导转化法的概述 摘要:自从1983年转基因植物诞生以来,植物基因工程成为发展最快、应用潜力最大的生物技术领域之一。植物转基因技术是指把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因,通过各种方法转移到植物的基因组中,使之稳定遗传并赋予植物新的农艺性状,如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。[1]? 目前,应用于植物转基因较多的方法有基因枪轰击法和农杆菌介导法。由于基因枪轰击的随机性,容易出现突变、丢失和引起基因沉默等不利于外源基因在宿主植物的稳定表达的缺点,而农杆菌介导法是一种天然的植物遗传转化系统,外源基因在转基因植物中的拷贝数低、遗传稳定,是最常用的转基因技术[2]。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,近年来,农杆菌介导转化法在一些单子 叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。本文对农杆菌介导转化法进行综述。 关键词:农杆菌转化方法转化效率 1?关于农杆菌 农杆菌[3-5]是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性的感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。与植物基因转化有关的有根瘤农杆菌和发根农杆菌这两种类型。 1.1??根癌农杆菌

依据Ti质粒诱导的植物细胞产生的冠瘿碱的种类不同,根癌农杆菌可分为4种类型:章鱼碱型(Octopine)、胭脂碱型(Nopaline)、农杆碱型(Agropine)和琥珀碱型(Succinamopine)。? 原始的Ti质粒根据其功能的不同可分为4个区: —DNA?region):不同来源的菌株,T-DNA的长度在12~24?kb,它是在农杆菌侵染细胞时,从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T-DNA本身的转移与整合无关.T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25?bp的重复序列.其中14?bp是完全保守的,分10?bp(CAGGAATATAT)和4?bp(GTAA)不连续的2组.左右2个边界(LB和RB)是T—DNA转移所必需的,只要其存在,T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中,转移的方向是从右向左,T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用?,因此,尤以右边界更为重要。 位于T-DNA以外的1个30-40kb的区域内,该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中,但对T-DNA的转移和整合非常重要。这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。目前,对章鱼碱型农杆菌Ti质粒 pTi15955和胭脂碱型农杆菌Ti质粒pTiC58的vir区进行了全序列分析,在章鱼碱型Ti质粒的vir区发现了8个操纵子,分别为virA-vjrH,共包括23个基因(virA,virB1-virB11,virC1,virC2,virD1-virD4,virE1,virE2,virF,virG,virH).而胭脂碱型Ti质粒的vir 区不含vjrF和virH操纵子,它含有另一个基因tzs?,也有学者认为有大约35个vir基因成簇排布于vir区。

农杆菌转化法原理

农杆菌转化法原理: 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞),并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒,其上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代,这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,然后通过细胞和组织培养技术,再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,近年来,农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应,主要包括:①受伤的植物细胞为修复创伤部位,释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下,农杆菌向受伤组织集中,并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达,同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞,并整合到植物细胞基因组中。 方法:(根据不同受体环境基因要求而不同) 1.农杆菌准备 2.外植体的准备(愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片); 3.用MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍(1.5ml / 20ml)或离心后稀释3倍; 4.外植体与菌液共培养20 分钟; 5.放置在带滤纸的培养皿上(注意充分吸干多余的菌液); 6.将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基,培养2-3天; 7.移至含卡那霉素(Kan)300mg/L和羧苄青霉素(Cb 300mg/L)的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8.隔20天,进行第二次筛选; 9.抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗; 10 在生根培养基上生根,获得完整的再分化植株。

农杆菌介导水稻遗传转化的相关讨论

农杆菌介导水稻遗传转化相关的讨论 羧苄青霉素的作用 羧苄青霉素在农杆菌介导法对水稻进行遗传转化的过程中起到抑制农杆菌生长的作用。根据前人的研究经验,浓度为250mg/L时候抑制效果最好且不会影响愈伤组织的再生。本实验过程中我们发现,经过经验用量的羧苄青霉素抑制处理,转移至筛选培养基后一周左右即可见到少量愈伤农杆菌复发,有的甚至在第二次筛选时仍然生长出农杆菌,并未达到很好的抑制农杆菌生长的目的。这有可能是在长期的实验过程和进化过程中,农杆菌对苏氨苄青霉素产生了耐受性。因此,在遵循不影响愈伤组织生长的原则下,可以适当增加羧苄青霉素的用量,或者与头孢霉素配合使用,可以达到很好的抑制效果。 潮霉素作为筛选剂的最适宜浓度 本实验采用潮霉素基因作为筛选标记,经过长期经验积累,发现潮霉素浓度梯度25mg/L,35mg/L和45mg/L进行多轮筛选,假阳性最低,筛选效果最好,为最适筛选浓度。 各个阶段不同添加物的作用 水稻遗传转化过程中的碳源有多种选择,主要有葡糖糖,麦芽糖和蔗糖,糖类除作能源外,还可以作为渗透调节剂对愈伤组织的的质量起重要作用。根据转化受体的不同,碳源的种类和浓度也有区别。本实验室研究中发现,粳稻作为转化受体时,蔗糖为最佳的碳源,而在籼稻的遗传转化中,麦芽糖和蔗糖配合使用,效果最好。 植物激素是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键性因素。2 ,4-D 的质量浓度至关重要,对于愈伤组织诱导来说,低浓度及高浓度的 2 ,4-D 都不适宜水稻成熟胚愈伤组织的诱导。在籼稻的遗传转化中,2 ,4 -D与6 -BA 配合使用更有利于愈伤组织的诱导及分化。 潮霉素和除草剂均可以作为筛选剂。适宜的筛选浓度有利有抗性愈伤组织的生长,潮霉素浓度过高,阳性愈伤组织也有可能被筛死,浓度过低,又会有较高的假阳性出现。实验证明,只用潮霉素筛选所得的抗性愈伤和先用潮霉素筛选后用除草剂筛选所得的抗性愈伤,在分化再生过程中有显著差异。前者分化出芽所

农杆菌介导转化和再生的杨树

农杆菌介导法转基因杨树 摘要: 杨树品种已发展为一种植物转化和再生系统。叶植,从稳定发芽培养的一个杨树杂交NC - 5339(银白杨标本),被共培养用于农杆菌遗传转化关于一个烟草的看护培养。致瘤的和无防备的农杆菌株隐藏包含一个双元载体,其中包含两个新霉素磷酸转移酶II(NPT II')和细菌5莽草酸3-磷酸合酶(EPSP)(AROA)嵌合基因融合。没有开发芽,叶外植体时,双元缴械拉力的根癌农杆菌菌株共培养。然而,转化的植物,没有野生型的T-DNA获得使用农杆菌株原癌基因的二进制。NPT II '酶的活性检测,Southern印迹法分析和免疫学检测证实了遗传转化成功细菌EPSP合酶Western印迹。这是首次报道成功收回转化植株森林树,也是第一个记录的插入和重要农艺性状的外源基因的表达成木本植物物种。 关键词:白杨;转化;农杆菌 前言 基因工程树种的能力将是特别有用的遗传改良,如大型成熟的植物并长期有性世代倍(Nelson and Haissig 1984; Sederoff and Ledig 1985)。森林树种的应用重组DNA技术的一个先决条件是发展的基因转移系统。方法,例如显微注射(Crossway et al.1986)和直接DNA摄入(Paszkowski et al. 1985; Fromm et al. 1986) 已被用于外源基因引入到草本作物物种,但是,最有效的基因转移的方法,利用自然感染冠瘿病的机制造成的有机体,农杆菌(Bevan et al. 1983 ; Fraley et al. 1983 ; Herrera-Estralla, 1983). 。根癌农杆菌的自然感染周期期间,细菌的T-DNA 整合到宿主植物的染色体,从而导致肿瘤对植物的生产(奇尔顿等人,1980)。可以删除和替换而不影响根癌农杆菌的T-DNA转移到植物(DeGreve等,1982)的能力,由异源基因的肿瘤诱导基因。这些修改后的根癌农杆菌菌株的原生质体,悬浮细胞,外植体组织的共培养,可导致转化植物缺乏致癌基因性状的隔离。因此,我们着手开发一个混合型杨树无性系,银白杨x grandidentata的(NC - 5339 )作为载体的农杆菌转化体系。 有许多特征能使杨树NC-5339得到理想的转化研究首先,杨树是一个重要的全球森林树种。这是一个快速增长的落叶阔叶树,栽培主要用于纸浆生产。对

农杆菌转化法原理

农杆菌转化法原理 This manuscript was revised on November 28, 2020

农杆菌转化法原理: 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞),并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒,其上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代,这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,然后通过细胞和组织培养技术,再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中,近年来,农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应,主要包括:①受伤的植物细胞为修复创伤部位,释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下,农杆菌向受伤组织集中,并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达,同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞,并整合到植物细胞基因组中。 方法:(根据不同受体环境基因要求而不同) 1.农杆菌准备 2.外植体的准备(愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片); 3.用 MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍(1.5ml / 20ml)或离心后稀释3倍; 4.外植体与菌液共培养20 分钟; 5.放置在带滤纸的培养皿上(注意充分吸干多余的菌液); 6.将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基,培养2-3天 ; 7.移至含卡那霉素(Kan)300mg/L和羧苄青霉素(Cb 300mg/L)的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8.隔20天,进行第二次筛选; 9.抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗; 10 在生根培养基上生根,获得完整的再分化植株。

水稻遗传转化体系Protocol

水稻遗传转化体系Protocol Introduction 1.水稻的遗传转化研究历史与现状 20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源 3]。1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1 ~ 获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。1993 年,Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼 13 个稻的转化可以在两个半月内完成,且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5 ~ 独立的转化植株)。 2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11] a. 转基因抗虫水稻 对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。 b. 转基因抗病水稻 见抗水稻病毒研究 c. 转基因抗旱水稻 d. 转基因营养高效利用水稻

根癌农杆菌介导的植物遗传转化1

实验三根癌农杆菌介导的植物遗传转化 一实验目的 了解植物遗传转化的方法和理论 掌握根癌农杆菌介导的遗传转化技术 二原理 植物遗传转化技术是指通过物理的,化学的或生物学的方法,将外源的基因导入受体植物细胞中获得再生植株的转基因技术。自1983转基因植物问世以来,至今不到20年时间里,植物转基因技术发展迅速,除了占指导地位,运用最为广泛的农杆菌介导法,还发展了10多种转基因方法,如物理方面的基因枪法,电激法,显微注射法,超声波法,激光微束法,炭化硅纤维介导法,电泳法等;化学方面PEG介导转化,脂质体介导转化;生物学方面的种质系统法如花粉介导法,花粉管通道法等。 农杆菌介导法 土壤农杆菌(Agrobacterium)是一种革兰氏阳性菌,有两个种与植物转基因有关,即根癌农杆菌(Agrobacterium Tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium Rhizogenes).它们在自然状态下具有趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠缨瘤或发状根,在离体条件下,可以在不加任何生长素的培养基中持续生长,研究表明根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti 和Ri质粒,上面有一段T-DNA区,可以通过一系列过程进入植物细胞并将这一段T-DN插入到植物基因组中,这是农杆菌侵染植物后产生冠缨瘤或发状根的根本原因,因此农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系,人们可将所构建的目的基因插入到去除了致瘤基因的Ti(Ri)质粒的T-DNA区,借助农杆菌侵染受体植物细胞后T-DNA向植物基因组的高频转移和整合特性,实现目的基因对受体植物细胞的转化,然后通过植物细胞合和组织培养技术,利用植物细胞的全能性获得转基因再生植株。农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体植物基因组的过程,这一过程依赖与Ti质粒上的T-DNA区,和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质和核酸的相互作用。简略地说。其过程是:植物细胞在受伤后细胞壁破裂,分泌高浓度的创伤诱导分子,它们是一些酚类化合物,如乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)和羟基乙酰丁香酮(hydroxy- acetosyringone,OH-As)农杆菌对这类物质具有趋化性,首先在植物细胞表面发生贴壁,继而植物创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达。首先是VirA和virG基因的活化,磷酸化的virG蛋白激活一系列vir基因的表达,导致T-DNA被剪切,加工,形成T-链蛋白复合体(T-复合体),通过农杆菌和植物细胞的细胞膜,细胞壁进入植胞内,T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。 三实验材料 烟草KRK26叶片,农杆菌菌株EHA105,质粒的T-DNA含目的基因GFP,卡那霉素抗性基因为选择标记基因,结构如下图所示: LB Bt nos3 MCS nos3 nptII nos5 RB

农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/8e732990.html, 农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用 作者:宋建刘仲齐 来源:《天津农业科学》2008年第01期 摘要:主要介绍了农杆菌介导的基因瞬时表达方法的原理、技术、影响因素及其在外源基因表达分析、启动子分析、基因沉默及防卫反应等方面的应用。 关键词:农杆菌;植物;基因瞬时表达 中图分类号:Q789文献标识码:A文章编号:1006—6500(2008)01—0020—03 把外源基因导入受体植物内,是研究基因功能和获得遗传修饰有机体的主要手段。农杆菌介导法是目前最常用的遗传转化方法,当农杆菌感染植物受伤组织后,质粒上的目标基因可以进入植物细胞内并整合到植物染色体中,这种转化细胞经过诱导分化,再生成为转基因植株。通常大多数植物的遗传转化和再生效率低下,费时且费用昂贵。即使对于转化程序大大简化的植物,例如拟南芥,仍然需要花费数月的时间来产生适合分析的转基因植株。农杆菌介导的瞬时表达提供了一种快速分析基因型功能的方法,该方法是Rossi等在1993年创建的。他们将带有重组质粒的农杆菌,经诱导后通过抽真空渗透入植物叶片进而渗透入植物细胞,通过目的基因瞬时表达来检测植物中农杆菌介导的T-DNA转移的效率。随后人们又采用针管注射活体植株叶片,来进行农杆菌介导的基因瞬时表达检测。近几年该项技术不断完善、发展,已被广泛用于外源基因表达分析、无毒基因与抗性基因的相互作用、基因沉默、启动子分析等许多植物分子生物学领域。 1主要原理 农杆菌介导的瞬时表达是将目的基因插入共整合载体或双元载体,转化根癌农杆菌,后者经酚类化合物诱导处理后,通过真空渗透或针管注射入植物叶片组织中,农杆菌在叶片内与植物细胞紧密接触。诱导处理在转录水平激活Vir区基因,真空渗透或注射使得农杆菌与植株叶片细胞接触,从而实现了T-DNA转移进入植物细胞核。大部分T-DNA并未整合入植物基因组而是暂时存在于核内并在植物细胞转录、翻译成分的协助下瞬时表达T-DNA基因,通常在数小时后即可检测到外源基因的表达,并在1~2d内达到最高值。而少量整合进植物染色体的 T-DNA在瞬时表达中不起作用或极为微弱。

农杆菌介导的水稻转化

农杆菌介导的水稻转化 实验目的 学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。 实验原理 随着分子生物学的发展,越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来,如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因,参与对病原物识别的基因等,要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位,就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物,来明确该基因在植物抗病中的作用。 水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。DNA直接导入法主要包括PEG(polyethylene glycol)介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体,由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。基因枪法优点是受体广泛,不受寄主范围的限制,转化率较高,但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点:外源DNA的整合方式复杂,常常是多拷贝插入,较易出现转基因沉默现象,转化的外源基因片断不能太大(上限是16-20kb),转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。同DNA直接导入法相比,农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养,简便易行,能有效地转入较大的外源DNA片断;转化效率高,转化的外源基因整合位点比较稳定(一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合),整合的外源基因基本上保持其结构的完整性;整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝;整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高,共抑制现象相对较少;转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。所以已成为转化单子叶植物的首选方法。 一、目标基因对农杆菌的转化 1.1农杆菌感受态细胞的制备 1.取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线,28℃黑暗培养。 2.挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中,220rpm 28℃振荡培养12-16小时。 3.取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中,28℃,220rpm振荡培养至OD600=0.5。 4.转入无菌离心管,5000rpm离心5分钟,去上清液。 5.加入10ml预冷的0.1M的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置20分钟后,4℃,5000rpm 离心5分钟,去上清。 6.加入4ml预冷的含10%甘油的0.1M的CaCl2溶液,轻轻悬浮。 7.农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中,每管200μl冻存于-70℃。 1.2. 双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200ml EHA105感受态细胞中,混匀后,冰浴30分钟,-70℃放置3分钟,42℃水浴1-2分钟,加入800mlYM液体培养基28℃,175rpm摇培2-3小时后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上,28℃培养。 1.3农杆菌转化子的PCR鉴定 将农杆菌转化子,用PCR方法鉴定是否正确转进EHA105中。挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50μg/ml Kanamycin的YM液体培养基中,28℃,220rpm摇培16小时,直接用

农杆菌介导的植物遗传转化研究进展

生物技术进展 2011年第1卷第4期260 265 Current Biotechnology ISSN 2095-櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅櫅殯 殯 殯 殯 2341 进展评述 Reviews 收稿日期:2011-08-30;接受日期:2011-10-11基金项目:国家自然科学基因项目(31070139)资助。 作者简介:姚冉,硕士研究生,研究方向为遗传学。*通讯作者:张志芳,研究员,博士,博士生导师,主要从事基因工程研究。E-mail :zhangzf@mail.caas.net.cn 农杆菌介导的植物遗传转化研究进展 姚 冉1,2,石美丽1,潘沈元1,沈桂芳2,张志芳 2*1.徐州师范大学生命科学学院,江苏徐州2211162.中国农业科学院生物技术研究所,北京100081摘 要:农杆菌介导的转基因方法是目前植物遗传转化的重要方法之一。本文从农杆菌转化原理、菌株比较及载体发 展入手, 系统讨论了植物转化受体对转化效率的影响,同时分别综述了农杆菌介导转化技术在双子叶和单子叶植物转化应用中的最新进展。 关键词:农杆菌;遗传转化;进展 DOI :10.3969/j.issn.2095-2341.2011.04.06 Progress on Agrobacterium tumefaciens -mediated Plant Transformation YAO Ran 1,2 ,SHI Mei-li 1,PAN Shen-yuan 1,SHEN Gui-fang 2,ZHANG Zhi-fang 2* 1.School of Life Science ,Xuzhou Normal University ,Jiangsu Xuzhou 221116,China 2.Biotechnology Research Institute ,Chinese Academy of Agricultural Sciences ,Beijing 100081,China Abstract :In current ,Agrobacterium -mediated gene transferring is one of major methods used in genetic transformation of plants.This paper systematically reviewed the effect on plant transformation efficiency based on the introduction of the principle of this transformation ,comparison among different kinds of Agrobacterium strains and the development to transformation vectors.In addition ,the newly progresses on the Agrobacterium -mediated transformation of dicotyledonous and monocotyledons species transformation were also discussed ,respectively. Key words :Agrobacterium tumefaciens ;genetic transformation ;progress 植物遗传转化(plant genetic transformation )技术也称植物转基因技术,是应用DNA 重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组,以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术 [1] 。目前最常用的转基 因方法是基因枪法和农杆菌法。基因枪法的基本 原理是利用表面附着有外源DNA 的金属微粒在高压装置中加速后高速运动到受体细胞中,从而达到转化DNA 的目的。但是基因枪法与农杆菌介导法相比,存在着转化率低、外源DNA 整合机 理不清楚、 得到的转化体往往是嵌合体、遗传稳定性较差、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。农杆菌属于革兰氏阴性土壤杆菌,分根癌农 杆菌(Agrobacterium tumefaciens )和发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes )。根癌农杆菌中含有Ti 质粒,能诱发冠瘿瘤。发根农杆菌中含有Ri 质粒,可以导致受伤部位产生毛发状根。Ti 质粒(包括Ri 质粒)上有一段转移DNA (transfer DNA ,又称T-DNA ),受伤的植物细胞中产生的化 学复合物可使农杆菌吸附于植物上,使T-DNA 转移到植物细胞内并整合到染色体上。 目前大量研究工作的目标是明确农杆菌将外 源DNA 导入受体细胞的分子机制,从而改进农杆菌菌株、 质粒和转化技术,以进一步提高转化效率。由于植物受体在转化过程中的作用尚不十分明确,所以农杆菌在转化过程中如何进入植物细

农杆菌介导转基因植物T-DNA的整合方式

HEREDITAS (Beijing) 2011年12月, 33(12): 1327―1334 ISSN 0253-9772 https://www.wendangku.net/doc/8e732990.html, 综 述 收稿日期: 2011?03?30; 修回日期: 2011?07?25 基金项目:国家科技重大专项(编号:2009CB118400)和国家自然科学基金项目(编号:30971795, 31071433)资助 作者简介:杨琳, 硕士研究生, 专业方向:生化与分子生物学。E-mail: myyanglin1986@https://www.wendangku.net/doc/8e732990.html, 通讯作者:李晚忱, 博士, 教授, 研究方向:玉米遗传育种与生物技术。E-mail: aumdyms@https://www.wendangku.net/doc/8e732990.html, 网络出版时间: 2011-10-18 8:50:47 URL: https://www.wendangku.net/doc/8e732990.html,/kcms/detail/11.1913.R.20111018.0850.002.html DOI: 10.3724/SP.J.1005.2011.01327 农杆菌介导转基因植物T-DNA 的整合方式 杨琳, 付凤玲, 李晚忱 四川农业大学玉米所, 成都 611130 摘要: 农杆菌介导的遗传转化已被广泛应用于植物转基因研究。作为外源基因的载体, 农杆菌T-DNA 片段在 植物基因组中的整合方式, 不仅影响外源基因的整合效率及稳定性, 还会影响外源基因的表达特性。文章就农杆菌介导的T-DNA 整合的两种主要模式、规律及相关研究手段进行综述, 为农杆菌介导的转基因及T-DNA 插入突变等相关研究提供借鉴。 关键词: 农杆菌; T-DNA; 侧翼序列; 整合; 转基因 T-DNA integration patterns in transgenic plants mediated by Agrobacterium tumefaciens YANG Lin, FU Feng-Ling, LI Wan-Chen Maize Research Institute , Sichuan Agricultural University , Chengdu 611130, China Abstract: The genetic transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens has been widely applied to research of transgenic plants. As the vector of the exotic genes, the integration patterns of T-DNA fragments affects not only transfor-mation efficiency and stability, but also expression properties of the transgenes. This review summaries the two major pat-terns and the rules of T-DNA integration in Agrobacterim -mediated transformation, rules of T-DNA mediated by Agrobac-terium tumefaciens , as well as research tools for flanking sequence amplification. It is attempted to provide references for researches on transformation and T-DNA integration mutation mediated by Agrobacterium tumefaciens . Keywords: Agrobacterium tumefaciens ; transfer DNA; flanking sequence; integration; transgene 目前有关植物转基因的方法主要分为两大类, 一类是无转化载体引导的DNA 的直接转化, 另一类是农杆菌介导的转化, 其中后者由于操作简单、转化效率高、插入片段稳定性好、转基因拷贝数低而成为转基因策略中的首选方法[1,2]。农杆菌细胞中含 有基因组DNA 和质粒DNA, 依农杆菌的不同, 质粒分别有Ti 质粒和Ri 质粒, 其上都有一段T-DNA 。农杆菌细胞侵染植物伤口后, 可将T-D N A 插入到植 物基因组中, 从而实现外源基因向植物细胞的转移与整合, 最后通过植物细胞和植物组织培养可

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