猪鼻软骨硫酸软骨素双酶法提取工艺研究
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科技创新导报 Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ化学工业
２００９ ＮＯ．１９
Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｈｅｒａｌｄ
科技创新导报
硫酸软骨素（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ Ｓｕｌｆａｔｅ，ＣＳ） 是一种酸性粘多糖，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，为白色粉末，无臭无味，广泛分布于哺乳动物结缔组织，如各类软骨，鼻骨、喉骨、气管，韧带、肌腱等，属于糖氨聚糖（Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ，ＧＡＧｓ）类物质［１］。根据硫酸软骨素的化学组成和结构差异，又可将其分为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ等多种，一般含５０～７０个双糖基单位，分子量通常在１００００～３００００之间［２］。
临床上，硫酸软骨素主要用于治疗神经痛、关节炎、耳鸣以及促进溃疡愈合和防治高血脂症等。硫酸软骨素还具有抗凝血和防止血管硬化等活性，对冠心病、心肌梗塞等心血管病的防治有较好的疗效，对神经细胞、肾细胞等具有保护作用［３］。在医药、食品、化妆品工业中具有广泛用途，市场需求量很大。
通常从哺乳动物组织中提取得到的硫酸软骨素以ＣＳＡ、ＣＳＣ为主。目前，工业生产中提取硫酸软骨素，有不少工厂生产工艺仍然采用浓碱法、稀碱法、稀碱稀盐法等传统工艺，少量精制工艺往往要经过除杂、脱色等过程，工艺控制繁琐，质量也不稳定、收率较低，且废料易对环境造成污染。软骨中的硫酸软骨素与蛋白质多糖结合形成复合物，用蛋白酶代替稀碱或浓碱解离软骨，成品收率更高［３～４］，本实验用多种酶进行单因子试验和双酶法主要影响因子的正交试验，分析不同种类酶对硫酸软骨素提取收率的影响，这对进一步开展硫酸软骨素在国内的应用研究和市场开发具有重要意义。
１ 材料与仪器设备
１．１ 实验材料及试剂
干燥猪鼻软骨（京崚生物有限公司提供）
氢氧化钠、浓盐酸、浓硫酸、９５％乙醇、氯化钠（均为分析纯）
第１类酶：酸性蛋白酶（最适ｐＨ３．０，酶活力５００００ｕ／ｇ）、碱性蛋白酶（最适ｐＨ１１．
０， 酶活力２０００００ｕ／ｇ）、中性蛋白酶（最适ｐＨ ７．５，酶活力８００００ｕ／ｇ）、木瓜蛋白酶（最适ｐＨ６．５，酶活力６００００～７０００００ｕ／ｇ）、脂肪酶（最适ｐＨ７．５，酶活力４０００ｕ／ｇ）、２号酶（厂家保密配方）；第２类酶：精制复合胰酶（以下简称胰酶）（最适ｐＨ７．５，胰蛋白酶活力＞４０００ｕ／ｇ，胰淀粉酶活力＞２００００ｕ／ｇ，胰脂酶活力＞１００００ｕ／ｇ）。酶由无锡市酶制剂厂生产。
１．２ 主要仪器设备
ＣＤ－３０８型电动绞磨机（顺德市肯德利电器实业有限公司）、ＢＳ２２３Ｓ型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）、ＤＨＧ－９１４５Ａ型电热鼓风干燥箱（上海一恒生物科技有限公司）、７２３型可见光分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、ＨＨ６型恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）等。
２ 实验方法与结果
２．１ 双酶法工艺流程２．２ 双酶法操作过程
干燥软骨室温（２５℃）浸泡２４小时，８０℃恒温０．５小时后捞出，清洗，－２０℃速冻保存。实验时，取冻软骨粉碎，以１００ｇ／份分装于烧杯中，另取一份在７０℃～８０℃恒温干燥至恒重，测湿骨粉含水量。按１∶１．５的料液比加入去离子水，分别加入原料１％的第１类酶，调ｐＨ值至对应最适作用范围，５０℃搅拌酶解２小时，直到残渣是总量的２０％左右时倒去上清液，残渣中再加入０．５％的第１类酶，再调ｐＨ值至对应最适作用范围，５０℃搅拌酶解１小时。滤去残渣，将２次酶解液混合，５０℃恒温１小时，调ｐＨ值至７．５，加入２％的ＮａＣｌ和２％的第２类酶进行酶解和盐解。５５℃恒温０．５小时后，８０℃恒温５分钟灭酶。立即过滤。调ｐＨ值６．５，用９５％乙醇调至乙醇终浓度至６９％，静置１２小时以上。去掉上清液，用１０倍体积去离子水溶解沉淀，加１％的Ｈ２Ｏ２，脱色０．５小时，７５℃恒温５分钟。过滤，滤液用９５％乙醇第二次沉淀（调乙醇终浓度至６９％），去掉上清液，再用９５％
乙醇脱水２－３次，８０℃恒温干燥至样品含水率为１０％时得成品。
２．３ 双酶法主要影响因子正交试验
为进一步优化生产工艺，以料液比、第１类酶种类、第１类酶用量、第２类酶用量四个因子按２．２操作过程进行正交试验（Ｌ９３４）。双酶法影响因子及水平见表１。２．４ 成品含量检测
咔唑法［５］。
３ 结果与讨论
３．１ 不同种类第１类酶对硫酸软骨素提取的影响
硫酸软骨素提取方法有稀碱－酶解提取法［６］、浓碱复合酶酶解提取法［７］，以及双酶酶解法［３，４］等，成品收率各有高低，都是用一种酶替换稀碱或浓碱完成实验，均未进行用不同种类第１类酶替换碱进行硫酸软骨素提取比较实验。本实验分别用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶，及酶制剂厂家提供的保密配方酶替换双酶法中的第１类酶进行硫酸软骨素提取，并用咔唑法检测产品含量。不同种类第１类酶的提取收率和含量见表２，重复实验不少于３次。
结果表明，碱性蛋白酶与胰酶、２号酶与胰酶的提取组合收率比其他３种组合要高出３％以上，其纯度也达到合格要求（９０％以上）。王凤琴［３］对影响胰酶水解的三个因素进行了正交试验，结果表明ｐＨ值影响最大，其次是加酶量，影响最小的是温度。本实验各组组合中胰酶的酶解条件均相同，而第１类酶的ｐＨ值均使用各自最适反应ｐＨ值，将酶解温度固定为５０℃，加酶量维持在１％，比较真实地反映出各类酶对硫酸软骨素提取的影响。
３．２ 双酶法主要影响因子分析
为进一步分析双酶法对硫酸软骨素提取收率的影响因素，设计了４因子３水平正交试验，分析料液比、第１类酶种类、第１类酶用量和第２类酶用量在不同水平上对提取收率的影响。影响因子正交试验结果见表３。结果表明，双酶法提取最佳工艺为：Ａ３Ｂ１Ｃ３Ｄ３，即最佳料液比为１∶１．５，第猪鼻软骨硫酸软骨素双酶法提取工艺研究①
张武先 普晓兰＊ 王金华 罗兴桥 刘龙高（云南昆明西南林学院 云南昆明 ６５０２２４）
摘 要：以猪鼻软骨为原料，用双酶法提取硫酸软骨素。用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、２号酶、脂肪酶分别与胰酶组合提取硫酸软骨素，分析不同种类酶对硫酸软骨素提取的影响。通过正交试验得到的最佳提取工艺为：料液比１：１．５，第１类酶使用碱性蛋白酶，用量为２．５％，第２类酶（胰酶）用量为１．２％，成品收率达到１６．７４０％。关键词：硫酸软骨素 双酶法 提取 分析
中图分类号：Ｑ８１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７４－０９８Ｘ（２００９）０７（ａ）－０１１５－０２
①通信作者：普晓兰（１９５６），女，云南石屏人，博士，教授，主要从事植物学的教学与研究
表１ 双酶法影响因子及水平
表２ 不同种类第１类酶的提取收率和含量
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化学工业
科技创新导报１类酶选用２号酶最好，最佳用量为２．５％，第２类酶（即胰酶）的用量以１．２％为最佳。四个影响因子中，料液比的极差（Ｒ＝５．１１０）最大，表明料液比在双酶法提取硫酸软骨素中影响最大，其次是第１类酶的用量，再次是胰酶的用量，影响最小的是第１类酶的种
类。由于生产工艺中必须考虑生产成本，２号酶的成本是碱性蛋白酶的１０倍，且用量大，但第１类酶的种类在提取工艺中影响力最小，所以考虑用碱性蛋白酶代替２号酶，并进行不少于３次的重复验证试验。最佳工艺验证试验结果见表４，第１类酶选用２号酶，产品收率达到１６．７６２％，比选用碱性蛋白酶高出０．０２２％，但第１类酶选用碱
表３ 双酶法提取收率影响因子正交试验结果
表４ 双酶法最佳工艺验证试验结果
性蛋白酶比其他组合的产品收率都高。因此，在双酶法提取硫酸软骨素中，选用料液比１∶１．５，碱性蛋白酶用量２．５％，胰酶用量１．２％，能达到提高收率，优化生产工艺目的。
４ 结论
在双酶法提取硫酸软骨素工艺中，使用不同种类第１类酶时，碱性蛋白酶和厂家提供的２号酶比酸性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、脂肪酶提高产品收率３％以上。操作过程中，选用料液比１：１．５，碱性蛋白酶用量２．５％，胰酶用量１．２％，能进一步优化生产工艺。
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淀。在ＵＮＩＴＡＮＫ工艺中采用生物化学协同除磷，取得了很好的除磷效果。在曝气生物滤池中采用铝盐进行生物化学协同除磷，发现投加铝盐后曝气生物滤池出水ＴＰ小于０．５ｍｇ／Ｌ［４］。在沸石强化Ａ／Ｏ同步脱氮除磷工艺的生物－化学除磷研究中、在ＳＢＲ反应器中进行生物化学协同除磷研究［５］
、在膜生物反应器中进行化学除磷，均取得了很好的磷的去除效果。但是我国对生物化学协同除磷大部分仅限制于小试和中试，并没有进行大规模的试验。因此，生物化学协同除磷技术在我国具有很好的应用前景。
将生物除磷与化学除磷相结合，可以充分利用生物除磷费用低、化学除磷出水磷浓度低且比较稳定的优点。对于需要同时除磷脱氮的场合，可以优先考虑脱氮，辅助以化学除磷，从而使得出水的氮、磷满足所要求的标准。
５ 技术经济分析
对国内活性污泥法城市污水处理厂的基建投资、占地面积、人员编制、运行成本等费用状况进行调查，在此基础上按照正规设计程序进行规模为２×１０４ｍ３／ｄ、５×１０４ｍ３／ｄ、１０×１０４ｍ３／ｄ的生物化学协同沉淀法和普通曝气法污水厂的系列设计，并按照正规工程概算程序进行经费估算，然
后对二者的费用状况进行了比较。其分析结果显示，在现行价格体系条件下，生物化学协同沉淀法具有比普通曝气法更优越的技术经济性能。对于２×１０４ｍ３／ｄ、５×１０４ｍ３／ｄ、１０×１０４ｍ３／ｄ规模的城市污水处理厂，如果在处理效果相同（实际生物化学协同沉淀法除磷效果优于普通曝气法）的条件下，生物化学协同沉淀法比普通曝气法节约工程总投资１６％、１１％、１１％，节约总成本１５％、１４％、１０％，节约占地面积１２％、１７％、１７％。
因此，在取得很好的除磷效果的前提下，生物化学协同沉淀工艺与普通曝气法相比，地价越高、电价越高、药价越低、规模越大，生物化学协同沉淀工艺越经济。
６ 结语
生物化学协同除磷法技术基于生物除磷系统较难稳定实现一级排放标准要求，而且处理效果直接受到进水磷酸盐浓度以及Ｃ／Ｐ比值影响的现状，提出在生物处理系统中投加化学除磷剂以保证污水处理系统的除磷效果。该技术不仅能很好地除磷，还能有助于有机物的去除。通过正确地估计生物除磷的能力可计算出化学除磷所需的药剂量。经济技术分析结果显示，在现行价格体系条件下，生物化学协同法具有比普通曝气法更优越的技术经济性能，而且地价越高，电价越高，药价越低，规
模越大，该法就越经济。因此，生物化学协同除磷技术在我国具有很好的应用前景。
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