一株源于红树林土壤芽孢杆菌的鉴定及其蛋白酶学性质研究
一株源于红树林土壤芽孢杆菌的鉴定
及其蛋白酶学性质研究
谢为天，李红胜，刘
颖，徐春厚
（广东海洋大学农学院，广东湛江
524088）
摘
要：从湛江红树林土壤中分离出一株产蛋白酶的芽孢杆菌，通过细菌形态观察、生理生化试验及16S rRNA
基因序列进行分类鉴定，并研究了温度、pH 值、金属离子、EDTA 和吐温80等因素对该菌株发酵产蛋白酶的酶学性质的影响。结果表明，该菌株为解淀粉芽孢杆菌，命名为解淀粉芽孢杆菌y-6（Bacillus amyloliquefaciens strain y-6）；该菌株产生蛋白酶的最适温度为55℃，最适pH 为7.0~7.5，40℃时，酶活性稳定，保温3h 仍有95%以上的相对酶活力，pH 为5.5~11时，酶活性稳定，相对酶活力均在90%以上；Ca 2+、Zn 2+和吐温80对蛋白酶有一定的激活作用，Mn 2+、
Fe 3+、Cu 2+及EDTA 对酶有一定的抑制作用，其中EDTA 对酶的抑制作用最强。
关键词：芽孢杆菌；鉴定；蛋白酶；酶学性质；红树林中图分类号：Q814
文献标识码：A
文章编号：1004－874X （2014）09－0155-04
Study on identification and protease properties of a bacillus isolated from mangrove soil
XIE Wei-tian,LI Hong-sheng,LIU Ying,XU Chun-hou
(Agricultural College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China )
Abstract:A strain of bacillus which could produce protease was isolated from soil sample collected from a chicken farm,and was identified by the observation of its morphology,culture characteristics and the analysis of 16S rRNA sequence.The properties of protease excreted by isolate fermentation were studied with different temperature,pH,metal ion,EDTA and Tween 80.Results showed that,the isolate belonged to Bacillus amyloliquefaciens ,and was named Bacillus amyloliquefaciens strain Y-6,the optimal reaction temperature of protease produced by strain Y-6was 55℃,the optimal reaction pH was 7.0~7.5.The protease activity was steady at 40℃and at pH 5.5~11,the relative enzyme activity was more than 95%at 40℃for 3h,and was more than 90%at pH 5.5~11.The protease activity could be activated by Ca 2+,Zn 2+and Tween 80,but inhibited by Mn 2+,Fe 3+,Cu 2+and EDTA which had the biggest inhibition effect.
Key words:bacillus;identification;protease;enzymatic properties;mangrove
红树林位于热带、亚热带陆海交汇海湾河口地区的潮间带，生活着众多生物，构成了热带海洋潮间带独特的生态系统。特殊的生态环境、周期性的海水侵袭以及河口有机质的沉积和落叶的腐败作用使其富含有机质和腐殖质，为不同的微生物提供了特殊营养与生境，从而蕴含着极其丰富的微生物资源[1-2]。在红树林内，植物凋落、动物的残体非常丰富，因此具有丰富的分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶等酶类
的微生物类群[3]。
蛋白酶是能水解蛋白质肽键的一类酶的总称，用途广泛，种类繁多，是主要的工业化酶制剂品种之一，广泛应用于饲料、纺织、皮革、医药、食品、酿造、清洁剂等方面，其产量约占整个酶制剂产量的60%[4-5]。有研究表明，蛋白酶主要由芽孢杆菌属的细菌（如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌）及曲霉菌属的霉菌（黑曲霉、米曲霉）产生[5-6]，其中Bacillus licheniformis BF2、Bacillus subtilis
BH4、Bacillus stearothermophilus TLS33等芽孢杆菌是
目前几个商业微生物蛋白酶最重要的来源[7-8]。本研究对从湛江特呈岛红树林土壤中分离鉴出的一株产蛋白酶芽孢杆菌进行多相分类鉴定，并对其发酵产生的蛋白酶酶学特性进行初步研究，以期为该菌株的研究与应用提供试验数据。
收稿日期：2013-10-15
基金项目：广东省科技计划项目（2010B020313002）；雷州半岛红树林微生物资源调查与初步开发（粤科规划字[2009]198号）
作者简介：谢为天（1969-），男，硕士，实验师，E-mail ：xiewei
tian@https://www.wendangku.net/doc/841220264.html,
通讯作者：徐春厚（1962-），男，硕士，教授，E-mail ：xuchun
hou@https://www.wendangku.net/doc/841220264.html,
广东农业科学2014年第9期
155
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2014.09.015
图1菌株y-6的菌落形态与菌体形态（右图1000×）
1材料与方法
1.1
试验材料
待鉴定菌株y-6，分离于湛江市特呈岛红树林土壤，能产生蛋白酶和芽孢。蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、
KH 2PO 4、Na 2HPO 4、生化鉴定管，北京路桥技术有限公司；Mghty Amp DNA Polymerase Ver.2和2×Mighty Amp Buffer Ver.2（Mg 2+浓度4mmol/L ，dNTP 浓度800μmol/L ），宝生物工程（大连）有限公司产品；16S rRNA 细菌通用引物1492R ：5'-GGTTACCTTGTTACGAC -3'，27F ：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，上海英骏生物技术有
限公司合成。
试验仪器：PCR 仪，美国Labnet ；核酸快速提取仪，美国Q-Biogene 公司；凝胶成相系统，南昌新长征医疗科技发展有限公司；电泳仪，北京市六一仪器厂；可见分光光度计，上海棱光技术有限公司。
1.2试验方法
1.2.1培养基配制GYP 培养基（g/L ）：蛋白胨5.0、酵母粉5.0、葡萄糖20.0，121℃灭菌30min ；GYP 琼脂培养基：在GYP 培养基中加入琼脂粉20g/L ，121℃灭菌30min ；蛋白酶发酵培养基（g/L ）：豆粕粉30、玉米粉30、麸皮20、KH 2PO 40.5、Na 2HPO 43，115℃灭菌30min 。1.2.2菌株鉴定（1）形态观察及生理生化试验。按
《常见细菌系统鉴定手册》[9]相关方法及生化鉴定管操作说明书，观察待鉴定菌株y-6所形成的菌落特征及染色后显微镜下的菌体形态、芽孢形态等，并进行糖醇利用、淀粉液化、明胶液化、酪氨酸水解、V-P 试验、柠檬酸盐利用、溶菌酶抗性、生长温度、耐盐试验及pH 生长范围等生理生化试验。
（2）16S rRNA 基因序列分析及系统进化构建。挑取黄豆粒大小的待鉴定菌株的菌落于500μL 无菌双蒸水与少量海沙的1.5mL 的离心管中，用核酸快速提取仪以5.5r/min 的速度震摇30s ，加入500μL 氯仿反复颠倒20min ，12000r/min 离心5min ，上清液即为鉴定菌株的总DNA ；细菌PCR 扩增参照Lu 等[10]
提出的
方法。将测得的16S rRNA 序列与EzTaxon 中的核酸数据进行Blast 比对，搜索得到与其同源性最高的相关序列，采用软件Version 2.0的CLUSTAL －X 软件进行序列多重比对，使用MEGA 5.0软件包采用邻接法（Neighbor-Joining method ）进行聚类分析并构建细菌的
16S rRNA 基因系统发育树。
1.2.3蛋白酶酶学性质试验（1）粗酶液制备。将菌株y-6接种GYP 培养基，32℃培养24h ；将该培养物按3%接种于蛋白酶发酵培养基，32℃、180r/min 振荡培养48h ，将发酵液4000r/min 离心20min ，收集上清
液，用滤纸过滤即为待测粗酶液。蛋白酶活力测定采用
Folin 酚法[11]，用相对酶活力表示酶活性的变化：
相对酶活力（%）=粗酶液处理组/待测粗酶液
式中，粗酶液处理组是指经不同温度、pH 值、金属离子、EDTA 及吐温80处理后的待测粗酶液。
（2）酶作用的最适温度。取1mL 适当稀释的待测粗酶液与1mL 1%酪蛋白混合，在30~70℃（5℃为1个梯度）下反应10min ，测定酶活，以温度为横坐标，相对
酶活力为纵坐标作图。
（3）酶作用的最适pH 值。以1%酪蛋白为底物，分别采用柠檬酸-柠檬酸钠（pH 值5.0~6.0）、Na 2HPO 4-
NaH 2PO 4（pH 值6.5~7.5）、Tris-HCl （pH 值8.0~8.5）和硼砂-NaOH （pH 值9.0~11.0）组成的缓冲系统，将反应pH 值设定在5.5~10.5（0.5为1个梯度），作用10min ，测定酶活，以pH 为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图。
（4）酶的温度稳定性。将待测粗酶液分别在40、50和60℃的恒温水浴中保温0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0h ，取出后立即放入冰水中，测定酶活，以时间为横坐
标，相对酶活力为纵坐标作图。
（5）酶的pH 稳定性。将待测粗酶液分别用pH 值
3~11的生理盐水稀释5倍并在25℃下孵育1h ，取出后立即放入冰水中，测定酶活，以pH 为横坐标，相对酶
活力为纵坐标作图。
（6）金属离子、EDTA 及吐温80对酶活力的影响。将待测粗酶液中分别加入MgCl 2、CaCl 2、ZnCl 2、MnCl 2、
CuCl 2、FeCl 3、LiCl 、EDTA 及吐温80溶液，终离子浓度为1和10mmol/L ，40℃保温1h ，测定其残余酶活力。
采用JCM 与Excel 软件对试验数据进行分析。
2
结果与分析
2.1
菌株y-6的菌落形态与菌体形态
待测菌株y-6在GYP 平板上32℃培养24h 生长
良好，菌落乳白色、扁平、圆形或近圆形、湿润带光泽、中等大小；显微镜观察菌体形态为革兰染色阳性、杆状、散在、有芽孢，芽孢位于菌体次末端，芽孢不易形成（图1）。
2.2菌株生理生化试验
由表1可知，待测菌株y-6时发酵糖的耐力较强，
156
试验结果
++-+++----
试验类型
pH 7生长pH 8生长5℃生长10℃生长30℃生长40℃生长50℃生长
2%NaCl 生长3%NaCl 生长4%NaCl 生长试验结果
--+++---++试验类型鼠李糖山梨糖淀粉液化明胶液化柠檬酸盐利用酪氨酸水解
V-P 试验
溶菌酶抗性
pH5生长pH6生长
试验结果
+++++++++-
试验类型葡萄糖乳糖麦芽糖蔗糖果糖
D-木糖
L-阿拉伯糖
甘露醇肌醇半乳糖
表1
菌株y-6的生理生化试验
注：“+”表示阳性或能利用；“－”表示阴性或者不能利用
。
分枝上的数值：Bootstrap 检验的支持百分率(>50％)；T ：模式菌株
图2
基于16S rRNA 序列和Neighbor-Joining
法构建的系统发育树
120100806040200
相对酶活力（%）
30354045
5055606570
温度（℃）
图3温度对酶活性的影响
120100806040200
相对酶活力（%）
5.5
6.0
6.5
7.07.5
8.08.59.09.510.010.5pH
图4
pH 值对酶活性的影响
在pH 5~8及10~40℃范围内均能生长，但耐盐能力较弱。根据菌体形态特征及生理生化试验结果，初步鉴定
该菌株为解淀粉芽孢杆菌。
2.3菌株y-6的16S rRNA 序列分析
通过PCR 扩增，获得了菌株y-6的16S rRNA 基
因片段，琼脂糖凝胶电泳结果显示约为1400bp 。利用
Blast 软件将该片段序列与GenBank 中收录的DNA 序列进行比对，并与相关菌种构建进化树（图2）。结果表明，菌株y-6与Bacillus amyloliquefaciens strain PEBA 0801聚成一分支，同源性为100%，结合菌株形态及生理生化鉴定结果，确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌y-6（Bacillus amyloliquefaciens strain y-6）。
2.4菌株y-6酶学性质试验
2.4.1酶的最适作用温度温度是影响酶活性最重要的因素之一。由图3可知，反应温度为30~55℃时，y-6蛋白酶活性随温度升高而上升，55℃酶活性最高，之后
随温度升高酶活性降低。因此该蛋白酶最适作用温度为55℃，且在50~60℃都有较高的酶活性。
2.4.2酶的最适作用pH 值每种酶都有其最适作用pH 值，从图4可以看出，该蛋白酶的最适作用pH 为
7.0~7.5，酶活性在pH 5.5~7.0时呈上升趋势，随后呈下降趋势，在pH 8.0~9.5迅速下降，pH 9.5以后酶活性很
低。
2.4.3酶的温度稳定性从图5可以看出，该蛋白酶在40℃时，随着保温时间的延长，酶活力变化不大，保温3h 仍有95%以上的相对酶活力，说明该酶在常温环境下不易失活；50℃保温1.5h ，酶活力下降缓慢，之后下降速度变快；60℃时，随着保温时间的延长，酶活
力下降急速，说明该酶不适于高温下的应用。
2.4.4酶的pH 稳定性由图6可知，该蛋白酶不耐受
酸性环境，pH 值3环境下保存1h 检查出剩余酶活；
pH 值5以下，该酶易失活；pH 值5.5~11，酶活性相对稳定，相对酶活力在90%以上，这说明该蛋白酶主要耐
受碱性环境。
157
Tween 80103.6±0.53127.8±0.20
EDTA 18.6±0.368.1±0.35Li +
102.0±1.2597.4±0.26Fe 3+
86.4±0.4079.7±0.44Cu 2+
97.5±0.5092.6±0.36Mn 2+85.1±0.6067.6±0.60Zn 2+
103.5±0.87115.7±0.80Ca 2+
109.8±0.60122.2±0.40Mg 2+
101.2±0.9299.3±0.50离子浓度（μmol/L ）
110
表2
金属离子、EDTA 及吐温80对蛋白酶活性的影响
相对酶活力（%
）
120100806040200
相对酶活力（%）
3
4
567891011
pH
图6
pH 值对酶稳定性的影响
120
100806040200
相对酶活力（%）
0.5
1.0
1.5
2.0 2.5
3.0
时间（h ）
图5
温度对酶稳定性的影响
40℃50℃60℃
2.4.5金属离子、EDTA 和吐温80对酶活性的影响
在已知酶中，约有1/3的酶是金属酶或由金属激活的酶，大部分金属离子在酶促反应中作为辅助因子促进相应的酶促反应。本试验研究了Mg 2+、Ca 2+、Zn 2+、Mn 2+、
Cu 2+、Fe 3+、Li +、吐温80和EDTA 对酶的影响，结果见表2。从表2可以看出，Ca 2+、Zn 2+和吐温80对该菌产生的蛋白酶有一定的激活作用，Mn 2+、Fe 3+、Cu 2+和EDTA 对酶有一定的抑制作用，其中EDTA 的抑制作用最明显，10μmol/L EDTA 孵育30min 后相对酶活力只有8.1%，1μmol/L EDTA 孵育30min 后相对酶活力也仅有18.6%。
3讨论
解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很
高的细菌，在其生长过程中可以产生一系列代谢产物，主要是对细菌和真菌有抑制作用的抗菌物质[12-13]，亦可
产生淀粉酶[14]，但未见解淀粉芽孢杆菌能产生蛋白酶的文献报道。陈成等[12]从广州土壤中分离出一株解淀粉芽孢杆菌HNO6，而本研究从湛江红树林土壤中分离出一
株解淀粉芽孢杆菌y-6，该菌株能产生蛋白酶，酶活力可达2852U/mL 。
Deb 等[14]的研究表明，金属离子Ca 2+对解淀粉芽孢杆菌产生的淀粉酶有激活作用，Mn 2+、Zn 2+和Cu 2+有抑制作用，Mg 2+和Fe 2+的影响较小。赵丛等[15]对枯草芽孢杆菌ZC-7产生的中心蛋白酶的酶学性质进行了研究，表明EDTA 对该酶有抑制作用，Ca 2+、Mg 2+、Li +对其有保护作用。胡青平[16]对高产蛋白酶P5菌株（芽孢杆菌属）的酶学性质进行了研究，表明Ca 2+、Mg 2+、Fe 3+对酶活性有促进作用，Mn 2+对酶活性有抑制作用。孙妍等[17]的研究结果表明，金属离子Mn 2+和Zn 2+对纳豆芽孢杆菌NY-1产生的蛋白酶有激活作用，Fe 3+、Cu 2+和Mg 2+对酶活性有抑
制作用。
本研究从红树林土壤中分离出产蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌y-6菌株。金属离子Ca 2+对y-6菌株产生的蛋白酶有激活作用，Mn 2+和Cu 2+有抑制作用，与文献[14-16]报道的结果一致；Zn 2+对菌株Y-6产生的蛋白酶有激活作用，与文献[17]报道的结果一致，但与文献[14]报道的结果相反；Fe 3+
对菌株y-6产生的蛋白酶有明显的抑制
作用，与文献[17]
报道的结果一致，但与文献[16]报道的结
果相反；Mg 2+和Li +对菌株y-6产生的蛋白酶活性影响较小，与文献[14]报道的结果一致，但与文献[15]报道的结果不同。上述金属离子对酶活性的影响结果差异较大，可能与产酶菌株、酶的种类、酶的性质及测定方法不同等有关，具体原因还有待于进一步试验验证，且该菌株是否产生抑制致病菌的活性物质及其他水解酶类尚有待于进一步研究。
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（责任编辑储霞玲）
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