苏云菌芽孢杆菌Ⅳ型抗癌晶体蛋白的分子模建
苏云金芽孢杆菌 型抗癌晶体蛋白的分子模建
何伟,张同武,林毅
*
(华侨大学生物工程与技术系,工业生物技术福建省高校重点实验室,福建 泉州 362021)
摘要:通过同源建模得到了抗癌晶体蛋白Parasporin-4的初始三维结构,利用分子动力学的方法对初始三维结构进行优化,同时分析了模建分子的结构,最后利用Ramachandran plot,结构匹配等方法对模型进行评价。结果显示得到的Parasporin-4结构是具有三个结构域,蛋白模型分子中的键长、键角以及二面角的分布合理,与模版蛋白的主链 碳原子的均方根差RMSD 值为0.547742,在合理范围之内,表明Parasporin-4蛋白模型良好。研究结果为抗癌晶体蛋白的抗癌的分子机制及其定向改造提供了结构信息。
关键词:抗癌晶体蛋白;空间结构;同源建模;分子动力学模拟
中图分类号:Q939.124,Q518.3 文献标识码:A 文章编号:1672-5565(2009)-04-320-04
收稿日期:2008-07-06;修回日期:2008-09-10.
资助项目:国家自然科学基金(40601046)、福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划资助基金。作者简介:何伟(1982-),男,硕士研究生,从事抗癌晶体蛋白的研究。
*通讯作者:林毅,男,副教授,博士,从事应用与环境微生物学研究,E-mail:lyhxm@https://www.wendangku.net/doc/852664935.html,.
S tructural characterization of cancer cell -killing crystal
protein Parasporin -4from Bacillus thuringiensis
HE Wei,ZHANG Tong Wu,LIN Yi
*
(De partment o f Bioenginee ring &Biotechnology,HuaQiao Universit y ,K e y Laboratory o f Industrial Biotec hnology
o f Fujian Province U nive rsity ,Quanzhou 362021,China)
Abstract :The initial three dimensional structure of Parasporin-4(Cry45Aa),the fourth class cancer cell-killing crystal protein from Bacillus thuringiensis,was constructed using homologous modeling,and was optimized by molecular mechanics method.The structure of the model mo lecular was analyzed.The simulated s tructure was evaluated using Ramachandran plot and structural matching.It showed that the obtained model structure of Parasporin-4was reasonable.The results in this paper made a good foundation for the research of anticancer mechanism and rational design of parasporin-4.
Key Words :parasporin-4;three di mensional structures;homology modeling;Molecular Dynamics Simulation
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,B t)作为世界上产量最大的生物杀虫剂已被人广泛使用,但越来越多的研究发现自然界中分布更多的是没有杀虫活性的Bt 菌株[1]
。因此,近10年来一些研究者对伴孢晶体蛋白的非杀虫活性进行了研究。1999年,日本学者Mizuki 等[2]
首先发现没有杀虫活性的Bt 菌株A1190所含的81kDa 伴孢晶体蛋白经蛋白酶处理激活后对体外培养的人癌细胞(人白血病T 细胞MOLT-4、人子宫颈癌细胞等)具有杀伤力,而且不表现溶血作用。目前研究已发现了4种不同类型的具有抗癌作用的伴孢晶体蛋白,这类蛋白统称为Parasporin,具体定义为 Bt 及其相关细菌产生的无溶血作用但可优先杀死癌细胞的伴胞晶体蛋白!
[3]
。
+目前,Parasporin 的抗癌机制尚未明确。根据Pa rasporin 与杀虫晶体蛋白(C ry 蛋白)导致的细胞病理
变化的相似性。推测抗癌蛋白与Cry 蛋白具有相似的作用机制。但目前由于Parasporin 的三维结构未见报道,为此本文利用同源建模(homology model ing)、分子力学(Molecular Mechanics)、分子动力学模拟(Molecular Dynamics Simulation)等方法,对Paras porin-4的三维结构进行预测及优化。研究结果可为 型抗癌晶体蛋白的作用机制研究及人工设计提供重要的信息。
1 材料与方法
1.1 蛋白质序列
NCBI 数据库中已有的Parasporin-4(Cry45Aa)的氨基酸序列。
第7卷第4期2009年12月
生物信息学China Journal of Bioinformatics
Vol 7No 4Dec.,2009
1.2 蛋白质模板
目前蛋白质结构数据库(Brookhaven protein data bank,PDB)中已有的与Parasporin-4的氨基酸序列
同源性最高的蛋白的空间结构数据。1.3 Parasporin-4的同源模建
从NCBI 数据库中搜索得到抗癌晶体蛋白Pa rasporin-4的氨基酸序列,用FASTA 程序在蛋白质结构数据库(protein data bank,PDB)中搜索同源蛋白并进行B LASTP 多序列对比,从结果中寻找具有晶体结构的相似性最高的模板;将Parasporin-4氨基酸序列与模板比对结果提交到Swiss-model 服务器,进行比对模建,得到初始的模型。对初始模型进行结构优化和动力学模拟,分别用material studio 软件中Discover 模块的minimizer 和dynamics 程序执行,所得模型可以通过可视化软件进行观察。最后利用Ra machandran plot 、结构匹配等方法对模型进行评价。
1.4 Parasporin-4模型的分析
运用如下服务器对所得的空间结构进行分析:SMART(http: smart.e mbl-heidelberg.de )用于结构
域分析,可找出各结构域的位置,PredictProtein (ht tp: https://www.wendangku.net/doc/852664935.html, )对蛋白质结构、功能(motif)预测,SeqFacts(http: bip.weizmann.ac.il sqf
bin seqfacts)用于跨膜螺旋预测。
2 结果与分析
2.1 Parasporin-4活性区的氨基酸序列及比对Parasporin-4又称Cry45Aa,由275个氨基酸残
基构成,与Cry 蛋白的同源性很低,无Cry 蛋白所共有的保守区,经蛋白酶作用后在C-末端发生了酶切,形成27kDa 的激活体才具有抗癌活性[4]
。从NCBI 数据库中可搜寻到Parasporin-4序列,登入号为:B AD22577,其活性区氨基酸为Ala2-Arg246。
将抗癌晶体蛋白Parasporin-4序列提交到NC BI 数据库,用FASTA 程序在蛋白质结构数据库中搜索同源蛋白并进行B LASTP 多序列比对,寻找具有晶体结构的模板,发现其相似性最高的为35%,其PDB 的登入号为2d42A 。将抗癌晶体蛋白Parasporin -4与模板2d42A 的氨基酸序列比对,结果如图1
。
图1 抗癌晶体蛋白Paras porin-4与模板2d42A 的氨基酸序列比对Fi g.1Alignment of the amino acid sequences of Parasporin-4and template 2d42A
2.2 Parasporin-4的同源模建及模型的优化
提交抗癌晶体蛋白Parasporin-4与模板2d42A 的氨基酸序列比对结果到Swiss-model 服务器,进行比对建模,同源模建返回的结构可在IC M 加氢可视化即得到Cry45Aa 的初始三维结构。
用material studio 软件中Disc over 模块对同源模建的Cry45Aa 初始三维结构进行结构优化和动力学模拟。先用最陡下降法(Steepest Descent)在CVFF 力场下进行结构松弛计算,当能量梯度低于20kJ ?mol -1
?nm -1
,接着采用共轭梯度法(Conjugate Gradi ent)进行结构优化,至能量梯度基本平稳。分子动力学优化不能解决局部势垒问题。因此为了克服局域势垒,我们对模建松弛后的结构在常温(300K,Andersen 控温,NVT 体系)进行了50ps 的分子动力学计算,每隔5fs 收集一个构象,选定能量
最低的构象为最终的模建结果。图2给出了在分子动力学模拟过程中,体系势能和非健能随时间的变化。在30ps 后,体系的总能量达到平衡;即在其余20ps 的模拟中,体系已经达到了平衡。此时的构象为最终的模建结果。图3为Cry45Aa 的稳定构型。2.3 Parasporin-4模型的评价
利用Ramachandran plot 评估模型结构的立体化学参数,如图4,模拟的Cry45Aa 结构中95.9%的 、 二面角落在核心区。而具有X-ray 晶体结构2d42A 主链的 、 二面角有98.8%落在核心区。
对Cry45Aa 和2d42A 进行结构匹配的检验,两个蛋白质的主链 碳原子的均方根差RMSD 值为0.547742,在合理范围之内,二者的叠合模型见图5。结果表明Cry45Aa 的模建结构是合理可信的。2.4 Parasporin-4模型的分析结果
321第4期
何伟,等:苏云金芽孢杆菌 型抗癌晶体蛋白的分子模建
图2 体系势能和非健能量随模拟时间的变化Fig.2The changes of Potential Energy and non-bond energy
wi th the si mulati on-ti
me
图3 同源模建优化后paraspori n-4三维结构Fig.3The 3-D Structure of paras porin-4after optimi zed
homology modelli
ng
图4 Parasporin-4主链的 , 二面角于Ramachandran plot 上的分布
Fi g.4The distri bution of , di hedral angel of Parasporin-4
main chain in Ramachandran plot
经分析,模建的Parasporin-4三级结构含2个 -螺旋,13个!-折叠,15个loop 环,修正后的总能量为-6307.143KJ mol 。与其他杀虫晶体蛋白的典型结构域不同,Parasporin-4的空间结构是由一
个长型结构组成,主要由卷曲和!-折叠构成。结
图5 Parasporin-4和2d42A 主链 碳原子叠合的立体示意
图(红色为Cry45Aa1,绿色为2d42A)Fi g.5The 3-dimensional diagram of carbon atom superposi ti on bet ween the main chain of Parasporin-4and
2d42A(Cry45Aa in red and 2d42A in green)
构域分析可知,该结构可大致分为三个结构域,这与
文献[5]
报道的基本一致,其氨基酸序列范围为:2~63,75~129,144~225,未能在数据库中搜寻到类似的结构域。经跨膜螺旋预测,该蛋白中并不存在跨膜螺旋。此外Parasporin-4中含有3个intrinsic dis order 区,其氨基酸序列范围为:64~74,130~143,226~246。
3 讨论与结论
用同源建模的方法构建了Parasporin-4的模型并对其经行了结构分析。Para sporin-4的分子模型呈长条型,和经典的杀虫晶体蛋白不同,没有钻孔蛋白结构。Nakamatsu 等[6]
对Cry 蛋白的杀虫活性机理的报道是通过特意的识别并结合在细胞表面受体上,形成细胞孔洞,通过扰乱细胞的渗透平衡,引起细胞肿胀最终裂解。但由于Parasporin-4没有钻孔蛋白结构,这一理论对其不适用。另外,有学者猜测苏云金芽孢杆菌抗癌晶体蛋白的抗癌机制是导致细胞的程序性死亡[7]
。天然存在的一种细胞毒性因子是肿瘤坏死因子相关的诱导凋亡配体。最大的特点是能诱导癌细胞程序性死亡,而对正常细胞没有影响。这与Parasporin-4选择性杀死癌细胞的性质相似,但实验
结果未能给出充分的证据,还需进一步研究。参考文献(References):
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(下转至第325页)
322 生 物 信 息 学第7卷
3 研究展望
氢气是理想的清洁能源,所以氢能的研究开发已成为诸多科学家关注的焦点之一,而氢化酶又是微生物代谢产氢过程中极为重要的一种酶。因此,从那些方面开展对氢化酶的研究才能对生物制氢产业产生最有力的推动,这是科研工作者们需要思考的问题。
微生都具有不同程度的产氢能力,因此利用发酵产氢微生物,将葡萄糖等生物质转化为氢气在技术上本身没有问题。而一直困扰其应用过程的是经济性的问题,即如何降低发酵制氢的成本,使之可以和石化能源催化制氢的经济性相比拟,或者可以与其他生物能源过程相竞争。核心问题是如何提高糖的转化率,如何降低底物成本,如何在生物反应器水平上实现高效产氢[16]。
目前报道的发酵产氢微生物主要是梭菌属细菌和肠杆菌属细菌,产氢能力通常可以达到30mmol H2 g-drycell?h[17]。据报导,从厌氧产甲烷污泥中分离到自絮凝产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)HU -101和突变体AY-2,产氢速率为58mmol H2 L-culture?h和101.5mmol H2 L-culture?h,是目前报导的最高产氢速率值。HU-101和AY-2是最先被发现具有凝集现象的发酵产氢细菌,它们的分泌物能让菌体絮凝。本课题组分离得到了产乙醇杆菌(Ethanoligenens)YUAN-3T,其最大产氢能力达到27.6mmol H2 g-drycell?h,YUAN-3具有十分良好的菌体细胞自凝集特性[18],这对于减少菌株的流失和降低生物制氢成本等方面具有重要意义。有关自凝集产氢细菌的报道目前世界上还很少见,具有自凝集特性的产氢细菌将为生物制氢领域开辟出一个重要的研究方向。因此深入开展YUAN-3和HU-101等高效优质菌株中的氢化酶的结构与功能的研究具有重要意义。
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(上接第322页)
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325
第4期杜明,等:氢化酶结构研究进展
蛋白质纯化与结晶的原理
蛋白质纯化与结晶的原理 获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈，就是制备大量纯化的蛋白质（>10mg），其浓度通常在10mg/ml以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖（clone）的方式嵌入表现载体（expression vector）内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌（Escherichia coli），在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。 在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沉淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体。 蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法（Vapor Diffusion Method）的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质（10～50mg/ml）溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度（~1.0M）的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度（~2.0M）硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的。
解析蛋白结晶的过程
说起蛋白结晶，中国可有着很悠久的历史呢。1965年中国首次人工合成了结晶牛胰岛素。这是第一个与天然蛋白有着相同性质并具有生物活性的人工合成蛋白，也是蛋白结晶的首个成功例子。2004年，中国科学院生物物理研究所常文瑞研究员发现的菠菜主要捕光复合物(LHC-II)的晶体结构，以封面形式在《Nature 》杂志上发表（图1）。 最近，饶子和院士等在《Nature 》杂志上发表文章，展示了禽流感病毒H5N1聚合酶内部的晶体结构。此外，饶教授已经解析出 了50多个重要蛋白质的晶体结构，包括艾滋病毒基质蛋白SIV-MA 、IgA Fc 受体（CD89，JBC 的封面，图2）、第一个SARS 病毒蛋白 -3CL PRO 。看着饶教授的丰硕成果，大家可能都很感兴趣蛋白结晶是怎么样做的，简单说吧，就是将表达目的蛋白的DNA 片段PCR 之后克隆到表达载体上，然后在大肠杆菌中诱导表达，得到大量的蛋白并纯化，摸索结晶条件，等它结晶（时间长短不定），拿到晶体之后进行X 射线衍射，收集衍射图谱，通过计算，很快就能得到蛋白质的原子结构。看上去似乎很简单，其实不然。在1971年蛋白数据库PDB （https://www.wendangku.net/doc/852664935.html, ）刚刚成立时，只有可怜的7个蛋白结构；不过蛋白结晶的方法也在不断改进，因此PDB 的结构数也呈指数增长，目前已达到了52684个。生物通就结合绕教授的文章，给大家解析一下蛋白结晶的过程。 图1 LHC-II 的晶体结构 图2 IgA Fc 受体的结构 1．蛋白表达和纯化 这个大家都比较熟悉了，简单说一说。用PCR 扩增目的蛋白的结构域。PCR 产物纯化后克隆到大肠杆菌表达载体上。饶教授在两篇文章中分别用了pGEX 6p-1（GE Healthcare ）1和pET-28a （Novagen ）2的载体，然后在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中进行表达，再利用相应的层析柱纯化，如果需要的话，还要用蛋白酶将较大的标签切除。这一步的关键是得到大量纯化的蛋白质（>10mg ），其浓度通常在10mg/ml 以上，才能进行结晶条件的筛选。不过蛋白表达量高了，经常就会形成包涵体，所以还要优 化变复性的条件，使蛋白正确折叠。 2．蛋白结晶 蛋白质晶体的培养，通常 是利用气相扩散（Vapor Diffusion ）的原理来完成；也就是将含有高浓度的蛋白质（10～ 50mg/ml ）溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋 白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态 2008年9月10日四十期第 4 页，共 21 页下一页 返 回
苏云金芽孢杆菌
本文对农业上研究最多、用量最大的两类微生物杀虫剂苏云金芽孢杆菌 （Bacillus thuringiensis, Bt）和昆虫杆状病毒（baculovirus）进行了综述，分别论述了它们的杀虫优势、杀虫的分子机理、目前的研究状况，并对它们的基因工程技术改良路线以及在农业上的应用，提出了一些建议。 由病虫害引起的农作物的减产减收已成为制约农业生产进一步发展的限制因素，全球每年农作物因虫害造成的损失约占总产量的13％，而目前对农作物害虫的防治主要依赖于化学农药。完全依赖化学杀虫剂存在许多弊端，其中最主要的问题是，一种化学物质的广泛使用会使害虫的后代产生选择性进化优势，从而对该化学物质产生抗性。例如，世界各地的家蝇品系对杀灭它们的每种杀虫剂都产生了抗性。第二个问题是，有的杀虫剂影响非靶目标品种，产生灾难性后果，某些益虫被无意中消灭，导致其次要害虫急剧增长。第三问题是在于环境的耐受性和许多杀虫剂的毒性，不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大的威胁。上述不利因素促使人们急欲寻求控制害虫的替代方案。 在对农业害虫进行的长期防治实践中，人们逐渐认识到必须采取综合治理的措施，才能有效的控制害虫的危害。基因工程技术的发展，为防治农林害虫提供了一种有效、减污的新技术手段，微生物农药也因此在世界范围内受到广泛重视。微生物农药是指非化学合成、具有杀虫防病作用的微生物制剂，如微生物杀虫剂、杀菌剂、农用抗生素，等等。这一类微生物包括杀虫防病的细菌、真菌和病毒。 杀虫微生物是指其代谢产物或微生物本身对宿主昆虫有致死效应或致病的微生物类群，通常也称为昆虫病原微生物。目前已知的杀虫防病微生物主要有芽孢杆菌科、假单胞菌科、肠杆菌科、链球菌科和杆状病毒科等类群。尽管不同杀虫微生物引起昆虫致病的症状不尽相同，但杀虫微生物对害虫的作用方式主要是通过产生特异性的杀虫毒素来破坏害虫的代谢平衡，或者是通过营养体在虫体内的繁殖复制而引起昆虫死亡和发生流行病。 除了这一独特的杀虫机制外，微生物杀虫剂还具有以下一些特点：对人畜安全无毒，不污染环境；杀虫作用具有一定特异性和选择性，不会使天敌和非目标昆虫致死；易于和其他生物学手段结合进行害虫综合治理，维持生态平衡；由于杀虫活性蛋白的多样性，昆虫产生抗性较缓慢或不易产生抗性；可以通过发酵法生产，具有较低的生产成本；可以通过基因工程技术途径筛选或构建优良性能的菌株来满足生产与应用所需等。所以微生物杀虫剂自问世以来发展很快，据报道，全世界已商品化的微生物农药约30种，微生物杀虫剂占其中的90％。 苏云金芽孢杆菌 杀虫微生物中研究最多，用量最大的是苏云金芽孢杆菌。苏云金芽孢杆菌从上世纪20年代起就用于害虫的防治，它的生物学特性决定了它的微生物杀虫剂功能。 苏云金芽孢杆菌菌株在生长代谢过程中会形成芽胞，在芽胞形成过程中产生一个芽胞及一个或多个较大的蛋白质性质的晶体内含体。这种蛋白质性质的晶体被敏感昆虫摄食后会导致昆虫死亡，蛋白质晶体含有不具活性的原毒素分子——δ－内毒素，当昆虫幼虫吞食了这种内毒素，晶体就会被幼虫的碱性肠液溶解，随后被肠道蛋白酶降解，形成有活性的蛋白质毒素，最终导致昆虫死亡。苏云金芽孢杆菌菌株在营养体生长旺盛期，某些菌株还会产生一些其它的外毒素，如α－外毒素、β－外毒素、γ－外毒素，等等。除上述毒素外，近年来从
Bt(苏云金杆菌)乳剂生产工艺规程
Bt（苏云金杆菌）乳剂生产工艺规程 衡阳市微生物厂 一九九二年三月
Bt 乳剂工业生产技术 一、概述 Bt 即苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ）的简称，是一种寄生于昆虫体内引起昆虫发病死亡的能产生伴孢晶体的芽孢杆菌，其制剂广泛应用于农、要、果、蔬、城市园林方面的害虫防治。 二、生产工艺流程 砂土管菌种 斜面菌种 扁瓶 菌种扩大培养 发酵罐 过滤 浓缩 加助剂 检验 包装 三、生产工艺操作规程 （一）砂土管菌种的制备 1、砂的处理： 取建筑用砂或河砂经60－80目过筛后用工业Hc 浸泡48h 后用清水洗净，再用0.2NNao 中和，烘干后用磁铁除去其中带磁性之金属微粒，装入洁净容器内备用。 2、砂土管制备： 将以上已处理好之砂土分装于1.2×12公分之小试管中，每管约装2克，塞上棉塞，先用2.0kg/cm 2高压灭菌1.5小时，间歇灭菌三次，再以160℃干热灭菌2小时，经无菌试验，即抽取一点砂土置于斜面试管中 36℃培养24小时才检查无杂菌后备用。 27－29℃ 48－72h 27－29℃ 18－24h 27－29℃ 36－48h
3、砂土孢子的制作： 选择生长良好，经过生产能力考查合格的优良试管斜菌种一支加入无菌水5ml，用接种针刮下孢子制成高浓度的孢子悬液用无菌吸管吸取0.2－0.3ml接入砂土管中，而后置入真空干燥器内，用真空泵间歇抽干，用石蜡封口，以后置于0－5℃冰箱中，在干燥情况下保存。 （二）斜面菌种的制备 1、培养基：牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、琼脂2%，调节7.5－8.0溶化后分装试管，加塞放入试管篓内包好灭菌。 2、灭菌：在消毒锅内 1.1kg/cm2下蒸气灭菌30分钟，等冷却到60－70℃时取出摆成斜面，空白培养2天观察无杂菌方可使用。 ３、接种培养：将菌种试管斜面放在接种室内或无菌操作箱中，打开紫外线灯灭菌30分钟后关闭。用接种环按操作规程刮取种子菌苔少许，转至新鲜斜面培养基上划线接种，然后放入30℃培养箱内3－4天，经检查正常，放入冰箱内备用。 （三）扁瓶扩大种子制备 1、培养基：同斜面培养组成，另加葡萄糖1%，溶化后装入扁瓶。 2、灭菌、接种、培养均与斜面菌种同。 （四）发酵 1、培养基棉籽饼粉 3.5% 玉米粉 2.0% 鱼粉 1.0% 酵母粉0.2%
苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定
苏云金芽孢杆菌的分离及鉴定 09级园林工程系生物技术及应用班级 (制作人—王珏指导教师—韩磊) 内容提要 本论文描述了苏云金芽孢杆菌的选择性培养、分离以及鉴定的过程,从而熟悉了灭菌、接种等无菌操作技术，掌握了鉴定菌种的不同方法以及了解到了苏云金芽孢杆菌在生产上的应用和发展前景前景。 关键词 苏云金芽孢杆菌;选择性培养;生化鉴定；明胶酶；明胶的液化；精氨酸脱羧酶；尿素酶1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1玻璃器皿 烧杯；三角瓶；量筒；玻璃棒；培养皿；试管；移液管；涂布棒；酒精灯；胶头滴管等 1.1.2实验仪器 超净工作台；光照培养箱；水浴锅；摇床；电子天平等 1.1.3其他用具 研钵；纱布；吸耳球；八层纱布；剪刀；棉塞；pH试纸；胶头滴管；牛皮纸；麻线；喷壶等 1.1.4实验材料 土壤表层土样；叶片；苏云金芽孢杆菌菌粉 1.2方法与步骤 1.2.1选择性培养及扩大培养 1.2.1.1灭菌前准备 1)PBA培养基的制备 PBA培养基配方（1L） 配置750mL的PBA搖瓶培养基后分装于三个大三角瓶内，随后用棉塞及牛皮纸封口包扎；以备灭菌（121℃,20min）。
注（制备的培养基中有500mL中不含有醋酸钠） 2）灭菌器材的准备 将需要灭菌的三角瓶、纱布、搁置架分别包扎后同培养基利用手提式高压灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。 1.2.1.2灭菌 1、注水：往灭菌锅内注入适量的蒸馏水； 2、预热：放入需灭菌的器材和培养基之前先预热十分钟； 3、加热升温过程：将需要灭菌器的材放入灭菌锅内→盖 好灭菌锅的顶盖→打开放气阀→接通电源进行升温、升压→ 待到有大量热气从放气阀冒出时关掉放气阀；此后是升压的 过程； 4、升压、降压过程：开始升温后压强随之升高，待到压 强为0.05mpa时关掉电源；此后为降压过程，当压强降到 0mpa时打开放气阀放气。放完气后关掉放气阀接通电源，再 次升温、降温后打开放气阀放气，放完气之后关掉放气阀接 通电源；此后为升压保压的过程； 5、升压保压过程：当压强从0mpa升到1.1mpa时开始计时；当压强升到1.13mpa时关掉电源，待压强降到约1.1mpa时再接通电源；再次升压至1.13mpa时关掉电源开始降压，当降到1.1mpa时再接通电源然后开始升压。重复上一步操作，使此过程保持20分钟。此后为降压出锅过程； 6、降压出锅过程：保压20分钟后关掉电源等待降压至0mpa时打开放气阀放气；用抹布打开灭菌锅的锅盖，然后将灭完菌的器具和培养基取出； 1.2.1.3样品的预处理 三个小组分别取土壤表层土样和植物叶片共5份→土壤研磨、叶片剪碎→每份样品称取5g→溶于适量的自来水中→摇匀→置于75℃的水浴锅中保温10min→静置 1.2.1.4超净工作台的准备 接通电源后打开紫外灯，30分钟后关掉紫外灯打开风机约20分钟；然后用肥皂洗手后进行无菌操作。 1.2.1.5无菌操作 1）培养基的完善及分装（对照试验）
苏云金芽孢杆菌基因组研究概况
基因组学与应用生物学，2009年，第28卷，第1期，第202－208页Genomics and Applied Biology,2009,Vol.28,No.1,202－208 专题介绍Review 苏云金芽孢杆菌基因组研究概况 谭寿湖1,3张文飞1,3叶大维2* 1广西大学生命科学与技术学院,南宁,530005;2南开大学生命科学院,天津,300071;3海南海德热带农业资源研究所,三亚,572025*通讯作者,yehtawei@https://www.wendangku.net/doc/852664935.html, 摘 要 迄今为止，全球已有2个Bt 株菌株完成了全基因组测序，1个Bt 菌株正在拼接中，15个Bt 菌株正在 进行测序中。已有22个Bt 质粒完成了全序列测定。Bt 是作为生物农药使用最广泛的微生物菌株，也是最为成功地将其杀虫晶体蛋白基因应用于植物转基因的微生物。在基因组进化、新基因发现、基因表达调控等方面一 直是科学家研究的热点，并取得了相当多的成果。本文概述了苏云金芽孢杆菌基因组测序现状、基因组特征及比较基因学等方面的研究进展。 关键词苏云金芽孢杆菌,Bt 基因组,质粒基因组,比较基因组 Summary of Research Progress in the Genomics of Bacillus thuringiensis Tan Shouhu 1,3 Zhang Wenfei 1,3Ye Dawei 2* 1College of Life and Technology Science,Guangxi University,Nanning,530005;2College of Life Sciences,Nankai University,Tianjin,300071;3Haide Institute of Tropical Agricultural Resources,Sanya,572025*Corresponding author,yehtawei@https://www.wendangku.net/doc/852664935.html, Abstract Presently,there are two Bt strains that have completed whole genomic sequencing,while one Bt strain is being assembled,and 15Bt strains are in progress.Furthermore,22Bt plasmids have completed sequencing.Bt is the most widely used microbial strains as a biological pesticide and also have the most successful application in genetically modified plant with the use of its insecticidal protein gene.Scientists have been looking at the genomic evolution,new gene discovery,gene expression and regulation with considerable achievements.This article pro-vides an overview on the latest research development of Bt genome sequencing,genome characteristics and com-parative genomics studies.Keywords Bacillus thuringiensis ,Bt Genome,Plasmid genome,Comparative genome 基金项目：本研究由国家863项目(2006AA022189)资助 随着基因组测序技术的快速发展，测序成本的降低，对任何生物的基因组进行测序变得现实和可能(Marguerat et al.,2008)。自1995年首次完成流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae )的全基因组序列以来，已有大量的微生物菌株基因组全序列测定完成。截止到2009年2月3日，全球已经完成基因组测序的微生物菌株有834株，有643株微生物菌株的基因组正处在拼接阶段，此外，有797株微生物菌株的基因组由于各种原因只完成了基因组草图。在已经完成测序的微生物中，有779株为真细菌，55株为古生菌(https://www.wendangku.net/doc/852664935.html,/genomes/lproks.cgi)。 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,简称Bt )在《伯杰氏系统细菌学手册》(第九版)中被列为第2类 第18群中的芽孢杆菌属。与蜡状芽孢杆菌(B.cereus )，炭疽芽孢杆菌(B.anthracis )同属于蜡状芽孢杆菌群细菌(Rasko et al.,2005)。 Bt 广泛存在于土壤、 虫尸、污水、淤泥、尘埃以及叶面等介质中，是一种广泛存在于自然界的革兰氏阳性细菌。苏云金芽孢杆菌也是一种典型的昆虫病 原菌，对鳞翅目(Lepidoptera )、 双翅目(Diptera )、鞘翅目(Coleoplera )、膜翅目(Hymenoptera )、同翅目(Ho － moptera )、 直翅目(Orthoplera )、食毛目(Mallophaga )等多种昆虫，以及线虫、 螨类和原生动物等具有特异的毒性活性，由此成为目前世界上研究最深入，应用最广泛的农业害虫生物防治细菌(Crickmore et al.,1998;喻子牛等,1996)。
苏云金杆菌的使用方法
苏云金杆菌的使用方法 尽管苏云金杆菌是杀虫剂中使用比较广泛的杀虫剂之一。但还是有不少农民用户对苏云金杆菌的使用方法不是很了解的。今天小编详细给大家介绍苏云金杆菌的使用方法。 苏云金杆菌的使用方法： 十字花科蔬菜菜青虫、小菜蛾 幼虫3龄前，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂100～300克，或16000IU/毫克可湿性粉剂100～150克，或32000IU/毫克可湿性粉剂50-80克，或2000IU/微升悬浮剂200～300毫升，或4000IU/微升悬浮剂100～150毫升，或8000IU/微升悬浮剂50～75毫升，或100亿活芽孢/克可湿性粉剂ioo～iso克，兑水30～45丁-克均匀喷雾。 水稻稻纵卷叶螟、稻苞虫 幼虫孵化高峰至3龄前，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂300～400克，或16000IU/毫克可湿性粉剂150r-_J200克，或32000iu/毫克可湿性粉剂80～100克，或2000IU/微升悬浮剂400～500毫升，或4000IU/微升悬浮剂200～250毫升，或8000IU/微升悬浮剂100-120毫升，兑水30～45千克均匀喷雾。 棉花棉铃虫、造桥虫 幼虫孵化高峰至钻铃前，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂400～500克，或16000克可湿性粉剂200～250克，或32000IU/毫克可湿性粉剂120克，或2000IU/微升悬浮剂400---500毫升，或4000升悬浮剂200～250毫升，或8000IU/微升悬浮剂100-120毫升，
或100亿活芽孢/克可湿性粉剂250～400克，兑水45-75千克均匀喷雾。 玉米、高梁玉米螟 每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂250-300克，或4000IU/微升悬浮剂150-200毫升，在玉米或高粱大喇叭口时期喷雾或混细沙制成毒土灌心叶。 大豆天蛾、甘薯天蛾 幼虫孵化盛期，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂200～300克，或16000iu/毫克可湿性粉剂100～150克，或32000iu/毫克可湿性粉剂50～80克，或2000iu/微升悬浮剂200-300毫升，或4000IU/微升悬浮剂100~150毫升，或8000IU/微升悬浮剂50-75毫升，兑水30～45千克均匀喷雾。 烟草烟青虫 幼虫3龄前喷药，每667平方米使用8000IU/毫克可湿性粉剂400-500克，或16000IU/毫克可湿性粉剂200～250克，或32000IU/毫克可湿性粉剂100～120克，或2000IU/微升悬浮剂400～500毫升，或4000IU/微升悬浮剂200--250毫升，或8000IU/微升悬浮剂100～120毫升，兑水30～45千克均匀喷雾。 茶树茶毛虫 幼虫孵化高峰至3龄前喷药，使用8000IU/毫克可湿性粉剂100～150倍液，或16000iu/毫克可湿性粉剂200～300倍液，或32000iu/毫克可湿性粉剂400-500倍液，或2000IU/微升悬浮剂80～100倍液
苏云金杆菌使用注意事项及作用机理
苏云金杆菌 苏云金杆菌（简称Bt）是目前商业开发最为成功的微生物杀虫剂。当前全世界每年生 产的Bt制剂约有7000～10000吨，年销售额已达1.5亿美元，其中欧洲国家产量在2000 吨左右，占欧洲国家生物农药总量的90%。 Bt制剂的研究与利用始于20世纪30年代，因其生产设备较为简单，使用比较方便， 尤其是它可有效地防治150多种鳞翅目幼虫（其中有些是重要的经济害虫），因此，70年代以后，Bt制剂便成为防治农田和仓库害虫的重要生物杀虫剂之一。美国环保局已将其指定 为用于大田作物、果树、蔬菜和观赏植物的主要生物农药，并将它用于仓库害虫的防治。 晶体或孢子的混合物进入敏感幼虫体内后，这种没有杀虫活性的原毒素被碱性肠液活化，并在中肠蛋白酶作用下进一步转化为有杀虫活性的δ-内毒素。δ-内毒素能破坏幼虫肠壁 的上皮细胞，使幼虫停止取食，从而中毒死亡。幼虫致死的时间取决于昆虫种类和剂量。 使用苏云金杆菌杀虫剂注意事项 温度：细菌生物农药杀虫剂的活性成分是蛋白质晶体和有生命的芽孢。在低温条件下（15℃以下），蛋白晶体不易发生作用。15℃以下或30℃以上使用Bt都基本无效，但在相对高温下更能发挥作用，一般在30℃左右时最好，害虫死亡速度较快。 湿度：细菌生物农药杀虫剂中细菌的芽孢喜欢潮湿环境，因此，在田间湿度越大药效越高。阳光：阳光中的紫外线对芽孢有杀伤作用。所以，喷施细菌生物农药最好再傍晚或阴天进行。雨水：喷施细菌生物农药后短期内，如遇大雨，会降低药效。 本品对蜜蜂有毒，对家蚕高毒；对鱼类等水生生物有毒。 不能与内吸性有机磷杀虫剂或杀菌剂混合使用。 对人、畜无毒，使用安全。选择性强，不伤害天敌。不污染环境，不影响土壤微生物的活动，连续使用，无残毒，不易产生抗性。
蛋白质结晶方法探究
蛋白质结晶方法探究 发表时间：2018-08-20T14:56:45.123Z 来源：《医药界》2018年1月下作者：高铨，解婧妍 [导读] 有机大分子蛋白质是生命物质基础，其基本组成单位是氨基酸，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。它与生命以及各种生命活动紧密联系，几乎参与了全部生理过程。蛋白质还是大多数食品的主要成分，是一类重要的产能营养素。（西北工业大学陕西西安 710072） 本文相关工作受到国家级大学生创新创业训练计划（新型CDM结晶板悬滴法对蛋白质结晶影响，资助号#201710699109）支持。【摘要】有机大分子蛋白质是生命物质基础，其基本组成单位是氨基酸，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。它与生命以及各种生命活动紧密联系，几乎参与了全部生理过程。蛋白质还是大多数食品的主要成分，是一类重要的产能营养素。蛋白质的复杂结构决定了其功能的复杂性，鉴于此，要研究蛋白质的具体功能及其应用的前提是解析出高分辨率的三维结构。 【关键词】蛋白质结晶 X射线衍射晶体质量 引言 目前，测定蛋白质空间结构的有效方法主要有X射线衍射技术、核磁共振技术及电镜技术。电镜法研究不染色的蛋白质分子结构明显的困难是样品对电子损伤的高敏感性和样品在真空中三维结构的改变。核磁共振技术解析蛋白质的结构虽不需结晶，可研究动力学，但因分子量的限制，且需要标记。因此，解析蛋白质的结构最有力的方法首推X射线衍射技术，它能精确确定生物大分子中各原子坐标，确定共价键键长、键角。 据PDB数据库的统计，超过88%的蛋白质是由X射线衍射技术得到的，所以充分利用这项技术对于开展后续研究十分重要。X射线衍射技术解析蛋白质结构需获得蛋白质晶体，而这种晶体不是普通的晶体，它必须具有足够大小和质量才能保证数据收集的准确性。因此，得到符合要求的晶体成为了整个衍射过程的关键，是最终决定结构解析成功与否的因素。获得可以用于X射线衍射的高质量蛋白质晶体也成为晶体学领域追求的目标。 蛋白质结晶过程是蛋白质分子在溶液中析出的过程。蛋白质分子首先在其过饱和溶液中形成晶核，之后由于溶液中蛋白质浓度降低，蛋白质结晶生长趋于平稳，具体表现是蛋白质不再形核，晶体逐渐长大。这个过程中要想获得高质量的蛋白质晶体一般需要考虑一些问题，如如何获得高纯度的蛋白质溶液，选择什么结晶方法能获得质量好的晶体。本文基于此，对现有结晶方法进行总结，并介绍一些在蛋白质结晶领域的新技术。 1 传统结晶方法 A. 批量结晶法 该方法是最古老也是最简单的方法，蛋白溶液和结晶试剂开始就在确定的浓度下混合，其中蛋白质溶液一定是处于过饱和状态[1]。混合溶液一般处于密封的体系下，溶液各种参数都不变化，形成的晶体也不溶解。这种方法也有一个比较明显的缺点，由于这种方法需要大量且纯净的蛋白质晶体，但多数纯化得的蛋白质最终量都是非常少，所以，该方法未被大量使用，取代的是微量批量结晶法[2]，该方法只需非常少量的结晶液，结晶液滴混合后被分配到低密度的石蜡油和硅胶的混合物中。因液滴的密度要大，故整个过程都在石蜡油中进行，在这种混合物中的结晶效果等同于蒸汽扩散结晶，同时又可以防止溶剂挥发、空气污染和外界晃动，方便装置的移动，但溶液包含小分子有机物的实验不能用此方法，因为他们会溶解入油滴中。 B. 气相扩散法 气相扩散法主要是利用在蛋白质和沉淀剂混合的液滴中，沉淀剂的浓度低于晶体形核所需要的浓度，导致水分子不断从低浓度的液滴向高浓度的液池扩散，液滴中的蛋白质浓度逐渐增加并于沉淀剂结合，进而实现结晶。 气相扩散法的优点在于晶体生长的过程缓慢，蛋白有足够的时间在晶格中堆积，节省样品而且可有效利用储存空间。 C. 平衡透析法 平衡透析法需要用半透膜在装置里形成一个分隔面，在左右两边分别是蛋白质溶液和结晶试剂，因为两边存在浓度梯度，所以在结晶试剂里的小分子如离子、添加剂和缓冲剂就会通过半透膜进入到样品区，样品区的沉淀剂浓度逐渐增加。与此同时，由于蛋白质分子属于大分子，不能通过半透膜，由于结晶试剂里的小分子在样品区的浓度逐渐增加，蛋白质浓度就会逐渐下降，最终达到过饱和状态形核结晶。这种方法可以用于大规模的结晶实验，但要注意的是不是所有的结晶试剂都能应用此方法。 D. 液-液扩散法 又叫自由界面扩散法，这个方法是利用扩散作用而达到体系平衡并析出蛋白质晶体的过程。通常是将样品蛋白质溶液和结晶液在一个毛细管状的容器中，两者存在着浓度梯度，通过缓慢的扩散，整个系统自发的选择形核和晶体生长的过饱和状态。这种方法在确定了沉淀剂、pH和缓冲液后，可以作为筛选条件的微调实验。 2新技术的应用 一些生物结构科学家通过将传统方法和现在最新技术相结合，在传统的基础上提出了一系列有关于蛋白质结晶的新方法，提高了蛋白质结晶的质量。 由于蛋白质晶体生长是在晶核的基础上进行的，晶核的质量直接影响到蛋白质量。由于高质量的晶核是在较低的过饱和的状态下形成的，条件比较难控制。因此在2004年Ireton等学者利用低分辨率的晶体作为籽晶，导入到新结晶溶液中得到了适于衍射的高分辨率晶体[3]。D’ Arcy 等人在此基础上用导入籽晶的方法对牛胰岛素等5种蛋白结晶条件进行了筛选，发现导入籽晶可以有效的提升使蛋白质结晶筛选的成功率[4]。 共结晶技术近年来也成为提高蛋白质结晶质量的一种常用方法。有些晶体在与核苷酸、协同因子或是一些小分子可以稳定存在。Schartman等学者通过计算的方法证明共结晶技术可稳定晶体热力学性质，从而更易得到晶体[5]。实验证明这种方法尤其适用于配体溶解度很低或者蛋白质分子容易聚合的情况下，可以显著提高结晶成功率，尤其是一些膜蛋白只有与配体共结晶后才能得到晶体。
苏云金杆菌
苏云金杆菌杀虫剂 苏云金杆菌简称Bt，是包括许多变种的一类产晶体芽孢杆菌。可用于防治直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目，特别是鳞翅目的多种害虫。目前世界上研究最深入, 应用最广泛的微生物杀虫剂, 对人畜安全, 不伤害控制害虫群体的天敌, 不污染环境, 是生物防治害虫的重要组成部分, 更适合农作物虫害的综合防治。 苏云金杆菌是一种微生物源低毒杀虫剂，以胃毒作用为主。该菌可产生两大类毒素，即内毒素（伴胞晶体）和外毒素，使害虫停止取食，最后害虫因饥饿和死亡而外毒素作用缓慢，在蜕皮和变态时作用明显，这两个时期是RNA合成的高峰期，外毒素能抑制依赖于DNA的RNA 聚合酶。该药作用缓慢，害虫取食后2天左右才能见效，持效期约1天，因此使用时应比常规化学药剂提前2～3天，且在害虫低龄期使用效果较好。由于苏云金杆菌制剂的杀虫活性物质是一种毒性晶体蛋白与活菌的混合物, 其防效易受强光、温度和雨水的影响。最适宜使用苏云金杆菌的温度是24～32℃, 不适宜温度为13～17℃, 雨水主要影响施药的残效期。使用苏云金杆菌杀虫剂一定要在阴天或晴天下午4点以后施药于害虫危害部位。对鱼类、蜜蜂安全，但对家蚕高毒。 苏云金杆菌一般对暴食叶片的鳞翅目害虫防效好, 对结苞、卷叶、钻蛀性害虫防治技术性强。如: 2 代棉铃虫发育世代较整齐, 前代成虫产卵主要在棉株嫩尖上, 且初孵幼虫有食卵壳的习性, 防治2代棉铃虫, 主要喷在棉株顶部嫩叶正反面, 即可达到防治效果。稻纵卷叶螟幼虫两龄前结苞较松, 傍晚转苞危害, 防治它应在其幼虫2 龄前, 傍晚施药。玉米螟幼虫在玉米心叶末期, 有群聚喇叭口内危害习性,只要用苏云金杆菌对着喇叭口喷雾或拌毒土撒施入喇叭口内即可。小菜蛾( 吊丝虫) 幼虫2 龄前, 喜在十字花科作物叶背群聚食叶肉, 这是防治的最适期。豆荚螟, 本着治花不治荚的原则, 在日出前重点喷在蕾、花、嫩荚和落地花上。第2 代茶毛虫的初孵幼虫,有群聚叶背取食叶肉习性, 用苏云金杆菌防治应掌握这一时机。苏云金杆菌杀虫剂混用性能好，苏云金杆菌杀虫剂与化学农药交替使用可克服害虫的抗化学农药性。Bt杀虫剂可与多种其它生物制剂、昆虫生长调节剂、菊酯类沙蚕毒素类、氨基甲酸酯类、有机磷类农药及部分杀菌剂和化学肥料现混现用。
蛋白质纯化与结晶的原理
获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈，就是制备大量纯化的蛋白质（>10mg），其浓度通常在10mg/ml 以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖（clone）的方式嵌入表现载（expressionvector）内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌（Escherichia coli），在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。 在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体。 蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法（Vapor Diffusion Method）的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质（10-50 mg/ml）溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度（~1.0M）的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度（~2.0M）硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的。 蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处，但在晶体的内部，却有很大的差异。一般而言，蛋白质晶体除了蛋白质分子外，其他的空间则充满约40%至60%之间的水溶液，其液态的成分不仅使晶体易碎，也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现，造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性，让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态，极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构，基本上可视为自然状态下的结构。
苏云金芽孢杆菌作业
发酵工艺学作业 题目苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展 学院 班级学号 姓名
苏云金芽孢杆菌生物农药发酵工艺研究进展 摘要：苏云金芽孢杆菌（Bt）是一种开发和利用较为成功的微生物生物农药，但也存在着生产成本高、发酵条件难控制等缺点。本文主要综述了Bt生物农药的发酵工艺研究进展，主要包括BT发酵中的培养基、温度、PH值、通氧量以及发酵时间等方面。并对Bt生物农药的发展前景作出了展望。 关键词：苏云金芽孢杆菌；生物农药；发酵工艺；展望 Review on fermentation of Bacillus thuringiensis Abstract:Bacillus thuringiensis (Bt) is a microbial pesticides,Which has been successful developed and used.The fermentation technology of Bacillus thuringiensis (Bt) in recent years were summarized, including raw material, temperature, pH value, oxygen, fermentation time.In this aricle,the development prospct of Bt microbial pesticides is also put forward. Key words: Bt;microbial pesticides; fermentation technology;forward 前言 生物农药又可称为绿色农药、生态农药，是20世纪70年代提出的，是指可以用来防治病、虫、草、鼠等有害生物及调节植物生长的生物体或源于生物体的各种生理活性物质。生物农药不仅具有常规农药的高活性，能大规模工业化生产，而且专一性强，一般不伤害虫的天敌和有益生物，对人畜无毒，不污染环境，可在田间大规模应用。 微生物生物农药是生物农药中的主要类型之一[1]。而在微生物生物农药方面又以苏云金芽孢杆菌（Bt）为目前产量最大，应用最为广泛的一类细菌杀虫剂[2,3]，占到生物农药的90%左右[4]。Bt的发酵方式可分为液体发酵和固体发酵两种类
苏云金杆菌&阿维菌素简介
苏云金杆菌 苏云金杆菌又称苏云金芽胞杆菌，英文名称：Bacillus thuringiensis（B.t.）为了方便都将B.T.写成BT或Bt，故Bt即苏云金杆菌的简称。苏云金杆菌杀虫剂是利用苏云金杆菌杀虫菌经发酵培养生产的一种微生物制剂。苏云金杆菌在自然状态下以一种生物细菌的形式生存于土壤及水中。这种杀虫菌在生长发育过程中产生芽胞并形成一种蛋白质毒素，在显微镜下观察，通常是不规则的菱形结晶，叫做伴孢晶体。 当害虫蚕食了伴孢晶体和芽孢之后，在害虫的肠内碱性环境中，伴孢晶体溶解，释放出对鳞翅目幼虫有较强毒杀作用的毒素。这种毒素使幼虫的中肠麻痹，呈现中毒症状，食欲减退，对接触刺激反应失灵，厌食，呕吐，腹泻，行动退缓，身体萎缩或卷曲。一般对作物不再造成危害，经一段发病过程，害虫肠壁破损，毒素进入血液，引起败血症，同时芽孢在消化道内迅速繁殖，加速了害虫的死亡。死亡幼虫身体瘫软，呈黑色。所以，害虫只有把Bt细菌吃到肚子里，再经过一个发病过程，才能死掉，大约48小时方能达到杀灭害虫的目的。 Bt杀虫剂与化学农药相比有许多优点 第一，对人畜无毒，使用安全。Bt细菌的蛋白质毒素在人和家畜、家禽的胃肠中不起作用。
第二，选择性强，不伤害天敌。Bt细菌只特异性地感染一定种类的昆虫，对天敌起到保护作用。 第三，不污染环境，不影响土壤微生物的活动，是一种干净的农药。 第四，连续使用，会形成害虫的疫病流行区，造成害虫病原苗的广泛传播，达到自然控制虫口密度的目的。 第五，没有残毒，生产的产品可安全食用，同时，也不改变蔬菜和果实的色泽和风味。 第六，不易产生抗药性，这只是相对而言。最近已经发现了抗药性的报道，但不象化学农药产生的那么快。 毒性： 鼠经口按2*10^22活芽孢/Kg体重给药无死亡，也无中毒症状。18名志愿者每人每天吞服30亿芽孢，连服5天，1个月后检查，一切化验正常，无毒性反应。亚急性和毒性试验未见异常，对猪、禽、鸟、鱼、蜂的急性和慢性饲喂养试验未见不正常现象，对家蚕敏感。无致癌、致畸、致突变作用。注意事项： [1]本品对家蚕有毒，蚕室和桑园附近禁用； [2]不能与内吸性有机磷杀虫剂或杀菌剂混合使用(如乐果、甲基内吸磷、稻丰散、伏杀硫磷、杀虫畏)及碱性农药等物质混合使用。
苏云金杆菌(2014551355)
品名：苏云金杆菌（无添加任何化学杀虫成分） 有效含量：16000iu/mg 剂型：可湿性粉剂 净含量：100克 一、作用方式及特点 苏云金杆菌又称苏云金芽胞杆菌是一种革兰氏阳性细菌，英文名称：Bacillus thuringiensis （B.t.）即苏云金杆菌的简称。苏云金杆菌（Bt菌）杀虫剂是利用苏云金杆菌杀虫菌经发酵培养生产的一种微生物制剂。Bt的杀虫活性物质,主要有二种,即晶体和孢子.晶体又叫原毒素,它是一种蛋白质。当害虫蚕食了伴孢晶体和芽孢之后，在害虫的肠内碱性环境中，伴孢晶体溶解，释放出对鳞翅目幼虫有较强毒杀作用的毒素—毒性肽。这种毒素使幼虫的中肠麻痹，肠道内碱性内含物漏入血腔，孢子和菌体通过被破坏的肠壁进入体腔。使其呈现中毒症状，食欲减退，对接触刺激反应失灵，厌食，呕吐，腹泻，行动退缓，身体萎缩或卷曲。一般对作物不再造成危害，经一段发病过程，害虫肠壁破损，毒素进入血液，引起败血症，同时芽孢在消化道内迅速繁殖，加速了害虫的死亡。死亡幼虫身体瘫软，呈黑色。所以，害虫只有把Bt细菌吃到肚子里，再经过一个发病过程，才能死掉，大约48小时方能达到杀灭害虫的目的，不象化学农药作用那么快，但染病后的害虫，上吐下泻，不吃不动，不再危害作物。 毒性：对人、畜低毒，大鼠口服急性LD50 852.7-856.7毫克/公斤，对家禽、鸟类、鱼、畜等低毒,对害虫天敌无伤害。 中毒症状: 吞服了制剂可能引起胃肠炎。 中毒急救：溅到皮肤或眼内立即用清水冲洗15分钟后就医。吸入，应将病人移到通风处，就医。误服，立即催吐，并送医院对症治疗。 二、杀虫原理 苏云金杆菌长得像根棍棒，矮矮胖胖,身高不到5‰毫米。当它长到一定阶段，身体一端会形成一个卵圆形的芽孢，用来繁殖后代；另一端便产生一个菱形或近似正方形的结晶体，因为它与芽孢相伴而生，我们叫它伴孢晶体，有很强的毒性。昆虫取食后，晶体蛋白在昆虫碱性肠道内溶解，经过中肠蛋白酶的酶解作用，将前毒素降解为活性蛋白。活性蛋白插入昆虫中肠细胞膜，形成跨膜离子通道或孔，破坏钾离子平衡，最终使昆虫中毒，麻痹而死。三、防治对象 Bt对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等100多种害虫和动植物线虫有很好的毒杀作用。国内外应用统计，Bt对64种森林害虫，34种果树害虫，12种茶树害虫都显示高毒力。最常用具特效的防治对象有：菜青虫、小菜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟、稻苞虫、稻纵卷叶螟、二化螟、三化螟、棉铃虫、棉小造桥虫、茶毛虫、茶尺蠖、松毛虫、天幕毛虫、毒蛾、刺蛾等鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目等害虫有很好的防治效果，且有杀卵作用。此外对大豆拌种防治地下线虫也有特效。 四、使用方法 1.一包100克可兑水100斤 2.可放农用喷雾器里（一喷雾30斤水），也可放园艺喷雾（800ml约可配18桶/1500ml 可配10桶。记得喷撒之前先过滤沉淀物哦，以免塞住喷壶嘴) 3.杀虫剂苏云金杆菌制剂可用于喷雾、喷粉、灌心、制成颗粒剂或毒饵等，也可进行 大面积飞机喷洒，也可与低剂量的化学杀虫剂混用以提高防治效果。草坪害虫的防 治用100亿孢子/g的菌粉750g／hm2对水稀释2000倍喷洒，或用乳剂1500～ 3000g/hm2与52.5～75kg的细沙充分拌匀，制成颗粒剂撒人草坪草根部，防治危 害根部的害虫。也可将苏云金杆菌致死的发黑变烂的虫体收集起来，用纱布袋包好，在水中揉搓，每50g虫尸洗液加水50～l00kg 喷雾（病毒重复利用！）。(2)防治蔬
蛋白质纯化与结晶的原理获得蛋白质的晶体结构的第一个
中国试剂网 3.15.2.19 蛋白质纯化与结晶的原理 获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈，就是制备大量纯化的蛋白质（>10mg），其浓度通常在10mg/ml以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖（clone）的方式嵌入表现载体（expression vector）内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌（Escherichia coli），在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。 在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沉淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体。 蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法（Vapor Diffusion Method）的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质（10～50mg/ml）溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度（~1.0M）的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度（~2.0M）硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的。 蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处，但在晶体的内部，却有很大的差异。一般而言，蛋白质晶体除了蛋白质分子外，其他的空间则充满约40%至60%之间的水溶液，其液态的成分不仅使晶体易碎，也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现，造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性，让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态，极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构，基本上可视为自然状态下的结构。