C-kit基因突变检测试剂盒(测序法)说明书
C-kit基因突变检测试剂盒(DNA测序法)说明书
C-kit Related Mutation Detection Kit(DNA Sequencing Analysis)
【产品名称】
通用名：C-kit基因突变检测试剂盒(测序法)
英文名：C-kit Related Mutation Detection Kit(DNA Sequencing Analysis)
【包装规格】24人份?盒
【预期用途】本试剂盒适用于C-kit基因9、11、13、17外显子突变的检测，从而辅助胃肠道间质瘤的临床诊断及指导临床用药。
【检测原理】本试剂盒采用荧光定量PCR扩增人基因组中C-kit基因，并对扩增的片段进行测序分析。使用尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR扩增产物的污染。
【主要组成成份】
产品组成主要成分规格及装量C-kit9PCR缓冲液引物、探针、buffer、dNTPs等480μL×1管
C-kit11PCR缓冲液引物、探针、buffer、dNTPs等480μL×1管
C-kit13PCR缓冲液引物、探针、buffer、dNTPs等480μL×1管
C-kit17PCR缓冲液引物、探针、buffer、dNTPs等480μL×1管Taq酶混合物Taq酶+UNG酶24μL×4管C-kit9阳性质控品含有C-kit9扩增目的基因片段的重组质粒40μL×1管
C-kit11阳性质控品含有C-kit11扩增目的基因片段的重组质粒40μL×1管
C-kit13阳性质控品含有C-kit13扩增目的基因片段的重组质粒40μL×1管
C-kit17阳性质控品含有C-kit17扩增目的基因片段的重组质粒40μL×1管阴性质控品DEPC H2O40μL×4管C-kit9测序引物引物48μL×1管
C-kit11测序引物引物48μL×1管
C-kit13测序引物引物48μL×1管
C-kit17测序引物引物48μL×1管
SAP酶混合物CIAP+EOXI48μL×4管测序试剂Bigdye及缓冲液24μL×4管
【储存条件及有效期】-20℃避光保存，避免反复冻融，有效期：6个月。
【适用仪器】测序仪器：ABI310、ABI3100、ABI3130/ABI3130XL、ABI3730等基因分析仪。
【样本要求】本试剂盒适用于人胃肠道间质瘤组织全基因组DNA检测，可选用本公司配套的石蜡提取试剂盒或QIAamp DNA FFPE Tissue Kit。【检验方法】
1.试剂准备(试剂开管前请完全解冻后充分混匀并短暂离心)
配制：按每个反应取PCR反应液20μL、Taq酶混合物1μL计算，乘以所需的反应管数(建议酌情可多配一个反应量)，
分装：用微量加样器在每一PCR反应管内加入21μL上述混匀的反应液，存于4℃。
注意：最好在DNA提取结束后配制反应液。
2.加样：在上述准备的装有混合反应液的PCR反应管中加入标本的DNA4μL。
3.PCR反应：在ABI系列及Stratagene系列PCR检测仪设定如下程序：
PCR荧光定量仪器型号保温45循环保温ABI系列以及Mx3000P等
Stratagene系列
37℃2分钟
94℃4分钟
①94℃15秒②60℃45秒25℃恒温
ABI系列在PCR循环第二步60℃是收集荧光信号。
4、反应完毕，存储结果以便进行数据处理。
5、PCR产物的酶解
对C-kit DNA含量CT≤30的PCR产物取5μL，再加入2μL SAP酶混合物震荡混匀，瞬时离心，37℃60分钟，80℃15分钟。
6、测序PCR反应
选取阳性PCR酶解产物3μL、测序试剂1μL和测序引物2μL进行PCR扩增，具体条件：
变性25循环恒温96℃1分钟①96℃10秒②50℃5秒③60℃4分钟4℃
7、测序产物纯化
96孔板整板离心方法：
(1)在每孔内加入16μL醋酸钠-乙醇混合物(3M NaAc:无水乙醇=1：15)，剧烈震荡，避光静置15分钟
3500g以上4℃离心半小时。倒置96孔板于吸水纸上，500g短暂离心。
(2)加入70μL70%预冷乙醇，剧烈震荡，3500g以上4℃离心15分钟。倒置96孔板于吸水纸上，500g
短暂离心。
(3)加入70μL70%乙醇，温和颠倒数次混匀(不要剧烈震荡)，3500g以上4℃离心5分钟。倒置96孔板
于吸水纸上，500g短暂离心。
(4)让酒精在室温挥发干净，加入10μL Hi-Di Formamide溶解DNA。
(5)在PCR仪上变性：95℃4分钟，4℃4分钟。上机电泳。
单个0.2ml离心管离心方法：
(1)在每孔内加入16μL醋酸钠-乙醇混合物(3M NaAc:无水乙醇=1：15)，剧烈震荡，避光静置15分钟
12000g以上4℃离心半小时，吸弃上层液体。
(2)加入70μL70%预冷乙醇，剧烈震荡，12000g以上4℃离心15分钟，吸弃上层液体。
(3)加入70μL70%乙醇，温和颠倒数次混匀(不要剧烈震荡)，12000g以上4℃离心5分钟。吸弃上层液
体。
(4)让酒精在室温挥发干净，加入10μL Hi-Di Formamide溶解DNA。
(5)在PCR仪上变性：95℃4分钟，4℃4分钟。上机电泳。
在自动化的基因分析仪上进行测序。若不能当日测序，可置-20℃保存。
【检测结果分析】
Exon
Exon99号外显子突变分析
运行Chromas程序，一一打开测序结果按下列流程进行分析：
(1)删除不稳定的测序区域及内含子区域(注意：此步骤决不能省略)
按Find快捷键，找到序列“GATGTGGGC”、移动光标至“G”左侧的一个碱基上，按快捷键Alt+L选中测序前段不稳定区域。在Edit菜单下点击“Delete Cutof f Sequences”删除以上区域；按快捷键Ctrl+1，显示氨基酸序列，对比C-kit9外显子正常的序列，确定突变的位置。
(2)将其后面的序列与下面野生型序列对比，标记处可能发生Ala502-Tyr503区段的6碱基重复突变。
核苷酸(野生型)GATGTGGGCAAGACTTCTGCCTA TTTTA ACTTTGCA TTTA AA
氨基酸(野生型)D V G K T S A Y F N F A F K
核苷酸(突变型)GATGTGGGCAAGACTTCTGCCTA TG CCTA TTTTAACTTTGCA TTTAAA
氨基酸(突变型)D V G K T S A Y A Y F N F A F K
Exon
Exon1111号外显子突变分析
运行Chromas程序，一一打开测序结果按下列流程进行分析：
(1)删除不稳定的测序区域及内含子区域(注意：此步骤决不能省略)
在Edit菜单下点击“Reverse+Complement”，按Find快捷键，找到序列“TCCCCACAG”、移动光标至“T”左侧的一个碱基上，按快捷键Alt+L选中测序前段不稳定区域。在Edit菜单下点击“Delete Cutof f Sequences”删除以上区域；按快捷键Ctrl+1，显示氨基酸序列，对比C-kit11外显子正常的序列，确定突变的位置。
(2)将其后面的序列与下面野生型序列对比，标记处可能发生Lys550-V al560区段的突变，看其是否存在缺失，如果不存在缺失，则判为野生型；如果存在缺失，则判为突变型。
核苷酸(野生型)TCCCCACAGAAACCCA TGTA TGAAGTACAGTGGAAGGTTGTTGAGGAGATA
氨基酸(野生型)S P Q K P M Y E V Q W K V V E E I
Exon13号外显子突变分析
运行Chromas程序，一一打开测序结果按下列流程进行分析：
(1)删除不稳定的测序区域及内含子区域(注意：此步骤决不能省略)
按Find快捷键，找到序列“GGTAATCAC”、移动光标至“G”左侧的一个碱基上，按快捷键Alt+L选中测序前段不稳定区域。在Edit菜单下点击“Delete Cutof f Sequences”删除以上区域；按快捷键Ctrl+1，显示氨基酸序列，对比C-kit13外显子正常的序列，确定突变的位置。
(2)将其后面的序列与下面野生型序列对比，标记处可能发生654位点(Val→Ala)突变。
核苷酸(野生型)GGTAATCACA TGAATA TTGTGAATCTA CTTGGAGCCTGC
氨基酸(野生型)G N H M N I V N L L G A C
核苷酸(突变型)GGTAATCACA TGAATA TTGCGAATCTACTTGGAGCCTGC
氨基酸(突变型)G N H M N I A N L L G A C
Exon17号外显子突变分析
运行Chromas程序，一一打开测序结果按下列流程进行分析：
(1)删除不稳定的测序区域及内含子区域(注意：此步骤决不能省略)
按Find快捷键，找到序列“CTA GCCAGA”、移动光标至“C”左侧的一个碱基上，按快捷键Alt+L选中测序前段不稳定区域。在Edit菜单下点击“Delete Cutof f Sequences”删除以上区域；按快捷键Ctrl+1，显示氨基酸序列，对比C-kit17外显子正常的序列，确定突变的位置。
(2)将其后面的序列与下面野生型序列对比，标记处可能发生816、820、822和823位点的突变。
核苷酸(野生型)CTAGCCAGAGAC A TCAAGAATGA TTCTAATTA TGTGGTTAAA
氨基酸(野生型)L A R D I K N D S N Y V V K
核苷酸(突变型)CTAGCCAGAGTCA TCAAGAATTA TTCTAAGGATGTGGTTAAA
氨基酸(突变型)L A R V I K N Y S K D V V K
【生产企业】北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司
【生产地址】北京经济技术开发区康定街1号国盛科技工业园14号楼二层
【电话】010-********
【传真】010-********
【邮编】100176
【医疗器械生产企业许可证编号】京药监械生产许20090031
【说明书批准及修改日期】2011年8月第一版