1021-03克伦特罗(一步法)说明书

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MaxSignal TM 克伦特罗酶联免疫反应测试盒使用说明书(M1021)

一. 简介

1．试剂盒描述

MaxSignal TM 克伦特罗酶联免疫反应测试盒适用于尿样、组织和饲料等中克伦特罗残留的定量检测。克伦特罗作为一种主要的 -兴奋剂应用于家禽生产中，用以提高肌肉和脂肪的比例并加快生长速度。由于克伦特罗可作为肌肉舒缓剂用于人类疾病治疗，在家禽中过量残留可能会对消费者造成危害，为此其已被禁止在食品生产中应用。根据美国FDA 和WHO 规定，在肌肉和脂肪中克伦特罗的含量不能超过0.2ng/g (ppb)，在肝脏和肾脏中其含量不能超过0.6 ng/g (ppb)。与传统的HPLC 或GC-MS 方法相比，酶联免疫方法具有操作简便、灵敏度高、成本低的优点。

MaxSignal TM 克伦特罗酶联免疫反应测试盒为养殖者和政府监督管理部门提供了更准确快速检测克伦特罗残留的方法，该试剂盒特点包括：

该试剂盒的专利提取方法将达到75-95%以上的回收率，可以不需用有机溶剂并在10-30分钟之内完成提取过程（而其他的方法将需4-6小时）。

高灵敏度（0.05ppb ）；低检测下限（肉类/脂肪0.025ppb ，尿液0.05ppb ，饲料0.2ppb ）。 检测过程只需要不到1.5小时。

高重复性。

2．试剂盒原理

MaxSignal TM 克伦特罗酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联免疫反应原理，微孔板上包被有克伦特罗的特异性抗体。测试分析时，样品和克伦特罗-HRP 耦合物共同孵育。如果样品中含有克伦特罗抗原，就会竞争抗体，从而阻止克伦特罗-HRP 耦合物与抗体结合。加入HRP 耦合物的底物(TMB)，在加入底物后将催化底物显色，根据颜色反应的灵敏度来确定样品中克伦特罗的浓度。颜色的深浅同样品中药物的浓度成反比关系。

3. 试剂盒组成部分及检测限

（1）试剂盒包括：

已包被抗体的酶标板(Clenbuterol Ab-coated Plate)（可拆式） . 12×8 孔 标准液(Standards)（0，0.05，0.15，0.5，1.5，4.5ppb ）........ 6×0.8mL 10ppb(Spiking)（做添加回收用） ................................................ 1×0.8ml 克伦特罗-HRP 耦合物(Clenbuterol-HRP Conjugate) ................... 1×7ml 200×样品提取液(Sample Extraction Buffer) ............................... 1×25mL 20×浓缩洗液(Wash Solution) ....................................................... 1×28mL 终止液(Stop Buffer)........................................................................ 1×20mL TMB 底物(TMB Substrate) ............................................................ 1×12mL 样品平衡液(Sample Balance Buffer) ............................................. 1×0.5mL 10×PBS .......................................................................................... 1×25mL （2）试剂盒的保存

本试剂盒应当在2-8℃的温度下储存，有效期为一年。如果超过3个月不使用试剂盒，请将HRP 耦合物放臵-20℃或者冰冻保存。

（3）样品检测下限

美国柏尔生物技术公司 (BIOO Scientific Co.)

（4）交叉反应数据

4．其他需要而本试剂盒未提的设备或材料

?酶标仪

?恒温培养箱

?匀质器

?旋转蒸发器或者氮吹仪

?漩涡振荡器

?移液器(10、20和100μL，1mL各一支)

?多道移液器（50-300μL）

二.警告

实验前请阅读以下文字，以保证获得最佳实验效果。

?标准品中含有克伦特罗，请小心使用。

?不要使用过期的试剂盒。

?不同批次的试剂盒不要混用，抗体和微孔板具有盒与批次的特异性。

?尽量保持室温20-25℃，避免在通风口操作防止温度过低，过热和/或者蒸发。同样的，不要在阳光直射下实验，防止过热及蒸发。在孵育期间，如果工作台温度过低，应该铺垫若干纸巾或者其他物料。

?水质量很重要，确保使用蒸馏或者去离子水。

?加入样品或者试剂到空的微孔板时，吸嘴靠于微孔接近底部，并保持接触。

?孵育时间的计算越规范越好，保持添加标准品的一致性，先添加标准品后添加样品。

?从低浓度到高浓度地添加标准品，降低影响标准品曲线质量的风险。

?将微孔板臵于放有干燥剂的密封袋中，冷藏保存。

三. MaxSignal T M Clenbuterol ELISA Test Kit检测方法

1．试剂的准备

所有的试剂在使用之前应将其回温至室温（约半小时），并在使用试剂前摇动几下，以保证合理的浓度。

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（1）1×工作洗液

按1：19的比例配制浓缩洗液和双蒸馏水。

（2）1×样品提取液

按1：199的比例配制样品提取浓缩液和双蒸馏水。

（3）1×PBS

按1：9的比例配制10×PBS和双蒸馏水。

2．样品的准备

2.1 饲料

2.1.1快速提取方法（该方法不适于检测预混料）

（1）取适量的饲料样品，加入4份1×样品提取液（如2g样品+8mL提取液），使用适当匀浆器匀质；

（2）取1.5ml匀质样品，室温4000g离心5分钟；

（3）移取0.5mL上清液；

（4）75℃孵育5分钟，最大速度漩涡振荡1分钟；

（5）室温4000g离心5分钟；

（6）移取0.3mL上清液到另一试管，加入7.5μL样品平衡液(pH值应该在6.5-7.5之间，若不在此范围内，建议用1M NaOH或HCl调pH)，直接检测。

稀释倍数：4.0

2.1.2有机溶剂提取法（该法适用于预混料和全价料）

（1）粉碎样品；

（2）称取1.5克匀质的样品，加入8mL乙腈和1mL乙酸乙酯，剧烈振荡3分钟；

（3）室温下4000g离心5分钟，移取6mL 上清液到另一个离心管；

（4）60-70℃减压蒸馏或者60-70℃氮气吹干；

（5）加入1mL正己烷溶解样品，加入1mL1×PBS溶液，最大速度漩涡振荡1分钟；

（6）4000g离心5分钟，取下清液作检测。

稀释倍数：1.0

2.2肌肉/肝脏/肾脏

2.2.1快速提取方法

（1）除去脂肪，使用适当匀浆器匀质；

（2）取0.5g匀质样品，加入1mL1×样品提取液，最大速度漩涡振荡3分钟或者摇床20分钟；

（3）室温4000g离心5分钟，移取0.5mL上清液到另一试管（避免接触脂肪层）；

（4）75℃孵育5分钟，最大速度漩涡振荡1分钟；

（5）室温4000g离心5分钟；

（6）移取0.3mL上清液到另一试管，加入7.5μL样品平衡液（pH值应该在6.5-7.5之间，若不在此范围内，建议用1M NaOH 或HCl调pH），直接检测。

稀释倍数：3.0

2.2.2有机溶剂提取法

（1）除去肌肉、肝脏或者肾脏中的脂肪，使用适当的匀浆器进行匀浆；

（2）取3g匀浆样品，加入8mL乙腈和1mL乙酸乙酯，最大转速漩涡振荡3分钟；

（3）室温（20-25℃）4000g离心5分钟；

（4）移取6mL上清液到另一新试管，60-70℃减压蒸馏，或者60-70℃氮气吹干；

（5）取1mL正已烷溶解干燥物，并加入1mL1×PBS溶液，最大转速漩涡振荡1分钟。（如果出现乳化现象，同时下层液量不足够检测，保证管子排气，85℃水浴3分钟）；

（6）室温下4000g离心5分钟，取100μL下清液进行检测。

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稀释倍数：0.5 2.3 牛奶

（1） 无脂牛奶用1×PBS 缓冲液稀释5倍（如20μL 牛奶+80μL 缓冲液）即可直接用于酶联反应的测试。

（2） 含脂牛奶在使用前需要以4000g 离心5分钟，除去上面脂肪层。取清液用1×PBS 缓冲液稀释5倍（如20μL 牛奶+80μL 缓

冲液），即可用于酶联反应测试。 稀释倍数：5.0 2.4 尿样 （1） 取0.5mL ，4000g 离心5分钟； （2）

取100μL 上清液作检测。

稀释倍数：1.0

备注：为减少背景值影响，建议使用1×PBS 溶液对尿样进行3~5倍稀释，用1M HCl 和1M NaOH 调节pH 在中性范围。如需做添加回收，请使用1×样品提取液对尿样进行3~5倍稀释后再做添加，1M HCl 和1M NaOH 调节pH 值在中性范围。

3．酶联免疫反应测试步骤

以下为计算份量的表格，用户可根据自己的需要来确定需要配臵多少试剂。

（1） 加入100μL 的标准品或样品于所设定的孔中；

（2） 在每孔中加入50μL 克伦特罗-HRP ， 轻轻摇动微孔板混匀1分钟； （3） 室温（20-25℃）孵育45分钟；

（4） 洗板3次，每次应该加入250μL 1×洗液，最后一次使板尽量甩干并在吸水纸上吸干； （

5） 加入100μL 的TMB 底物（底物本身无色，出现颜色变化不能使用）；

（6）

在室温下培养10~15分钟，加入100μL 的终止液终止反应，在450nm 下读OD 值(读数前使用无绒布擦拭微孔底部水分和指模)。

4．结果计算

（1）

分别计算标准、质控和样品的平均吸光度值和相对吸光度值。 相对吸光度值 (%) = (标准或样品吸光度值/零标准吸光度值) ? 100

（2） 以相对吸光度值为纵坐标，标准浓度为横坐标建立标准曲线。 （3） 从标准曲线上读取质控和样品的浓度值。 （4）

样品检测下限和定量下限计算方法如下：

样品检测下限 = (0.05ng/g) ? (稀释倍数) 样品定量下限 = (0.15ng/g) ? (稀释倍数)

备注：如结果呈阳性反应，应该用其他检验方法（如色谱/质谱方法等）进行确证。

以下曲线图是克伦特罗酶联免疫反应测试盒的典型标准曲线

四. 问题与解决

2.低吸光度（OD值）

3.过高的背景值或吸光度（OD值）

5.板间差异性大

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6.一个或者多个标准品数据点超出曲线范围

备注：中文翻译说明书仅供参考，具体明细请参照英文原件。

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