人核迁移蛋白C在毕赤酵母中的融合表达
毕赤酵母实验操作技巧介绍材料
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制
His_FemA融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达
【收稿日期】2012-04-27【基金项目】湖南省自然科学基金资助课题(10JJ5027);中南大 学自由探索研究创新基金(2010112001166)【作者简介】(1971-)，男，副主任技师，医学博士，硕士生导师， 从事细菌耐药性及耐药机制研究，Email :zoumingx-iang@126．com ;范学工，通讯作者，教授，博士生导 师， Email :xgfan@hotmail．com 文章编号:1005- 376X (2012)10-0878-05【论著】 His-FemA 融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达 邹明祥1，李军1，邬国军2，武文君3，张宁洁1，刘文恩1，范学工4 (1．中南大学湘雅医院检验科，湖南长沙410008;2．中南大学基础医学院微生物学系，湖南长沙410078;3．河南中医学院第一附属医院检验科，河南郑州450000;4．中南大学湘雅医院感染病科，湖南长沙 410008) 【摘要】目的构建His 标签的金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药相关蛋白FemA 的融合蛋白表达载体，并在大肠 埃希菌中表达， 为进一步研究femA 基因的生物学功能和临床应用奠定基础。方法根据GenBank 中金黄色葡萄球菌femA 基因序列，利用Primer Premier 5．0设计PCR 引物，并在引物的5'加入BamH I 及Sal I 酶切位点;以金黄色葡萄球菌 基因组DNA 为模版，PCR 扩增出femA 基因片段。将目的DNA 片段及质粒pQE30分别进行双酶切、连接并转化大肠 埃希菌DH5α;阳性克隆以PCR 、双酶切及测序进行鉴定。将鉴定正确的pQE30-femA 重组质粒转化大肠埃希菌JM109，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG )诱导表达His-femA 融合蛋白;采用SDS-PAGE 及Western blot 分析对表达蛋白进行验证。结果经PCR 、双酶切鉴定及序列测定，证实重组质粒pQE30-femA 构建成功;重组质粒pQE30-femA 转化大肠埃希菌JM109经IPTG 诱导后， SDS-PAGE 和Western blot 分析显示表达出53kD 目的蛋白;经Bandscan 软件分析，目的蛋白质在4h 的表达量占细胞总蛋白的27．5%。结论成功构建了His-FemA 原核表达载体(pQE30-femA )，并在大肠埃希菌中高效表达。 【关键词】金黄色葡萄球菌;femA 基因;原核表达;融合蛋白 【中图分类号】R378．1+1 【文献标识码】A Construction of His-FemA fusion protein expression vectors and the expressions in pro-karyotic cells ZOU Ming-xiang 1， LI Jun 1，WU Guo-jun 2，WU Wen-jun 3，ZHANG Ning-jie 1，LIU Wen-en 1，FAN Xue-gong 4 (1．Department of Clinical Laboratory ，Xiangya Hospital of Central South University ，Changsha 410008，China ;2．Department of Microbiology ，School of Basic Medicine ，Central South University ，Changsha 410078，China ;3．Department of Clinical Laboratory ，the First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine ，Zhengzhou 450000，China ;4．Department of Infectious Diseases ，Xiangya Hospital of Central South University ，Changsha 410008，China ) 【Abstract 】Objective To construct His-tagged FemA fusion protein expression vectors ，and express it in E．coli and establish foundation for further studies．Methods PCR primers were designed using Primer Premier 5．0software according to the sequence of femA gene in GenBank．Two restriction endonuclease recognition sites BamH I and Sal I were added to the 5'end of the primer．Genomic DNA from S．aureus was used as the templete for PCR amplification of femA gene．The obtained femA gene and plasmid pQE30were double-enzyme digested respectively ，ligated and transferred into DH5α．The positive clones were selected and the recombinant plasmid pQE30-femA was identified by PCR ，restriction endonuclease analysis and DNA sequencing．Then the identified pQE30-femA was transformed into E．coli JM109and the target protein expression was in-duced by IPTG．The expressed product was identified by SDS-PAGE and Western blot．Results Verified by PCR ，double-en-zyme digested assessment and sequencing ，recombinant plamid pQE30-femA was successfully constructed．SDS-PAGE and Western blot analysis revealed that the recombinant plasmid pQE30-femA expressed a 53kD target protein in E．coli JM109． Bandscan software analysis showed that the expressed target protein at 4h accounted for about 27．5%of the total bacterial pro-tein．Conclusion The His-tagged femA fusion protein expression vectors (pQE30-femA )was successfully constructed and high-effectively expressed in E．coli ． 【Key words 】Staphylococcus aureus ;FemA gene ;Prokaryotic expression ;Fusion protein 金黄色葡萄球菌是威胁人类健康的重要致病菌， 可引起化脓性感染、食物中毒、表皮剥脱综合征以及血流感染等多种疾病。随着抗菌药物的广泛使用， 金黄色葡萄球菌的耐药现象日趋严重［1，2］ 。其中，耐 甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA )不仅具有严重的多重耐药性，同时具有广泛的流行性，极大地增加了患者和社会的医疗负担，已成为全球严重的公共卫生
酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的
毕赤酵母表达系统研究进展
毕赤酵母表达系统研究进展 作者：齐连权， 陈薇， 来大志， 于长明， 王海涛 作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071 刊名： 中国生物工程杂志 英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2002,22(6) 被引用次数：11次 参考文献(21条) 1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04) 2.查看详情 3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 4.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(1) 5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29) 6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08) 7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03) 8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04) 11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02) 12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 1997 13.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1) 14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊] 2001(04) 15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)
外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略
第22卷 第3期 吉首大学学报(自然科学版)Vol.22 No.3 2001年9月J ournal of J ishou University(Natural Science Edi ti on)Sept.2001 文章编号:1007-2985(2001)03-0040-05 外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略 聂东宋,梁宋平,李 敏 (湖南师范大学生命科学院,湖南长沙 410081) 摘 要:高效表达外源蛋白,在理论和实践上特别是在生物制药中具有重要意义,巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.影响外源蛋白在P.pas toris中表达的因素很多,主要包括外源基因自身的特性、载体、宿主细胞几个方面,了解和灵活运用它们的联系,有助于获得外源基因在P.pastoris中的高效表达. 关键词:巴氏毕赤酵母;外源蛋白;高效表达 中图分类号:Q75 文献标识码:A 巴氏毕赤酵母(P.pastoris)是一种单细胞真核生物,基因工程菌近年来已被广泛用于商业化生产外源蛋白.与其它表达系统比较,该系统具有以下优点:(1)高表达.该表达系统利用醇氧化酶基因启动子很强,细胞生长速度快,所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高,如破伤风毒素蛋白的产量高达12g/L[1],其它表达系统一般为毫克级.(2)高稳定.由于该表达系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在,而是整合到酵母染色体上,所以构建的菌株十分稳定.(3)高分泌.P.pastoris中一些分泌信号和先导序列如a-因子的分子生物特性已研究得十分清楚,加之它身体的生物学特性,其分泌表达可达10g/L,这在已知的分泌表达系统中是十分罕见的.虽然已有许多蛋白在P.pastoris中实现了高效表达,但仍有一些蛋白表达量相对较低,如 -cryptogein表达量级为1~5mg/L[2],AFP在摇瓶中表达时最高水平不超过5mg/L[3],有些甚至不能表达,如HIV表面糖蛋白[4].此外,酵母表达系统的局限性还在于分泌表达产物的不均一性,如信号肽加工不完全,表达产物内部降解等现象[5] 其次,当利用该系统的载体将外源基因通过双交换整合到宿主体中AOX1基因位置时,AOX1基因被破坏,这样使细胞利用甲醇能力大大降低.从而大大延长了细胞培养发酵时间.这种外源蛋白表达的差异,一方面是由于外源基因本身的特性而引起的,另一方面,表达条件也对表达量起了极其重要的作用.笔者综述了影响甲醇酵母中外源基因高效表达的各种因素,并阐述了优化外源蛋白在P.pastoris中高效表达的策略. 1 外源基因本身的特性对表达的影响 1 1外源基因的A+T组成 外源基因本身的4种核苷酸的组成对基因的表达起重要作用.许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录,共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号 Caro1A Scorer[6]在表达人免疫缺损病毒(HI V)包膜糖蛋白gp120时,这个信号造成了gp120的转录提前终止.提前终止被认为是一种具有种族特异性的现象,如在P.pastoris中不能表达的HIVE NV蛋白在酿酒酵母中表达良好.[4]因此,可以通过调整高A+T含量区的核苷酸的组成来避免提前终止的发生,使其A+T含量在30%~50% 收稿日期:2001-08-05 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670392) 作者简介:聂东宋(1967-),男,湖南省衡阳县人,湖南师范大学硕士研究生,主要从事基因结构与功能研究.
毕赤酵母化学转化
（化学转化） 如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。 主要过程为： 取过夜活化培养的菌液按1：1000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600达到0.8-1.0；4℃，4500rpm离心5分钟，用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体，倾除洗涤液，用1mL ，4℃，4500rpm离心5分钟，沉淀用50μl冰预冷的100mmol/L LiCl悬浮，最后定容至80-90ml。 LiCl转化取适量单链鲑精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上备用，取上述制备好的感受态细胞12 000rpm，离心15s，吸弃LiCl溶液，按顺序依次加入 50%PEG 240ml 1mmol/L LiCl 36 ml 单链鲑精DNA 25ml 线性化质粒DNA 10 ml (约10mg) 用吸头反复吹打，使细胞沉淀与加入的溶液混匀，30℃静置温育30min，42℃热击20-25min，4500rpm离心10min，吸弃转化液，细胞沉淀加1ml YPD培养基于30℃200 rpm培养2-4hr，取转化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培养2-3天。 LiCl 转化方法 作为电转化的替代方法，在线性化DNA条件下，转化效率介于102~103cfu/ug 之间 溶液： 1M LiCl 用无离子水溶解，过滤除菌。（稀释使用无菌水。） 50% PEG 3350 无离子水溶解，过滤除菌，密封保存 2mg/ml变性的鲑精DNA片段（10mM Tris-HCl，pH 8.0,10mM EDTA）-20℃保存。 准备感受态细胞： 1.在50ml YPD中，培养至OD600 在0.8~1.0之间（大约108个/ml）。 2.收集细胞，用25ml无菌水洗涤，1500g室温离心10min。 3.重悬细胞于1ml 体积的100mMLiCl中，将悬液转移至1.5ml离心管中。 4.使用最大转速离心15s，吸去LiCl上清。 5.重悬细胞于400ul体积的100mMLiCl中。 6.每个转化组取50ul细胞悬液置于1.5ml离心管中，立即使用。勿要存于冰上或冻存于 -20℃。 转化： 1.取1ml单链DNA鲑鱼精标准煮沸5min，后快速于冰上降温并存于冰上。注意：不需要 也不推荐在每次使用前煮沸载体DNA。分装冻存于-20℃，并且每使用3-4次后再次煮沸更加适宜。 2.离心上面步骤6的细胞，吸去残留的LiCl。 3.每次转化都要向细胞中顺次加入下列试剂。PEG可以保护细胞不会因高浓度的LiCl而受 到损伤。 I.240 ul50% PEG 3350 II.36 ul 1M LiCl III.25 ul 2mg/ml 单链鲑鱼精DNA IV.质粒DNA（5~10ul）溶于50ul无菌水中。
GST_talin1融合蛋白的原核表达及纯化
收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11 作者简介:吴 爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E 2mail:wushuang 21977@https://www.wendangku.net/doc/841883144.html,;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。 GST 2talin1融合蛋白的原核表达及纯化 吴 爽 1,2 ,耿建国 2 (1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州 510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海 200031) 摘 要:应用PCR 方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX 24T 21中,获取人源的GST 2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶 切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),I PTG 诱导表达,用Glutathi one Sephar ose 4B 柱纯化,western bl ot 鉴定。克隆得到了一个2400bp 的talin1的c DNA 片断,重组质粒目的DNA 测序正确,纯化出分子量约为12116k D 的融合蛋白。用基因工程方法使GST 2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST 2talin1融合蛋白。 关键词:talin;P 2选凝素;GST 2融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51 文献标识码:A 文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03 P -选凝素(P -selectin )是一种由细胞产生的粘附分子(adhesion molecules ),存在于细胞表面,能够介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发 挥重要作用[1] 。一直以来P 2selectin 受到许多研究者的青睐。P 2selectin 分子的特性到目前为止,人们已有较丰富的研究。本实验室以P 2selectin 的cyt op las m ic domain 为饵从人白细胞cDNA 文库中筛选到几个基因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA 技术,获得talin1的cDNA,构建了GST 2talin1融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研究talin1与P 2selectin 是否存在相互作用及相互作用机制,奠定了基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 菌株、质粒 人源talin1的cDNA 及融合表达 载体pGEX 24T 21为实验室保存。DH5 α及BL21大肠杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1.1.2 生化试剂和分子生物学试剂 引物由上海生工生物有限公司合成,限制性内切酶、T 4DNA 连接酶购自Pr omega 公司,1kb DNA Marker 、DNA 片断快速纯化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR 试剂购自日本T AK ARA 公司,氨苄青霉素为上海华舜生 物公司产品。1.2 方法1.2.1 目的基因的扩增及纯化 根据已公布的人源talin1的cDNA 序列设计talin1的引物,上游引物T1的序列为5′23′at cag tag gaa ttc atg cg gga cct aga cca gg;下游引物T2的序列为5′23′ga agt cat ctc gag gtg ctc atc tcg aag ctc tg,在上下游引物中分别加入EcoR I 和XhoI 酶切位点。PCR 反应总体积为50 μL,包括ddH 2O 4015μL 、10×buffer 5μL 、4dNTP 1μL 、上下游引物各1μL 、模板1μL 、La Taq 酶015μL 。反应条件为:94℃2m in,94℃50s 、56℃50s,72℃2m in,72℃5m in,共35个循环。所获得的PCR 产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA 片断快速纯化回收试剂盒回收。1.2.2 pGEX 24T 212talin1重组质粒的构建 将纯化的PCR 产物和pGEX 24T 21载体用EcoR I 和XhoI 双酶切后,分别回收酶切产物。取回收后的talin1片断815 μL,载体片断015μL,10×T 4DNA 连接酶buffer 1μL,T 4DNA 连接酶013μL,16℃连接过夜。1.2.3 重组质粒的筛选和鉴定 将连接产物全量转 化入DH5 α感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp )的LB 上37℃筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养12h 后小量抽取质粒,用EcoR I 和XhoI 双酶切,筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。 3 3
毕赤酵母表达手册
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥
GS115毕赤酵母PEG感受态细胞
https://www.wendangku.net/doc/841883144.html, GS115 毕赤酵母PEG感受态细胞 组成规格： 货号名称规格数量 GT2504 GS115酵母感受态细胞50ul 20支 GT2505 GS115酵母感受态细胞50ul 50支 GT2506 GS115酵母感受态细胞50ul 100支 为了满足广大科研工作者对大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母和农杆菌等菌种感受态细胞的需求，华越洋现推出各种系列的感受态细胞供大家选择。 毕赤酵母感受态细胞试剂盒 1 介绍 本试剂盒包括酵母感受态细胞、Solution 1和Solution 2。其中酵母感受态细胞是用于转化的细胞，需-70度低温保存；Solution 1和Solution2为转化时使用的试剂，均为无菌，需-20度保存，使用时解冻即可。本酵母感受态细胞采用专利技术制备的感受态，有别于传统山梨醇制备的感受态细胞，并配有Solution 1和Solution 2，可直接用于热击法转化，而不需要使用电转仪和电击杯。本方法是电击法的替代方法，也避免了LiCl方法需要现制备感受细胞的繁琐。转化效率可以达到102-103cfu/ug线性化DNA，经本公司反复验证-80保存6个月不影响转化效率。 2 转化步骤 2.1 线性化质粒片段的制备 取过夜培养的质粒菌种3ml,使用质粒抽提试剂盒抽提质粒，最后溶解于50ul的TE或水中。将所有的质粒片段在200μl的体系中酶切线性化。用酚氯仿试剂去除蛋白并且浓度片段至20ul体系中（保证有100μg的质粒片段）。 2.2 转化 2.2.1直接加于冻结的酵母细胞中，以获得最大转化率；（注意加入至冻结的细胞中，而不是解冻的细胞中）； 2.2.2. 加入后迅速放入37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次； 2.2. 3. 取出离心管，加入1.5ml Solution 1，彻底混匀；(注意可以弹或移液器轻轻混合，不可用移液器剧烈来回混合也不可用涡旋振荡器) ； 2.2.4. 30℃水浴孵育1h； 2.2.5. 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml Solution 2中； 2.2.6. 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml Solution 2中； 2.2.7. 将所有转化液铺于选择性平板（例如MD板），于30℃孵育3～4天后，鉴定；
毕赤酵母手册
毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主
毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策
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毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策 作者：丁镌， 宋跃芬， 袁野， 刘娣 作者单位：丁镌,宋跃芬(东北农业大学动物科技学院,黑龙江,哈尔滨,150030)， 袁野(中国刑警学院警犬技术系,辽宁,沈阳,110034)， 刘娣(东北农业大学动物科技学院,黑龙江,哈尔滨 ,150030;黑龙江省农科院,黑龙江,哈尔滨,150086) 刊名： 畜牧与兽医 英文刊名：ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)：2007,39(2) 被引用次数：1次 参考文献(9条) 1.Li A;Xiong F;Lin Q Low temperature increases the yiede of biologically active herring antifreeze protein in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(3) 2.Potter K L;Zhang W;Smith L A Production and purification of the heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin,serotype A,expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(3) 3.Inan M;Meagher M M The effect of ethanol and acetate on protein expression[外文期刊] 2001 4.Brierley R A Secretion of recombinant human insulin-like growth factor I (IGF-1) 1998 5.Dring F;Klapper M;Theis S Use of the glyceroldehyde 3phosphate dehydrogenase promoter for production of functional mammalian membrane transport proteins in the yeast Pichia Pastoris[外文期刊] 1998(2) 6.Goodrick J C;Xu M;Finnegan R High-level expression and stabilization of recombinant human chitinase produced in a continuous constitutive Pichia Pastoris expression system[外文期刊] 2001(06) 7.Scorer C A;Buckholz R G;ClareJ J The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastori[外文期刊] 1993 8.Monteino R;Garcia R;Quintero O Variation in N-linked oligosaccharide structures on heterologous proteins secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 1998(02) 9.隋少飞;陈松林巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展[期刊论文]-生物技术通讯 2004(03) 引证文献(1条) 1.王希辉.岳寿松.胡敬东.黄亦钧.陈金龙.王婷婷.范忠玲.赵宏坤鸡白介素18成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达及其生物活性检测[期刊论文]-微生物学报 2010(9) 本文链接：https://www.wendangku.net/doc/841883144.html,/Periodical_xmysy200702022.aspx
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作 1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。 2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。 3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。 4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。 5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。 6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。 7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。 7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。 8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。 毕赤酵母电击法转化 1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。 2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。 3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。 4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。 5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。 6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。 要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。