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胶乳增强免疫比浊法检测血清脂蛋白脂肪酶的研究

胶乳增强免疫比浊法检测血清脂蛋白脂肪酶的研究

Tetsuo Machida等日本群马大学医学研究院临床医学实验部

摘要

背景脂蛋白脂肪酶(LPL)通过催化甘油三酯的水解在富含甘油三酯的脂蛋白代谢中起关键作用。血清脂蛋白脂肪酶的含量测定有利于脂类代谢紊乱的诊断,但目前在临床上没有快速测定LPL的方法。

方法使用胶乳颗粒固定化的LPL单克隆抗体,我们探索了一种快速灵敏的胶乳增强免疫比浊法(LTIA)测定LPL的方法。实验使用生化分析仪器日立7700P进行检测,同时进行了ELISA平行实验来评价实验数据的可靠性。

结果通过稀释实验得到0.5-800ng/ml的校准曲线。批内变异系数被控制在2.2-2.5%。含有潜在干扰物质胆红素F和C以及血红素、甘油三酯、类风湿因子的样本未观察到干扰性。LTIA与ELISA的结果具有很好的相关性(n=40,r=0.967,y=0.99x-1.86)。肝素处理前的血清LPL正常参考范围值为50-77 ng/ml,肝素处理后血浆LPL正常参考范围值为354-410 ng/ml。

结论本文LTIA法既可用于测定肝素处理前的血清LPL值,也可用于测定肝素处理后血浆LPL值。本方法与ELISA相比更为方便快捷,非常适合用于临床常规检查。

1前言

LPL在脂类与脂蛋白的转运和代谢中发挥关键性作用[1,2],此酶负责乳糜内甘油三酯(TG)和极低密度脂蛋白(VLDL)的水解,分别形成乳糜和极低密度脂蛋白的残渣。血浆中LPL的常规检测方法是在静脉注射肝素后进行ELISA实验测定其活性和浓度。据报道在肝素处理前血清LPL具有比较高的浓度(大约30-100ng/ml),但LPL活性无法检测到,表明大部分循环LPL没有催化活性,只是其受体的配体[3,6]。

肝素处理后血浆LPL的浓度与活性的测定已被用于临床LPL缺失的诊断[2],但通常不能用于脂类代谢紊乱或心血管疾病风险性的诊断。这是因为肝素的注射使LPL从血管内皮细胞分离出来,因此检测结果不能直接反映循环LPL的生理或病理浓度。

Brunzell等[7]和Ikeda等[8]等此前报道了运用特异性单克隆抗体的LPL-ELISA检测人血浆LPL的方法,在检测前需要给病人静脉注射肝素。从检测时间和操作步骤角度考虑,ELISA法不适合在临床实验室进行大规模的常规检查。

因此,仍需要一种可靠、快速的自动化检测LPL的方法,且具有高灵敏度和校准稳定性,尤其是在肝素处理前血清LPL浓度的测定可能具有临床参考价值的情况下。在过去数十年间Shirai及其同事以

LPL-ELISA法检测了肝素处理前血清LPL的浓度,揭示了肝素处理前血清LPL浓度在心血管疾病和糖尿病中的临床意义[9-16]。

我们近期通过比对研究发现肝素处理前血清中LPL的浓度与肝素处理后的血浆中LPL的浓度可以替换[17]。肝素处理前血清中LPL浓度的测定可以使用自动分析仪检测,不需要提前为病人注射肝素,在高甘油三酯病人的临床诊断方面的应用更具有可操作性。由于肝素处理前血清中LPL的浓度足以用胶乳检测系统测定,我们使用胶乳颗粒固定化的LPL单克隆抗体,研究出了一种快速灵敏的胶乳增强免疫比浊法(LTIA)测定LPL的方法。我们所使用的全自动生化分析仪是日立7700P。我们以本方法和已商业化的ELISA试剂[18]对肝素注射(或未注射的)正常志愿者进行了检测,并将两种方法的检测结果做了相应比较。

2材料与方法

2.1试剂

聚苯乙烯胶乳颗粒购买自日本腾仓公司,胎牛血清白蛋白购买自Sigma公司。干扰性试剂血红素、甘油三酯、类风湿因子和胆红素F、C购买自日本希森美康公司。所有化学药品或试剂均是最高纯度级别。

2.2血液样品制备

本研究选择了美国戴维斯加州大学相对比较健康的年轻志愿者(部分为超重或偏胖)进行检测。男性19人,女性21人。白种人25个,亚洲人5个,西班牙人4个,非裔美国人3个,其他人员3个。平均年龄24岁,体质指数24。这些志愿者均在注射肝素(50U/kg)后进行了LPL活性检测[19]。加州大学戴维斯评审委员会批准了实验程序以及已签订书面同意书参与研究的受试者。在日本天使大学(位于日本札幌)征集了240个健康志愿者(男性170人,女性70人。平均年龄26岁,平均体质指数21.6),他们均有书面知情同意书,得到了大学伦理委员会的批准。

制备的血清用于测定精密度、灵敏度、交叉反应、稀释、回收实验和正常参考范围。

2.3抗LPL抗体的制备

在免疫生物学实验室制备了抗人类重组LPL的抗体。在小鼠腹水中取得抗LPL的单克隆抗体后,通过蛋白G琼脂糖(GE 医疗保健公司)分离两种球蛋白抗体的片段(57A5和88B8),用0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH2.5)洗脱, 再用PBS缓冲液透析。通过检测光密度估计抗体溶液中的蛋白浓度。

2.4胶乳颗粒固定的抗体试剂的制备

参考他人的胶乳标记免疫检测试验[19]对试剂进行了优化。聚苯乙烯胶乳珠子的直径和用于固定的抗体的量作了调整。我们此前的研究证实胶乳颗粒的体积对于检测范围有重大影响,固定化抗体的使用量与检测的灵敏度相关。为适合血清中LPL的范围,我们使用了0.3μm的胶乳颗粒。聚苯乙烯胶乳珠子(100mg,平均直接0.2μm)悬浮在1ml 0.01mol/l HEPES缓冲液(pH7.0)中。9ml抗体溶液(0.5mg/ml)与1ml 10%(重量/体积比)聚苯乙烯胶乳珠子悬浮液抚育在0.01mol/l HEPES缓冲液(pH7.0)中37℃1小时,然后以3:2的体积比在胶乳颗粒悬浮液中加入含有0.5%BSA的0.01mol/l的HEPES缓冲液。1小时以后,洗固定了抗体的胶乳珠子两次并离心,然后用10ml 0.01mol/l的HEPES缓冲液(pH7.0)重悬,重悬后的抗体胶乳珠子放在4℃储存。

2.5校准品的制备

用于室内LPL测定的校准品是在免疫生物学实验室(日本滕冈市)用仓鼠细胞(CHO)产生的重组LPL,溶解在Tris-HCL缓冲液(pH8.0)中。为了评价我们的校准品,从积水医疗公司购买具有已知浓度的校准品作为对照。

2.6检测程序

样品的加样与检测均由自动生化分析仪日立7700P(日立仪器工程公司)全自动完成。检测程序很简单,4μl血清样品和160μl试剂1(0.01mol/l HEPES缓冲液, pH7.0)首先加入到比色皿中,37℃抚育5min,然后加入54μl试剂2(抗体固定化的胶乳珠子悬浮在0.01 mol/l HEPES缓冲液, pH7.0),启动免疫比浊反应。5min后,根据在800nm主波长两个读数点(加入试剂2前、加入试剂2反应5min)之间的吸光度变化计算出LPL的浓度。通过对6个校准品的反应检测获得了校准曲线并以此来计算血清中LPL的浓度。使用LPL-ELISA试剂盒(积水医疗,东京)做了ELISA检测。

2.7统计学分析

所有分析均由Dr. SPSS II软件包(SPSS公司)完成。提供的数据是平均值、25%和75%的值,而不是平均值和标准差。因为LPL的浓度不是正常分布的。计算了LTIA和ELISA之间的皮尔森相关系数。计算了LPL与甘油三酯(TG)、高密度胆固醇(HDL-C)、低密度胆固醇(LDL-C)、脂蛋白残粒胆固醇(RLP-C)、小而密低密度脂蛋白胆固醇(sd LDL-C)和载脂蛋白C III之间的单变量分析。LPL与上述脂类参数的相关性通过斯皮尔曼(Spearman)相关系数进行评价。P<0.05认为具有统计学显著意义。

胶乳增强免疫比浊法检测血清脂蛋白脂肪酶的研究

图1. LTIA的线性。在生化分析仪日立7700P上检测了LPL的线性。肝素处理前的血清(图1A)和肝素处理后血浆(图1B)LPL浓度的检测分别各用了一组校准品。

3.结果

3.1线性

以6个浓度梯度的重组LPL(0, 50, 100, 200, 400和800ng/ml)来拟合校准曲线。用生理盐水稀释(最高达10倍)样本,每个稀释样本重复检测三次,评价其线性。检测范围在0-200ng/ml和0-800ng/ml,与理论值的偏差未超过5%,说明平行性和线性良好(图1A和B)。结果表明在低值(150 ng/ml)和高值(800ng/ml)范围均有比较好的线性。

表1批内精密度(对低值、中值和高值分别分析)

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为了评价LTIA的精密度,我们进行了重复实验(表1)。收集的3组血浆等分到1.5ml的塑料管中-70℃

冷冻保存。校准后在一天内分析了三个样品10次。如表1所示,32ng/ml的批内变异系数是5.5%,100 ng/ml 的批内变异系数是2.4%,280 ng/ml的批内变异系数是2.2%。

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图2.以零校准加2.6 10次重复检测值的平均吸光度来估计检测限度(LPL concentration: LPL浓度;Dilution:稀释梯度;Theoretical value:理论值; average: 平均值)

3.3低值检测限度

图2显示,浓度估计值与10个重复结果的平均值基本一致。本检测的最低限度是10.7ng/ml。

3.4污染

我们在检测较高浓度的样本(400ng/ml)后检测生理盐水,在日立7700P未发现可检测到的LPL污染。

3.5血浆中LPL的稳定性

新鲜的样本与4℃保存2天的样本或反复冻融的样本之间不存在显著差异,表明LPL具有很好的稳定性(详情未提供)。这些检测结果与ELISA法[18]的检测结果一致。

3.6干扰性

通过在血清样本中加入可能的干扰性物质并检测吸光度的变化来评价抗干扰能力(图3)。我们研究了血红蛋白、甘油三酯(TG)、类风湿因子()和游离胆红素F、C对于LPL检测的影响。高达200mg/L胆红素F、C未影响检测准确度。5g/l的血红蛋白、1500FTU的甘油三酯和500IU/ml的类风湿因子也未影响检测准确度。LPL回收实验偏差是初始浓度的10%以内(数据未提供)。结果表明所添加的这些干扰性物质未对LPL的准确检测造成干扰。

胶乳增强免疫比浊法检测血清脂蛋白脂肪酶的研究

图3. 干扰性测试。(Unconjugated bilirubin非结合胆红素;conjugated bilirubin结合胆红素;Turbidity浊度;Hemoglobin血红素;

Rheumatoid Factor类风湿因子)。

3.7 LTIA与ELISA的相关性

为了对比LITIA与ELISA的结果,对肝素处理前的血清和肝素处理后的血浆都用两个不同范围的校准品进行了分析。如图4A所示,回归统计计算方程(n=40)为y(LTIA)=0.845x(ELISA)+4.433,r =0.965。如图4B所示,即使在相对比较高值的血浆中,LPL值在0-600ng/ml(n=40),相关性回归方程为y(LTIA)=0.871x(ELISA)+10.114,r =0.942。说明LTIA与ELISA两种检测方法的相关性良好。我们绘制了

Bland-Altman图来展示两种检测方法的差异[21]。差异图表显示用LTIA和ELISA检测的结果是有差异的,两种方法95%的置信界限分别是±13ng/ml和±31ng/ml。两种免疫检测法的平均差分别是6.8ng/ml和

45ng/ml,表明两种方法没有连续性偏倚。LPL浓度高于300ng/ml时,变异系数有一定程度的增大,这并

不被认为会降低本方法的可靠性或潜在用途,因为风险评估主要面向低值范围。

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图4.测定LPL的LTIA法与ELISA法的相关性。图中数据显示了测定LPL浓度的LTIA法(y轴)和ELISA法(x轴)回归相关性分析。图4A显示了在低浓度范围内(<150ng/ml)的数据,图4B显示了在高浓度范围内(<600ng/ml)的数据。Bland-Altman 图分别显示了图4A、B中LTIA与ELISA读数值在不同LPL浓度的分布情况。x轴为2次读数的平均值,y轴显示两种方法的

差异。直线代表95%的置信区间。图中的回归线表明两种方法的平均差异很小,没有对其中一种方法的连续倾向性。

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图5.美国健康志愿者肝素处理前的血清(图5A)和肝素处理后的血浆(图5B)LPL浓度柱状图。男性与女性的LPL浓度不存在分布差异。LPL浓度的中值和25%、75%(参考区间)值在图中做了标注。肝素处理后的LPL浓度明显比肝素处理前的高。(Frequency:频率,median:中值。)

3.8健康志愿者血浆LPL浓度

对40个空腹状态的美国健康志愿者肝素处理前的血清(图5A)和肝素处理后的血浆(图5B)测得的LPL 平均值分别是50.3ng/ml(范围在50-77ng/ml(25% tile-75% tile))和381ng/ml(范围在354-411ng/ml(25%

tile-75% tile))。对240个空腹状态的日本健康志愿者(170个男性,70个女性,年龄在20-72岁之间)肝素

处理前血清中测得的LPL平均值是57.7 ng/ml(范围在49-67ng/ml(25% tile-75% tile))(图6)。

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图6.日本健康志愿者肝素处理前血清LPL浓度柱状图。男性与女性的LPL浓度不存在分布差异。LPL浓度的中值和25%、75%(参考区间)值在图中做了标注。肝素处理后的LPL浓度明显比肝素处理前的高。(Frequency:频率,median:中值。)

在血清和EDTA血浆样本之间未检测到显著性差异。表2显示了多种脂类参数的单变量相关系数分析。

LPL与HDL-C显著正相关,与TG、RLP-C负相关。

表2. LPL浓度与其它脂类参数单变量相关系数分析.

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4.讨论

研究本LPL胶乳检测系统的主要目的是检测肝素处理前血清的LPL浓度便于在临床实验室常规检测,不需要在血液抽取前注射肝素。在临床试验中肝素的注射对于LPL的检测是一大障碍。尽管已知LPL在未肝素处理的血清中没有活性,它的浓度高到足以被胶乳检测系统和ELISA检测到。据我们了解,这是第一例用胶乳检测系统检测血清LPL浓度的报道。本系统提供了一种快速灵敏的LPL检测方法,可用于临床常规检测,将来也可以应用于更广泛的冷冻样品的流行病学研究。

为了便于平常在临床实验室检测未肝素处理的LPL的浓度,我们研究开发了一种胶乳颗粒增强型免疫比浊法用于检测肝素处理前的血清或肝素处理后血浆中LPL的浓度,将检测结果与ELISA的检测结果[18]做了比较。本检测方法只需要在自动生化分析仪上10min时间即可检出。ELISA批内变异系数在2.2-2.5%范围内。因此,我们的检测方法具有优越的再现性使得此便捷检测系统更有价值。在临床实验室,对于低值范围LPL(甚至低于10ng/ml)的检测变得可行。本实验检测的最低值是10.7ng/ml,可用于高血脂血清的检测,这与此前报道的ELISA的检测限度是一致的。关于准确度和分析时间,本方法优于ELISA,与此前Imamura所报道的肝素处理后血浆LPL的检测[22]很相似(数据未提供)。

使用日立7700P等全自动生化分析仪的重现性、简易性和全自动化是能够应用于临床常规诊断的关键。本LTIA检测法提供了一种与ELISA相比具有更准确、易操作和更快的优点的脂连蛋白检测系统。

肝素处理后的LPL浓度比肝素处理前的LPL浓度高5-10倍,但通过LTIA检测到的LPL浓度在准确测量的范围以内。对于健康的日本个体,肝素处理前LPL的浓度与TG、RLP-C负相关,与HDL-C正相关,这与LPL-ELISA的报道[18]一致。

肝素处理前LPL浓度的检测可能具有临床意义,因为无需提前注射肝素,可以发现LPL缺陷型案例,比如高甘油三酯的IV和V型。

总之,研究表明本胶乳增强免疫比浊法与LPL-ELISA具有较高的相关性,为临床实验室提供了一种强大易操作的不需要注射肝素的检测LPL的备用方法。

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