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腺相关病毒操作技巧——轻松入门

--您身边的病毒载体专家腺相关病毒操作手册

AAV相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。

01操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用 70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。

03接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用84消毒液浸泡后统一处理。

04如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。

05病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。06

实验完毕后请用洗手液清洗双手。

一、AAV安全使用注意事项

AAV的储存

＋

收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于-80℃。

注：a．反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融病毒滴度会降低10%-50%），因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融。汉恒生物已对病毒进行了分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃保存即可。 b．若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度。

二、AAV储存与稀释的注意事项

02三、AAV介绍

四、汉恒生物AAV产品服务及载体信息与现货列表

01一、AAV安全注意事项二、AAV储存和稀释注意事项

08十、AAV滴度测定

14十三、AAV病毒的使用

附录1参考文献

06五、AAV整体实验流程六、实验材料

09十一、AAV感染细胞测试

十二、AAV用于动物实验（重磅干货，五星推荐）

七、AAV载体构建八、AAV包装九、AAV收集和纯化

腺相关病毒操作手册

AAV的稀释

＋

需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用无菌PBS或生理盐水混匀分装后置于4℃保存（一周内使用完最佳）。

● 安全-AAV不参与任何疾病的发生，已经用于临床疾病的治疗；● 高效-病毒滴度高达1013以上，组织感染能力超强；● 表达周期久-AAV免疫原性超低，基因持续表达半年以上；

● 最全血清型-拥有全部血清型和一系列突变体亚型，几乎可以感染所有的组织和脏器；

● 组织特异性-拥有DIO元件载体系统和最全的组织特异性启动子工具箱，如心脏、肝脏、肌肉以及各种神经元特异的启动子等；

● 病毒产品全部经过无菌、无支原体、无内毒素检测，让实验安全放心。

汉恒AAV产品特点

＋

腺相关病毒（AAV）属微小病毒科（parvovirus），为无包膜的单链线状DNA病毒。只有在腺病毒或者疱疹病毒等辅助病毒协助下，宿主才能产生具有感染性的AAV，所以AAV被称作腺相关病毒。典型的AAV2基因组约 4800 bp，包括2个反向末端重复序列（ITR，145 bp）和两个读码框（ORF）-Rep和Cap（图1）。ITR对合成互补DNA链是必需的；Rep和Cap可以翻译成多种不同蛋白，如AAV生活周期必需的Rep78、Rep68、Rep52和Rep40以及包膜蛋白VP1、VP2及VP3等。AAV病毒系统就是用目的基因替换掉Rep和Cap，然后与表达Rep和Cap基因的质粒共转，从而产生包含目的基因的AAV。目前AAV有12种血清型、100多种变体。不同的血清型对组织或器官有着不同的亲和性。由于安全性高、免疫原性小、表达周期久等优点，AAV被称为目前最适合在体研究（in vivo ）基因功能的利器。

三、AAV介绍

● 常规基因的过表达和干扰定制（载体列表见“七、载体构建”部分）；● 组织特异性启动子过表达定制（载体列表见“七、载体构建”部分）；● 常规启动子和组织特异性启动子驱动的AAV-Cas9定制；● AAV介导的光遗传、化学遗传载体现货及改造服务等（见表3）；● 双标、单标LC3自噬流监测工具（见表5）；● 组织特异性AAV-DIO载体的定制（原理见附件1）。

汉恒AAV产品分类

＋

四、汉恒生物AAV产品服务及载体信息与现货列表

4.8 kb

1、汉恒生物AAV主要载体列表（表1）

（部分组织特异性启动子如心脏、肝脏、肌肉等没有在表中列出，欢迎咨询定制。）

载体类型载体名称可插入片段大小启动子及其特点标记基因是否Cre依赖

pHBAAV-CMV-MCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen pHBAAV-CAG-MCS-T2A-ZsGreen

pHBAAV-CAG-MCS-T2A-mcherry pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-ZsGreen

pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-GFAP-T2A-EGFP pHBAAV-U6-MCS-CMV-ZsGreen pHBAAV-U6-CMV-mCherry

pHBAAV-CMV-crRNA-EF1-ZsGreen pHBAAV-gRNA-saCas9

1.6 kb 1.2 kb 1.5 kb 1.5 kb 1.2 kb 1.2 kb 1.6 kb 1.6 kb 1.6 kb 1.6 kb 1.6 kb shRNA shRNA 1.2 kb gRNA

circRNA过表达在体敲除

过表达

干扰

ZsGreen ZsGreen ZsGreen mcherry ZsGreen mcherry ZsGreen mcherry ZsGreen mcherry EGFP ZsGreen mcherry ZsGreen 无

否否否否是是否否否否否否否否否

CMV，广谱，强CMV，广谱，强CAG，广谱，强CAG，广谱，强CAG，广谱，强CAG，广谱，强hSyn，成熟神经元，

中强度hSyn，成熟神经元，

中强度 CamkII，兴奋性经元神经特异启动子，强CamkII，兴奋性经元神经特异启动子，强GFAP，星形胶质细胞，

中强度

U6U6CMV，广谱，强

02腺相关病毒操作手册

AAV2基因组示意图

2、汉恒生物AAV光遗传学工具现货列表（表2）

载体类型载体名称启动子及其特点标记基因是否Cre依赖

抑制激活抑制红光激活抑制激活抑制激活抑制红光激活抑制激活抑制激活抑制红光激活抑制激活抑制激活抑制红光激活抑制激活抑制激活抑制红光激活抑制激活pHBAAV-CAG-DIO-eNpHR3.0-EYFP

pHBAAV- CAG -DIO-hChR2(H134R)-mcherry

pHBAAV- CAG -DIO-ArchT-EYFP

pHBAAV- CAG -DIO-C1V1 (t/t)-TS-mcherry

pHBAAV- CAG -DIO-Arch3.0-EYFP

pHBAAV- CAG -DIO-hCHETA-EYFP

pHBAAV-CMV-DIO-eNpHR3.0-EYFP

pHBAAV-CMV-DIO-hChR2(H134R)-mcherry

pHBAAV-CMV-DIO-ArchT-EYFP

pHBAAV-CMV-DIO-C1V1 (t/t)-TS-mcherry

pHBAAV-CMV-DIO-Arch3.0-EYFP

pHBAAV-CMV-DIO-hCHETA-EYFP

pHBAAV-hSyn-eNpHR3.0-EYFP

pHBAAV-hSyn-hChR2(H134R)-mcherry

pHBAAV-hSyn-ArchT-EYFP

pHBAAV-hSyn-C1V1-(t/t)-TS-mcherry

pHBAAV-hSyn-Arch3.0-EYFP

pHBAAV-hSyn-DIO-hCHETA-EYFP

pHBAAV-GFAP-eNpHR3.0-EYFP

pHBAAV-GFAP-hChR2(H134R)-mcherry

pHBAAV-GFAP-ArchT-EYFP

pHBAAV-GFAP-C1V1 (t/t)-TS-mcherry

pHBAAV-GFAP-Arch3.0-EYFP

pHBAAV-GFAP-hCHETA-EYFP

pHBAAV-CaMKII-eNpHR3.0-EYFP

pHBAAV-CaMKII-hChR2(H134R)-mcherry

pHBAAV-CaMKII-ArchT-EYFP

pHBAAV-CaMKII-C1V1 (t/t)-TS-mcherry

pHBAAV-CaMKII-Arch3.0-EYFP

pHBAAV-CaMKII-hCHETA-EYFP

EYFP

mcherry

EYFP

mcherry

EYFP

mcherry

EYFP

mcherry

EYFP

mcherry

EYFP

mcherry

EYFP

mcherry

EYFP

mcherry

EYFP

mcherry

EYFP

mcherry

EYFP

是

否

CAG（人巨细胞病毒启动

子CMV和鸡beta-actin嵌

合型启动子），广谱，强

CMV（人巨细胞病毒启动

子），广谱，强

hSyn（人源成熟神经元特

异启动子），中强度

GFAP（星形胶质细胞特异

启动子），中强度

CaMKII（兴奋性经元神经

特异启动子），强

3、汉恒生物AAV化学遗传学工具现货列表（表3）

载体类型载体名称启动子及其特点标记基因是否Cre依赖

pHBAAV-CAG-DIO-DTR-2A-GFP

pHBAAV-hSyn-DTR-2A-GFP

pHBAAV-CaMKII-DTR-2A-GFP

pHBAAV-CAG-DIO-hM3D(Gq)-mCherry

pHBAAV-CAG-DIO-hM4D(Gi)-mCherry

pHBAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry

pHBAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry

pHBAAV-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry

pHBAAV-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry

pHBAAV-CaMKII-hM3D(Gq)-mCherry

pHBAAV-CaMKII-hM4D(Gi)-mCherry

GFP

mCherry

是

否

是

否

Gq-DREADD

Gi- DREADD

Gq-DREADD

Gi- DREADD

Gq-DREADD

Gi- DREADD

Gq-DREADD

Gi- DREADD

白喉毒素介导的

细胞毒性

CAG（CMV和鸡beta-actin嵌合型启动子），

广谱，强

hSyn（人源成熟神经元特异启动子），

中强度

CaMKII（兴奋性经元神经特异启动子），

强

CAG（CMV和鸡beta-actin嵌合型启动子），

广谱，强

CAG（CMV和鸡beta-actin嵌合型启动子），

广谱，强

hSyn（人源成熟神经元特异启动子），

中强度

hSyn（人源成熟神经元特异启动子），

中强度

hSyn（人源成熟神经元特异启动子），

中强度

hSyn（人源成熟神经元特异启动子），

中强度

CaMKII（兴奋性经元神经特异启动子），

强

CaMKII（兴奋性经元神经特异启动子），

强

5、汉恒生物AAV-mRFP-GFP-LC3自噬流监测工具（表5）

载体类型载体名称启动子及其特点标记基因是否Cre依赖

pHBAAV-mRFP-GFP-LC3

pHBAAV-GFP-LC3

CMV，广谱，强

双标

单标

mRFP/GFP

GFP

否

4、汉恒生物AAV-retro神经逆行示踪工具现货列表（表4）

载体类型载体名称启动子及其特点标记基因功能说明

腺相关病毒操作手册

神经逆行标记

AAV2/retro-EGFP

AAV2/retro-CAG-cre

AAV2/retro-DIO-EGFP

AAV2/retro-DIO-tdtomato

AAV2/retro-EF1a-DIO-Flp

CAG，广谱

EF1a，广谱

EGFP

无

EGFP

tdtomato

无

表达EGFP

表达cre重组酶

cre依赖表达EGFP

cre依赖表达tdtomato

cre依赖表达Flp重组酶

五、整体实验流程（图2）

Step Ⅰ

Step Ⅱ

Step Ⅲ

Step Ⅳ

Step Ⅴ

无菌无内毒素等质控，动物实验

六、实验材料

图2、 AAV包装实验流程图

AAV系统包括目的基因表达质粒（过表达、干扰等）pHBAAV-xxx（表1~5）、包装载体pAAV-RC和pHelper。

● pHBAAV-xxx载体信息请参考表1~5。

● 菌株：大肠杆菌菌株Stbl3。用于扩增pHBAAV-xxx及其包装质粒。

● 细胞株：AAV-293，AAV病毒的包装细胞，生长培养基为DMEM+10% FBS+双抗（完全培养基）。为了保证实验的稳定性和持续性，在AAV-293细胞对数生长期尽量多冻存一些细胞作为备份，增加细胞复苏成活率。

注：为了达到最好的细胞培养状态，推荐使用汉恒生物推出的SaveIt TM 抗支原体试剂（货号：HB-SV-1/2/3/5/10）。

七、AAV载体构建

AAV包装之前需要构建表达目的基因的载体pHBAAV-xxx。汉恒生物提供表1所示的载体骨架，可以自由选择启动子（包括组织特异性启动子定制）、荧光标记、是否需要Cre依赖等特点进行定制。同时汉恒生物也拥有大量的AAV通用载体现货，比如光遗传、化学遗传、自噬流监测等。质粒构建完成后需要转化后再使用去内毒素质粒试剂盒（比如Qiagen、MN等）抽提，浓度要求大于1 μg/μl，A260/280在1.7~1.8范围内方可用于下一步的病毒包装。

注：为了快速高效构建载体，强烈推荐使用汉恒生物推出的HB-Infusion TM 无缝克隆载体构建试剂盒（货号：HB-infusion-20/50/100）。

八、AAV病毒包装

事先准备好用于包装病毒的AAV-293细胞（50-70%的汇合度，无支原体污染）和病毒质粒，转染一个10 cm培养皿成分如下（表6）：

九、AAV收集和纯化

转染后72 h，收集所有的细胞用液氮反复冻融三次收集上清液，然后使用Benonase 酶消化，所得上清用Biomiga品牌纯化柱纯化，所得病毒分装后于-80°C保存。

pAAV-RC pHelper pHBAAV-xxx LipoFiter TM

10 μg 20 μg 10 μg 100 μl

表6、AAV包装过程中转染一个标准10 cm dish所需要质粒和转染试剂组分表。

DMEM需在37℃水浴中预热，LipoFiter TM 转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。转染后6 h换新鲜培液。

注：a、LipoFiter TM 转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipoFiter TM 说明书（货号：HB-TRLF-1/2/3/10）。 b、转染前细胞必须处于良好的生长状态。

c、病毒实验带有一定的危险性，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套，在生物安全柜（BL-2）里进行实验操作。

06腺相关病毒操作手册

十、AAV滴度测定

标准品和待测样品的Ct值如下（表7）

样品名称 CT值1 CT值2 CT值3

1010标准品109标准品108标准品107标准品106标准品待测AAV样品

4.517.2110.9714.1917.7512.78

4.327.6110.5514.3817.5812.65

4.427.2510.6714.3517.6812.81

表7、一次典型绝对定量过程中标准品和待测样品的CT值。

图3、绝对定量中的标准曲线。

以每组AAV标准品的Ct (average)为纵坐标Y，其对应拷贝数的对数为横坐标X，绘制标准曲线如下（图3）：

把待测样品的Ct平均值带入公式，得到X=7.45。代入AAV病毒滴度公式：10x

×40000 v.g./ml=10

7.45

×40000 =1.1 x 1012

v.g./ml.

十一、AAV感染细胞测试

病毒滴度测定完成之后还不能贸然进行动物实验。汉恒生物需要确认纯化的病毒是否有细菌、真菌、支原体和衣原体等污染，以及是否符合内毒素指标。除此之外，汉恒生物还需要确认得到的病毒是否具有活性。通常会用纯化之后的AAV感染293T、CHO等细胞系测试一下基因表达情况，通常MOI控制在104~105之间 (MOI是感染复数，即每个细胞对应的病毒粒子数目)。如荧光蛋白表达情况等。最终会得到具有感染活力、无菌、无支原体衣原体、去除内毒素的AAV病毒，可以直接用于下一步的动物实验。

注：AAV对细胞系的感染能力很弱，一般不推荐用于体外实验。

十二、AAV用于动物实验

纯化后的AAV通过细胞感染测试之后方可用于动物试验。对于常规的组织或器官，如心脏、肝脏、肺、肾脏、乳腺、胰腺、卵巢、脑、眼睛、骨骼肌、肠道、血管、脂肪组织等，汉恒生物系统整理了小鼠和大鼠各组织脏器病毒感染对应的最优AAV亚型、注射方法以及剂量等关键信息，另外

汉恒生物也整理了常见组织脏器AAV注射的操作视频（限于篇幅没有一一附上），欢迎大家下方扫描二维码联系客服，咨询索取参阅。

AAV注射感染组织器官至少3周后可取材进行冰冻切片直接观察荧光（如GFP , RFP等）、石蜡切片（可以组化染色）、荧光定量PCR（qPCR），甚至免疫印迹（WB）来检测基因表达情况。（一般情况下，对于心肌、骨骼肌、肝脏、肾脏、皮肤等适合原位注射的组织器官，注射感染

适量带有GFP标记的AAV（3-4周后用肉眼即可观察到）。

汉恒生物制作了常用组织器官的感染条件和效果图谱

（图4-图15）供大家参阅：

汉恒生物官方营销账号二维码

08腺相关病毒操作手册

汉恒生物-AAV in vivo

效果图谱

实例-心肌的基因转导

病毒类型及滴度：AAV-GFP，9型，滴度1×1012

vg/ml

感染动物：大鼠，SD，2月龄

感染部位：心脏

注射方式和体积：心肌原位注射；10 μl /点，注射5个点检测方法：感染3wk后冰冻切片，荧光显微镜检测

汉恒生物

汉恒实验室自验证！

病毒类型及滴度：AAV-GFP，9型，滴度1

1012

vg/ml 感染动物：小鼠，C57，8周龄感染部位：心脏

注射方式和体积：眼眶静脉注射；50 μl

检测方法：感染3周后冰冻切片，荧光显微镜检测

武汉大学人民医院

病毒类型及滴度：AAV-GFP，9型，滴度1×1012 vg/ml 感染动物：大鼠，SD，2月龄感染部位：心脏

注射方式和体积：心肌原位注射；10 μl /点，注射5个点检测方法：感染3周后冰冻切片，荧光显微镜检测

汉恒实验室自验证！

实例-穿血脑屏障-感染全脑

病毒：汉恒生物穿血脑屏障AAV2/BBB-GFP 滴度：1.4x1012 vg/ml

注射量：100 μl 注射部位：尾静脉

检测方法：注射感染3周，取材冰冻切片，confocol检测拍照

汉恒实验室自认证

实例-高效的肺组织基因转导

病毒类型及滴度：AAV-GFP，6型，滴度1×1012 vg/ml 感染动物：大鼠，SD，2月龄感染部位：肺脏

注射方式和体积：气管注射；100 μl

检测方法：感染3周后冰冻切片，荧光显微镜检测

汉恒实验室自验证！

实例-在体感染小鼠肌肉组织

病毒类型及滴度：AAV-Luc，9型，滴度1×1012 vg/ml 感染动物：小鼠，C57，8周龄感染部位：骨骼肌

注射方式和体积：骨骼肌原位多点注射；10 μl /点，4个点检测方法：感染4周，活体成像

病毒类型及滴度：AAV-GFP，9型，滴度1×1012 vg/ml 感染动物：小鼠，C57，8周龄感染部位：骨骼肌

注射方式和体积：骨骼肌原位多点注射；10 μl /点，4个点检测方法：感染4周，冰冻切片，荧光显微镜检测

中科院上海生科院丁秋蓉组

汉恒实验室自验证

病毒：汉恒生物逆行标记病毒AAV2/retro-EGFP 滴度：1.3x1012 vg/ml 注射量：1 μl

注射部位：SNc（黑质致密部）

检测：注射感染3周，取材切片，confocol检测拍照

腺相关病毒操作手册

（图4）

（图7）

（图8）

（图9）

（图5）

（图6）

实例-肾脏原位注射

病毒类型及滴度：AAV-GFP，9型和DJ型，滴度1×1012 vg/ml 感染动物：小鼠，C57，8周龄感染部位：肾脏

注射方式和体积：肾脏内多点注射；10 μl /点，6个点检测方法：感染4周，冰冻切片，荧光显微镜检测

第四军医大学

AAV-DJ

AAV-9

实例-神经逆行示踪基因转导

注射部位

SNc（黑质致密部）

逆行标记部位

MGP（内侧苍白球）

逆行标记部位

LGP（外侧苍白球）

逆行标记部位

PFC（前额叶皮层）

12实例-脑区基因转导

病毒类型及滴度：AAV-GFP，9型，滴度1×1012 vg/ml 感染动物：小鼠，C57，8周龄感染部位：见图

注射方式和体积：脑定位注射；1 μl

检测方法：感染3周后冰冻切片，荧光显微镜检测

脑干

海马(局部放大)

中脑

海马

汉恒实验室自验证！

实例-高效的肝脏基因转导

病毒类型及滴度：AAV-GFP，9型，滴度1×1012 vg/ml 感染动物：小鼠，C57，8周龄感染部位：肝脏

注射方式和体积：尾静脉，100 μl

检测方法：感染3周后冰冻切片，荧光显微镜检测

汉恒实验室自验证！

病毒类型及滴度：AAV-DJ，滴度1×1012 vg/ml 感染对象：新生4天的大鼠耳蜗感染部位：离体耳蜗组织

注射方式和体积： 200 μl病毒直接感染

检测方法：感染48h染色观察-绿色是病毒感染表达的GFP，红色荧光是nf200染色，蓝色荧光是heochst33342标记细胞核

汉恒某客户（按要求匿名）

实例-耳蜗组织（离体组织培养，离体感染）

腺相关病毒操作手册

（图10）

病毒类型及滴度：AAV-GFP，2型，滴度1×1012 vg/ml 感染动物：小鼠，C57，8周龄感染部位：视网膜

注射方式和体积：玻璃体腔注射；3 μl

检测方法：感染3周，wholemount，荧光显微镜检测

注射示意图中科院上海生科院张翼凤组江苏省人民医院

实例- 眼科学专用AAV视网膜基因转导

（图13）

（图15）

肝脏特异性AAV（AAV-pTBG-Luc）体内感染效果

病毒：AAV-pTBG-Luc，滴度1.4×1012 vg/ml 感染方式：尾静脉，100 μl

检测方式：感染3周，小动物活体成像

结论：AAV-pTBG-Luc尾静脉注射可高效感染体内肝脏，无非特异脏器感染；

汉恒实验室自验证

（图11）

（图12）

（图14）

实例-乳腺原位注射

病毒类型及滴度：AAV-GFP，9型，滴度1×1012 vg/ml 感染动物：小鼠，C57，8周龄感染部位：乳腺脂肪垫

注射方式和体积：乳腺内多点注射；10 μl /点，4个点检测方法：感染4周，冰冻切片，荧光显微镜检测

汉恒某客户（按要求匿名）

十三、AAV病毒的使用

AAV病毒主要应用于在体组织器官的感染，可根据不同的组织选择合适的血清型，可以用于高效神经系统、眼睛、心肌、肝脏、肺脏、肾脏、和肌肉等组织器官。15

14附件1-DIO原理

DIO全称是Double-floxed Inverted Orientation，是依赖于Cre-LoxP重组原理设计的组织特异性基因表达系统。原理如下图所示：

目的基因两侧分别带有两对正交的LoxP位点（如图中灰色的LoxP和黄色的lox2722）。在Cre工具鼠体内，比如肝脏特异性的Cre小鼠，感染到肝脏的目的基因在Cre重组酶表达的情况下，目的基因的表达框（图中eYFP和ChR2）会颠倒（inverted）一次，从而使目的基因和上游启动子的方向一致，确保基因正确表达翻译蛋白。在肝脏以外的组织，由于缺乏Cre表达，目的基因不会逆转，所以不会成功地翻译出蛋白。因此

，DIO系统可以保证目的基因的表达依赖于Cre重组酶的表达，从而实现了基因表达的组织特异性

1. Feng D, Wang B, Wang L et al. Pre-ischemia melatonin treatment alleviated acute neuronal injury after ischemic stroke by inhibiting ER stress-dependent autophagy via PERK and IRE1 signalings. J Pineal Res 2017.(客户文章: 自噬双标 AAV-GFP-RFP-LC3感染小鼠皮质监测自噬流)

2. Landegger, L. D., et al. (2017). "A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear." Nature Biotechnology.(改造的AAV亚型高效感染小鼠内耳细胞治疗耳聋)

3. Chen, M., et al. (2017). "Efficient Gene Delivery and Expression in Pancreas and Pancreatic Tumors by Capsid-Optimized AAV8 Vectors." Hum Gene Ther Methods 28(1): 49-59. （优化AAV8亚型高效感染小鼠胰腺和胰腺肿瘤）

4. Y ang H, Y ang J, Xi W et al. Laterodorsal tegmentum interneuron subtypes oppositely regulate olfactory cue-induced innate fear. Nat Neurosci 2016; 19:283-289. (汉恒客户：AAV9感染小鼠大脑)

5. Wu X, Wu X, Ma Y et al. CUG-binding protein 1 regulates HSC activation and liver fibrogenesis. Nat Commun 2016; 7:13498.（客户文章: AAV8介导肝脏特异性启动子在小鼠肝脏中特异性表达目的基因）

6. Wei, Y ., et al. (2016). “Prevention of Muscle Wasting by CRISPR/Cas9-mediated Disruption of Myostatin In Vivo.” Molecular Therapy 24(11): 1889-1891. （汉恒合作发表论文：AAV-saCas9编辑肌肉细胞）

7. Deverman, B. E., et al. (2016). "Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain." Nature Biotechnology 34(2): 204-209.（尾静脉注射AAV突变亚型可以直接透过小鼠血脑屏障感染大脑）

8. Y ang, Y ., et al. (2016). "A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice." Nature Biotechnology 34(3): 334-338.（AAV8介导CRISPR-Cas9矫正小鼠肝脏基因）

9. Lei S, Sun R-z, Wang D et al. Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels. Frontiers in Physiology 2016; 7.(客户文章: AAV-8感染小鼠肝脏)

10. Bennett, J., et al. (2016). “Safety and durability of effect of contralateral-eye administration of AAV2 gene therapy in patients with childhood-onset blindness caused by RPE65 mutations: a follow-on phase 1 trial.” Lancet 388(10045): 661-672. (临床试验：AAV2治疗遗传性视网膜病变)

11. Zhang X, Yuan Y, Jiang L et al. Endoplasmic reticulum stress induced by tunicamycin and thapsigargin protects against transient ischemic brain injury: Involvement of PARK2-dependent mitophagy. Autophagy 2014; 10:1801-1813. (客户文章：感染小鼠原代神经元)

12. Mingozzi, F. and K. A. High (2011). “Therapeutic in vivo gene transfer for genetic disease using AAV: progress and challenges.” Nature Reviews Genetics 12(5): 341-355. (综述：AAV用于在体治疗遗传性疾病)

13. Zincarelli, C., et al. (2008). “Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.” Molecular Therapy 16(6): 1073-1080. (系统研究AAV1-9不同血清型在小鼠不同组织的偏好性及其基因表达动力学差异)

参考文献

Insertion into Cre driver line

via AA

腺相关病毒操作手册

组织亲和性推荐血清型

汉恒生物多种不同血清型对各组织器官细胞亲和性列表（表8）

汉恒生物不同动物及不同组织部位AAV注射器材、体积和病毒量列表（表9）

感染部位动物注射方式推荐注射体积（μl ）备注

脑室心脏肝脏肺脏肾脏骨骼肌肠道腹部脂肪胰腺尾静脉眼睛

大鼠小鼠大鼠小鼠大鼠小鼠大鼠小鼠大鼠小鼠大鼠小鼠大鼠小鼠大鼠小鼠大鼠小鼠大鼠小鼠大鼠小鼠

AA V9AA V6AA V9AA V2、AA V9AA V2、AA V-DJ Anc80L65 立体定位注射玻璃体腔注射视网膜下腔注射

原位多点注射尾静脉注射尾静脉注射

气管切开注射

原位多点注射原位多点注射肠系膜上动脉注射胰腺导管注射腹内脂肪-腹腔注射皮下脂肪-原位注射1-5

10-15/点，3-5个点 100-250

100-20050-10010-15/点，3-5个点10-15/点，3-5个点

100-200100-300150每点10-15 μl

1-5

10μl Hamilton微量注射器，30-33G针头1 ml BD无菌胰岛素针，针头>27G 1 ml BD无菌胰岛素针，针头>27G 50μl Hamilton微量注射器，针头>29G 50μl Hamilton微量注射器，针头>29G 1 ml BD无菌胰岛素针，针头>27G 1 ml BD无菌胰岛素针，针头>27G 1 ml BD无菌胰岛素针，针头>27G 50μl Hamilton微量注射器，针头>29G 1 ml BD无菌胰岛素针，针头>27G 10μl Hamilton微量注射器，30-33G针头

1 ml BD无菌胰岛素针，针头>27G 50μl Hamilton微量注射器，针头>29G 血管内注射AA V8、AA V9肝脏心脏肺肌肉脑组织眼部—视网膜内耳眼部—角膜脂肪胰腺

穿血脑屏障感染脑组织逆行示踪

AA V-Anc AA V8AA V9AA V-BBB AA V-retro

腺病毒常见问题与解答

腺病毒常见问题与解答 1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求？有要求。对E1和E3双缺失的腺病毒载体，比如AdMax的Kit C、Kit D等，其总包装的外源片断要求小于8 kb。而对于只有E1缺失或E3缺失的载体，比如Kit A、Kit B等，外源片断要求小于5 kb。注意，外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。 2、我的试验需要多少总量的腺病毒载体？腺病毒介导外源基因的基因治疗研究一般分为体外培养细胞试验(体外试验)和动物试验(体内试验)两部分，不同的实验设计所需要的病毒量也不尽相同。根据经验，完成一个完整的肿瘤治疗实验需要腺病毒的病毒量总量约为3×1012 VP左右. 3、如何提高腺病毒的活性？提高腺病毒的活性，关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程，如果扩增的病毒滴度高，那么纯化后就会更高的。 4、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR（未翻译区）的额外的碱基会影响蛋白表达吗？ UTR尽可能短一些，特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。在起始密码子ATG 前面可以加一小段（6-9bp）的碱基序列可以增强目的基因的表达，比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。 5、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞？参照文献报道是很简单的办法，也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。 Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞（包括分裂和非分裂细胞），比如肝、肌肉、神经组织等。但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞，比如乳腺癌、白血病细胞等，感染效率较低。 6、腺病毒载体在体外实验（in vitro）中应注意哪些问题？ 1）由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。 2）在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。避免在消化细胞后立刻感染病毒，因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。培养过夜后再感染病毒，效果较好。 3）选择适当的转导MOI（病毒感染单位数/细胞数），可以在MOI为0.1~1000范围内进行试验( 10倍比稀释)。 4）感染病毒时细胞培养液的体积尽量小一些，以完全覆盖细胞为准。如24孔板可用200ul，6孔板1ml。 5）感染时间为90分钟，每15分钟轻轻晃动培养液一次，以混匀。 6）选择适当表达检测时间，一般感染病毒24h后就能检测到目的基因的表达，48小时表达达到较高水平。 7、用于体内试验的腺病毒，是否要求纯化？是的，病毒纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内，会

高中生物病毒相关知识总结

高中生物病毒相关知识总结一、病毒共性：病毒没有细胞结构，只有蛋白质外壳和内部的遗传物质（DNA或RNA）构成，必需寄生在活细胞体内。所以获取更多的病毒应该用它所能寄生的活细胞进行培养，不能用培养基进行培养。病毒增殖时只有把内部的遗传物质注入到宿主细胞内，蛋白质外壳没有进入细胞，然后利用注入的病毒遗传物质的信息合成病毒的蛋白质外壳及复制其自身的遗传物质，而后把蛋白质外壳与新复制的遗传物质组装成新的病毒，在这过程中用到合成蛋白质和遗传物质的原料、酶、细胞器都来自病毒所寄生的宿主细胞。二、病毒分类： 1、根据其寄生的细胞分：植物病毒、动物病毒、细菌病毒（也称噬菌体） 2、根据其遗传物质分（病毒只含有DNA和RNA中的一种核酸）：DNA病毒（如T2噬菌体，天花病毒）、 RNA病毒（如HIV、烟草花叶病毒，SARS 病毒、流感病毒）三、病毒地位：有细胞结构的生物，因其必须寄生在活细胞体内，所以不属于生命系统的结构层次，生命系统最低的结构层次是细胞。由病毒的结构可以知道，病毒只有1种核酸——4种核苷酸——1种的五碳糖和4种的含氮碱基。四、课本中病毒应用实例：

1、运用放射性同位素标记法完成T2噬菌体侵染细菌的实验，验证DNA是遗传物质的结论。 2、从烟草花叶病毒中提取的蛋白质和RNA，只有提取的RNA可以使烟草感染病毒的实验，得到RNA是烟草花叶病毒遗传物质的结论。（所有细胞生物都有DNA和RNA两种核酸，但只有DNA是遗传物质，只有少数病毒的遗传物质是RNA，所以说DNA是主要的遗传物质） 3、在免疫调节中，如果病毒作为病原体侵入到靶细胞中，除了需要细胞免疫外还要有体液免疫参与，因为细胞免疫只会暴露病原体。 4、基因工程中除了质粒作为运载体外，病毒也可以作为运载体。

腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册目录第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广

腺病毒的包装和感染PDF

腺病毒的包装，纯化和感染技术背景：Adeasy系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、高效的病毒载体。利用带有E1基因的293细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并通过CsCl梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100％的感染效率。但需要指出的是Adeasy同样具有所有病毒载体或转染试剂都不可避免的细胞毒性问题。所需试剂： ●293细胞； ●重组好的腺病毒质粒； ●Pac I限制性内切酶； ●质粒回收相关试剂； ●细胞培养、转染相关试剂； ●TBS：10mM Tris,0.9%NaCl,pH8.1; ●40%CsCl：28.45g CsCl溶于42.7ml的TBS中，4度保存； ●15%CsCl：9.085g CsCl溶于47.69ml的TBS中，4度保存； ●Beckman离心管：14*89mm，SW41转头； ●Polybrene(sigma)，10mg/ml； ●透析袋：Spectrum Co.（成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属）， MW=8000~14400； ●灭菌甘油。操作流程： 1.293细胞（E1-transformed human embryonic kidney cells在转染前24小时接种于1或2个60mm培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70%； 2.在转染前，用Pac I处理目的质粒（一般一个60mm细胞盘需要6μg DNA）。处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20μl无菌水中； 3.用PEI或其他转染试剂将6μg Pac I处理过的质粒转染细胞；

病毒有关知识点复习总结

高中生物病毒有关知识点归纳病毒是一类非细胞结构的生物。由于它的结构与高等动植物及其他生物完全不同，所以生物学家在分类时将它作为特殊的一类，单独列为病毒界。在高中生物学以及高考中也经常涉及有关病毒的知识点及考点。一、大小发现史：19世纪,伊万诺夫斯基在研究烟草花叶病的病因时，推想这种病是由细菌引起的。他将患花叶病的烟草榨出汁液，用能将细菌滤去的过滤器进行过滤，再用过滤后的汁液去感染正常的烟叶，结果发现正常的烟叶还能患病。发现问题：提出假说：设计实验：（加法、减法）得出结论：这表明烟草花叶病是由比细菌还小的病原体引起的，他把这种病原体叫做"滤过性病毒"。病毒形体极其微小，必须在电子显微镜下才能观察到，一般可以通过细菌滤器(一般的直径为1-10μm，而多数病毒的直径在100 nm左右)。二、成分和结构 1、成分病毒没有细胞结构，主要成分仅为核酸和蛋白质两种。核酸位于病毒粒子的中心，构成了它的核心或基因组，蛋白质包围在核心周围，构成病毒粒子的衣壳。衣壳对核酸有保护作用，是病毒粒子的抗原成分。它们共同称为核衣壳，是任何病毒(指“真病毒”)所必需的基本结构。有些较复杂的病毒，在其核衣壳外还有一层囊膜包被。 2、结构衣壳：蛋白质髓部：DNA或RNA 特殊包膜刺突每一种病毒只含有一种核酸，不是DNA就是RNA，这也是病毒分类的依据之一。如DNA病毒有：噬菌体、疱疹病毒、各种腺病毒等。RNA病毒有：艾滋病毒、烟草花叶病毒、车前草病毒等。三、生活方式 1、生活方式病毒在宿主的活细胞内寄生生活。离开宿主细胞，病毒能以无生命的化学大分子状态存在，并可形成结晶不同的病毒只能寄生在特定的宿主细胞内，具有专一性，这也是病毒分类的另一个重要依据。如专门寄生在动物细胞中的称为动物病毒(艾滋病毒等)，专门寄生在植物细胞中的称为植物病毒(烟草花叶病毒等)，专门寄生在细菌细胞中的称为细菌病毒(噬菌体)。噬菌体的繁殖一般可分为五个阶段：即吸附一侵入→增殖(复制与生物合成)→成熟(装配)→裂解(释放)。整个过程必须在它的宿主活细胞中完成。只有核酸进入宿主细胞，换言之，只提供了复制和表达的模板，其他的原料、能量、酶、

腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10

5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对

人腺病毒分子生物学常用检测技术

Advances in Microbiology 微生物前沿, 2017, 6(2), 11-16 Published Online June 2017 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/872745022.html,/journal/amb https://https://www.wendangku.net/doc/872745022.html,/10.12677/amb.2017.62002 The Molecular Biological Techniques for Human Adenovirus Detection Ye Li1,2, Tuo Dong1,2, Vladimir I. Zlobin3, Oleg Reva4, Zhangyi Qu1,2* 1Department of Microbiology, School of Public Health, Harbin Medical University, Harbin Heilongjiang 2Department of Natural-Foci Diseases, Institute of Environment-Associated Diseases, Sino-Russia Joint Medical Research Centre, Harbin Heilongjiang 3Research Institute for Biomedical Technologies, Irkutsk State Medical University, Irkutsk, Russia 4Department of Biochemistry, Bioinformatics and Computational Biology Unit, University of Pretoria, Pretoria, South Africa Received: May 12th, 2017; accepted: May 30th, 2017; published: Jun. 2nd, 2017 Abstract Adenovirus is one of the major viruses causing human respiratory diseases. The effective and rapid method in adenovirus detection is helpful to strengthen the surveillance of adenovirus in-fection, to investigate the epidemic trends timely, and to control the virus infection. The current molecular biological methods for adenovirus detection both used in laboratory and clinical are reviewed in this paper. The principle, characteristics and application of these techniques are commented. Keywords Adenovirus, PCR, Molecular Biological Detection 人腺病毒分子生物学常用检测技术李烨1,2，董妥1,2，Vladimir I. Zlobin3，Oleg Reva4，曲章义1,2* 1哈尔滨医科大学，公共卫生学院，卫生微生物学教研室，黑龙江哈尔滨 2中俄医学研究中心，环境相关疾病研究所，自然疫源性疾病研究室，黑龙江哈尔滨 3俄罗斯伊尔库茨克国立医科大学，生物医学技术研究所，伊尔库茨克，俄罗斯 4南非比勒陀利亚大学，生物信息学与计算生物学部，生物化学系，比勒陀利亚，南非收稿日期：2017年5月12日；录用日期：2017年5月30日；发布日期：2017年6月2日 *通讯作者。文章引用: 李烨, 董妥, Vladimir I. Zlobin, Oleg Reva, 曲章义. 人腺病毒分子生物学常用检测技术[J]. 微生物前沿,2017,

腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10

5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清

腺病毒和腺相关病毒有哪些区别

腺病毒和腺相关病毒有哪些区别？腺病毒和腺相关病毒（AAV）是用于基因传递的两种不同类型的病毒载体。这两个重组病毒系统都具有感染广泛宿主的能力，包括分裂和非分裂细胞，而无需与宿主基因组整合。它们两之间有几个主要区别：包装能力、水平，基因表达的起效和持续时间以及免疫应答。腺病毒简介腺病毒有约8.5千碱基的容量，具有高水平的蛋白质表达和瞬时基因表达。表达的发作时间可早于感染后16-24小时。腺病毒系统的局限性主要在于靶细胞的高免疫应答。尽管如此，由于它们对大多数组织有高效转导作用，仍被广泛用于研究中。腺病毒不能整合至宿主基因组，仅能瞬时表达。它可以对分裂期及非分裂期细胞进行感染。其包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为1011-1012TU/mL，片段越大，滴度越低，表达水平还是比较高的。腺病毒优势宿主范围广：能够感染分裂期细胞与静止期细胞；对上皮细胞有高度嗜性，尤其适用于感染原代细胞、悬浮细胞等难转染细胞类型感染效率高：优于其他病毒载体和转染系统的高感染能力，能达到近100%的效率包装容量大：最高可插入7.5 kb的外源片段表达水平高：1-2d即开始高水平表达安全系数高：去除病毒蛋白编码序列，降低细胞毒性和免疫反应；双质粒转染系统，生物安全性高无整合风险：无插入致突变性腺相关病毒简介 AAV的包装容量约为4.5千碱基，蛋白质表达水平相对较低，有长效基因表达的潜力。 AAV的趋向性也可以通过不同的血清型增强。 AAV的主要缺点是其对目的基因的包装容量较小，并且表达起效较晚（体外2-7天，体内3-21天），然而，该传递系统所产生的免疫应答水平却非常低。腺相关病毒可以稳定整合至宿主基因组，并且可以在特定基因产物存在的条件下整合至人类19号染色体中的特定位点。它能对分裂期及非分裂期细胞进行感染。其包装片段至多8 kb，浓缩滴度至多为1011-1013TU/mL，片段越大，滴度越低。腺相关病毒可以应用Tet-on等诱导表达系统，表达水平也是比较高的。腺相关病毒优势

关于慢病毒感染的相关知识总结..

慢病毒使用操作手册一、慢病毒的储存与稀释: 1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口） ①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 ②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。 2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞。慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。慢病毒感染目的细胞预实验 1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项： ①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。 ②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。 ③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。 2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。第一天，准备细胞：在24孔培养板接种若干孔，每个孔内接种3~5X104个目的细胞，铺板时细胞的融合率为50%左右，每孔培养基体积为100 μl；进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。第二天，准备病毒：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20 秒（使病毒完全悬于离心管底部即可）；如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中，并尽可能保证所获得的含

病毒基本知识

第十二讲网络安全与管理教师：汪洪祥项目4 计算机病毒及防治项目1 双机互连对等网络的组建 2013/11/24 本讲的主要内容：一、项目提出二、项目分析三、相关知识点 1.病毒的定义与特征 2.病毒的分类 3.宏病毒的蠕虫病毒 4.木马 5.反病毒技术 4.1 项目提出有一天，小李在QQ聊天时，收到一位网友发来的信息，如图4-1所示，出于好奇和对网友的信任，小李打开了网友提供的超链接，此时突然弹出一个无法关闭的窗口，提示系统即将在一分钟以后关机，并进入一分钟倒计时状态，如图4-2所示。

小李惊呼上当受骗，那么小李的计算机究竟怎么了？ 4.2 项目分析小李的计算机中了冲击波(Worm.Blaster)病毒。 2002年8月12日，冲击波病毒导致全球范围内数以亿计的计算机中毒，所带来的直接经济损失达数十亿美金。病毒运行时会不停地利用IP扫描技术寻找网络上系统为Windows 2000或XP的计算机，找到后就利用RPC缓冲区漏洞攻击该系统，一旦攻击成功，病毒体将会被传送到对方计算机中进行感染，使系统操作异常、不停重新启动、甚至导致系统崩溃。另外，该病毒还会对Microsoft的一个升级网站进行拒绝服务攻击，导致该网站堵塞，使用户无法通过该网站升级系统。 4.2 项目分析病毒手动清除方法：用DOS系统启动盘启动进入DOS环境下，删除C:\windows\msblast.exe文件；也可安全模式下删除该文件。预防方法：打上RPC漏洞安全补丁。据北京江民新科技术有限公司统计，2011年上半年最为活跃的病毒类型为木马

病毒，其共占据所有病毒数量中60%的比例。其次，分别为蠕虫病毒和后门病毒。这三种类型的病毒共占据所有病毒数量中83%的比例，如图4-3所示，可见目前网民面临的首要威胁仍旧来自于这三种传统的病毒类型。防范计算机病毒等的有效方法是除了及时打上各种安全补丁外，还应安装反病毒工具，并进行合理设置，比较常见的工具有360杀毒软件、360安全卫士等。 6 4.3 相关知识点 4.3.1 计算机病毒的概念与特征 1. 计算机病毒的定义计算机病毒在《中华人民共和国计算机信息系统安全保护条例》中被明确定义，病毒指“编制者在计算机程序中插入的破坏计算机功能或者破坏数据，影响计算机使用并且能够自我复制的一组计算机指令或者程序代码”。 4.3 相关知识点 2 计算机病毒的特征 ①传染性。计算机病毒会通过各种媒介从已被感染的计算机扩散到未被感染的计算机。这些媒介可以是程序、文件、存储介质、网络等。 ②隐蔽性。不经过程序代码分析或计算机病毒代码扫描，计算机病毒程序与正常程序是不容易区分的。在没有防护措施的情况下，计算机病毒程序一经运行并取得系统控制权后，可以迅速感染给其他程序，而在此过程中屏幕上可能没有任何异常显示。这种现象就是计算机病毒传染的隐蔽性。 ③潜伏性。病毒具有依附其他媒介寄生的能力，它可以在磁盘、光盘或其他介质上潜伏几天，甚至几年。不满足其触发条件时，除了感染其他文件以外不做破坏；触发条件一旦得到满足，病毒就四处繁殖、扩散、破坏。 ④触发性。计算机病毒发作往往需要一个触发条件，其可能利用计算机系统时钟、病毒体自带计数器、计算机内执行的某些特定操作等。如CIH病毒在每年4月26日发作，而一些邮件病毒在打开附件时发作。 4.3 相关知识点 ⑤破坏性。当触发条件满足时，病毒在被感染的计算机上开始发作。根据计算机病毒的危害性不同，病毒发作时表现出来的症状和破坏性可能有很大差别。从显

MicroRNA腺病毒表达系统使用手册0828

产品手册│ MirAd TM MicroRNA前体腺病毒表达系统本产品仅限用于研究，严禁用于任何动物或人类疾病诊断。本产品仅供购买方内部研究使用，未经ViGene生物科技有限公司书面许可，严禁转售。

目录│ 产品简介 4 产品组成 5 保存条件 5 使用安全注意事项 6 pMirAd 载体图谱 6 质粒扩增 6 病毒载体扩增 7 常见问题解答 8

产品有限责任担保 Vigene生物保证您收到的产品符合产品目录上的规格。本担保规定了Vigene 更换产品的责任。Vigene生物不提供其他任何形式的对于产品商业或健康用途的保证。Vigene生物不对任何由于使用或不正确使用本公司产品造成的直接、间接的、衍生的或偶然的损害所产生的后果负责。产品订购和技术支持山东维真生物科技有限公司暨美国ViGene Biosciences公司中国办事处美国地址：12111 Parklawn Dr. Rockville, MD 20852 US 北京办事处：北京市海淀区北三环西路43号青云里满庭芳园D座1206室上海办事处：上海市徐汇区肇家浜路201弄11号602室广州办事处：广州市天河区骏景花园骏景路棋乐街33号404室山东办事处：济南市高新区开拓路2350号留学人员创业园717室 Email: service@https://www.wendangku.net/doc/872745022.html, Phone: 400-077-2566 https://www.wendangku.net/doc/872745022.html,(美国) https://www.wendangku.net/doc/872745022.html,（中国）欢迎您致电或发邮件，咨询产品技术信息。

产品简介 MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。MiRNAs来源于具有60-80个核苷酸茎环结构的microRNA前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。 ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。第二，病毒滴度高。第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。 pMir-microRNA precursor是基于microRNA前体表达系统的质粒。microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。MicroRNA前体在CMV启动子启动下表达，其上游有GFP荧光标记，并具有SV40 poly（A）加尾信号。穿梭载体含有SV40启动子启动的puromycin嘌呤霉素标记，可以用来进行稳转细胞株的筛选。穿梭载体还含有两个腺病毒ITR序列和两个与腺病毒Ad5同源的序列，可

慢病毒生产及使用操作手册

慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。三、包装细胞293T细胞的培养（一）293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。

腺病毒的一些常见问题及解答

汇总了腺病毒的一些常见问题及解答！ 1.目前，对于基因治疗的载体选择，很难有一个统一的结论，文章也很多，我将在如下给出。本人认为，无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。无论是采用IN VIVO 或者EX VIVO的方法，因为我们最终的目的是要在局部表达我的目的基因，并且使其具有一定的作用。而对于载体的副作用，目前较为公认的就是病毒载体转染效率高，但副作用大；质粒载体毒性小，但转染效率比较低。同时，对于目前所常用的一些带有报告基因的表达载体如BD公司所开发的系列载体，pEGFP、pDsRed、pEYFP和pECFP等：这些载体如果用于细胞水平的检测，也许会更加

的方便、直观，但是，如果用于体内的基因治疗，那就不是一个理想的载体了。而传统的表达载体如INVITROGEN公司（)的pCDNA载体系列，会更好一些。同时，为了获得更加高效的表达，一些公司也开发出了具有信号肽的表达载体，以增加外源基因的分泌表达。正如一个疾病的治疗一样，治疗的方法越多，就证明还没有一个最有效地治疗手段。基因治疗的载体也是同样，很难说哪个载体具有高转染、高表达、低毒性的全部优点。以上是本人的一点愚见，还请各位同道指正。

2.转染过小鼠肝癌细胞H22，请赐教：用什么方法可以达到最佳效果，脂质体、电转还是重组病毒？如果用脂质体，哪家的最好？ H22细胞为悬浮细胞，用病毒（逆转录病毒和腺病毒）最为理想，一是转染效率高，二是不用筛选直接用于实验。但逆转录病毒的转染效率并不能达到100%，且影响因素多，而腺病毒感染效率高，几乎可达100%，但只能短期表达（7－10天），随着细胞传代，外源基因会逐渐丢失。当然，H22也可用脂质体进行转染，筛选应在96孔板上进行，由于培养液少、细胞相对静止，两周后可见细胞克隆生长，在倒置显微镜下用吸管吸取克隆，进行扩大培养。

腺相关病毒知识(汇编)

第一节AAV病毒的生活周期腺病毒伴随病毒（adeno-associated virus, AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成员之一。这一家族成员是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4. 7~6kb之间的线状单链DNA基因组。从昆虫到人类都已分离到微小病毒。AAV病毒属于依赖性病毒类（De pendovirus），最初是在纯化的腺病毒液中发现的一种污染成分（Atchinson et al. 1965）, 顾而得名。从鸟类到许多哺乳动物包括人的体内都分离到各种血清型的AAV病毒。大多数成年人都感染过AAV病毒，但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。在多数情况下，AAV在培养的正常细胞中不发生产毒性感染，只有在有辅助病毒包括腺病毒或疱疹病毒共同感染时才发生产毒性感染（Hoggan et al. 1966; Buller et al. 1981）。因此，AAV病毒长期以来被认为是一种缺陷性病毒。进一步的研究发现AAV病毒并非缺陷性病毒，而是在正常细胞中偏向于建立潜伏感染,仅在宿主细胞受到刺激时才被诱发进行感染性增殖。 AAV的生活周期有两种不同的胞内期。在无辅助病毒存在时，AAV病毒颗粒进入细胞，脱衣壳后AAV的调节蛋白发生有限的表达，并抑制病毒基因的进一步表达和病毒DNA的复制。这种负调节作用的结果是促进病毒基因组整合到宿主的基因组中建立潜伏感染。 AAV病毒偏向于整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置（Kotin et al. 1990,1991,1992; Samulski et al. 1993）。研究被AAV病毒潜伏感染的细胞发现，AAV对细胞表型往往有微弱影响，并影响细胞对刺激的反应能力（Yalkinoglu et al. 1988; Yakobson et al. 1987,1989; Bantel-Schaal et al. 1992, 1991）。AAV生活周期的另一种胞内期是产毒性感染，往往在有辅助病毒（腺病毒或疱疹病毒）感染时发生。辅助病毒的感染可以在AAV感染之前、同时或之后进行。腺病毒（Ad）和单纯疱疹病毒（HSV）中与辅助功能有关的基因都已确定。腺病毒中参与提供辅助功能的基因包括E1a, E1b, E2a, E4和VA RNA（Muzyczka 1 992），但不包括与腺病毒DNA复制直接相关的E2b基因产物（DNA聚合酶和末端酶）。1型单纯疱疹病毒（HSV-1）提供辅助功能的情形则有些不同,不仅涉及与HSV病毒基因调节有关的基因包括ICP0和ICP4，还需要HSV病毒DNA复制的所必需的基因产物包括HSV螺旋酶－引物酶复合物（UL5，UL8，UL52）和主要DNA结合蛋白UL29的参与（Weindler F et al. 1991）。这种在辅助功能方面的不同可能反映了腺病毒感染和疱疹病毒感染期间对宿主DNA合成机制的不同影响。目前的关于AAV工作模式有以下要点：（1）AAV是一种生活周期以潜伏感染为主的病毒；（2）通过潜伏感染, 病毒基因组得以同细胞共存；（3）只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；（4）如果细胞受到刺激，细胞内环境发生改变而表达应激基因；（5）导致细胞应激反应基因表达的调节状况也使得AAV基因表达，从而使AAV病毒复制；（6）产生子代病毒并释放，又感染新的正常宿主细胞，建立新的潜伏状态。用某些可损伤基因的因素如紫外线照射、γ射线照射、各种化学致癌剂或某些代谢抑制剂处理某种类型的哺乳动物细胞，可使之在无辅助病毒存在的情况下能够发生AAV产毒性感染。虽然这种情形比有辅助病毒存在时每个细胞产生AAV病毒的量要低几个数量级，但上述实验提示AAV病毒并不是一种缺陷性病毒，而是一种强烈偏向于潜伏的病毒。返回标题第二节AAV病毒的基因组结构和功能人2型腺病毒伴随病毒（AAV-2）的基因组为4681 个核苷酸的单链DNA，全部序列已测定。正链和负链DN A均可被包装到AAV病毒颗粒中。AAV-2基因组的结构如图3-1所示。基因组的两末端为145bp的倒转末端重复序列（inverted terminal repeat, ITR）。ITR序列之间为AAV病毒的编码区，左侧的ORF编码4种Re p蛋白；右侧的ORF编码3种Cap蛋白。

慢病毒转染手册

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。慢病毒载体