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精编(医疗药品)药理学实验方法

（医疗药品）药理学

实验方法

第一章现代药理学实验方法与技术简介

第一节分子生物学试验方法与技术

分子生物技术在药理学实验中应用较为广泛，包括核酸分子探针的标记、核酸分子杂交、多聚酶链反应、蛋白印迹杂交技术、cDNA文库、随机分子库技术、外核基因在真核细胞中的表达、转基因动物、人类基因治疗等。现将更为常用的技术介绍如下：

一、核酸分子探针的标记标记核酸分子探针（nucleicacidprobe）是进行核杂交的基础，根据核酸分子探针的来源及性质进行选择，选择的基本原则是具有高度的特异性，探针选择直接影响杂交结果的分析。根据检测对象和目的不同，，可选择不同的探针种类及标记方法。

㈠探针种类

1．基因组DNA探针是克隆化的各种基因片断，也是最常用的核酸探针，探针应尽可能选用基因编码（外显子），避免使用内含子及其它非编码序列。

2．cDNA探针与mRNA互补的DNA链称cDNA，是一种较为理想的核酸探针，特异性较高。

3．RNA探针RNA与RNA或DNA杂交体的探针稳定性，特异性高。

4．寡核苷酸探针人工合成寡核苷酸片段做探针，可根据需要合成相应序列。

㈡标记物

常用的探针标记物有两类：放射性同位素和非放射性同位素。标记物的检测具有高度灵敏性和特异性。标记和探针结合不影响杂交的特异性和稳定性。其中放射性同位素是应用最多的探针标记物，但易造成放射性污染，多数同位素的半衰期短，不能长期存放。常用的放射性同位素有32P?3P?35S，有时也用14C,125I或131I。

二、核酸分子杂交（nucleicacidhybridiazation）是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定的条件下，按碱基互补配对原则形成异质双链的过程。核酸分子杂交是分子生物学领域应用最广泛的技术，灵敏度高、特异性强，主要用于特异DNA或RNA的定性定量检测。

三、聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法。传统的DNA扩增法是分子克隆法，需经过DNA酶切、链接、转化等步骤构建含有目的基因的载体。然后导入细胞中进行扩增，再用同位素标记的探针进行筛选，操作复杂，耗时。PCR技术灵敏度高，特异性强，操作简便。PCR是本世纪分子生物学研究领域中最重要的发明之一。

四、cDNA文库是指以mRNA为模板，在反转录酶的作用下形成的互补DNA（plementaryDNA,cDNA）。cDNA文库是指一群含重组DNA细菌或嗜菌体克隆。每一个克隆只含一种mRNA的信息，足够数目克隆的总

和则含细胞的全部mRNA信息，此种克隆群体叫cDNA文库。

五．随机分子库技术（randommoleculerlibrary）采用不同技术手段和在不同的分子水平有效地实现分子的多样性。其技术路线，一是利用化学合成的方法生成已知结构的化合物，以某种特定方式和一定规律组合在一起，只要确定某一化合物具有活性，即可根据建库的组合方式确定其结构，围绕此技术发展的随机分子库总称为化学合成库（syntheticchemicallibrary）。二是利用基因工程方法直接合成的DNA或RNA的核酸库（nucleicacidlibrary）,由DNA随即编码表达的小分子和大分子的混合群体而表达物的表面显露又提供了可从庞大的复杂的群体中快速筛选到目的物，这就是近几年发展起来的极富有应用潜力的核酸编码分子肽库（oligonucleotide-encodedpeptidelibrary）。

六．真核基因的表达调控技术真核细胞具有比原核细胞更为庞大的和复杂的基因组。高等真核细胞基因组编码成千上万个基因，基因内遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程，即基因表达过程受不同层次调节机制精密调控，此调控既决定着基因表达的量，又决定基因表达的时空顺序。调控过程精密复杂，涉及到转录前染色质的活化；转录水平的调节；转录后的加工；翻译水平的调节及翻译后的修饰等。基因表达的调控主要发生在转录水平。

七．转基因动物是用实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。此种方法可建立转基因动物模型，以研究

外源基因在整体动物中的表达调控率；能改变动物基因使其表现更符合人类需要；也可用转基因动物产生人类所需要的生物活性物质。

第二节细胞生物学实验方法与技术

细胞生物学是生命科学中的重要分支，它以生命基本单位细胞为研究对象，应用近代物理、化学和实验生物学方法，从显微、亚显微和分子水平来揭示细胞生命活动及规律，其中包括细胞的生长、发育、分裂、分化、遗传、变异（包括癌变）、兴奋、运动、代谢、衰老与死亡等基本生命现象，并且利用与调控细胞的行为活动，已达到为生产实践尤其为医药卫生事业服务。当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几种：1）真核细胞基因结构及其表达调控；2）细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3）细胞生长、分化、衰老、癌变、死亡，尤其是程序性细胞死亡的研究；4)细胞工程，包括基因工程及体细胞核移植的研究。

一、细胞培养常用方法

1、细胞原代培养（primayculture）又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，表现出来源组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单，细胞也

较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。

2、细胞的传代培养当细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传代或再次培养，目的是借此繁殖更多的细胞，另一方面是防止细胞的退化死亡。

二、器官培养方法

器官培养（organculture）是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体外存活，幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构，用于观察组织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。

器官培养方法很多，最经典的方法即表玻皿器官培养法；一种最常用的方法是不锈钢金属网格法及Wolff培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。

三、放射自显影术测定

放射自显影术（autoradiography）是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。现已可将放射自显影术与电镜以及生物

分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变，目前已在生命科学各领域被广泛应用。

四、染色体分析技术

染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗传物质经碱性染料着色后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入分裂期时，染色质细丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的染色体。特别是在分裂中期，复制后的染色体达到最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1）为临床诊断提供新手段；2）研究不育和习惯性流产发生的遗传基础；3)通过检查胎儿的染色体，预防有染色体异常患儿出生（先天愚型）；4）根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究；结合DNA 重组技术可以将基因定位于染色体的具体区带上。

五、电镜技术

早在1940年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜，但因分辨率低无实用价值。1965年英国剑桥科学仪器有限公司开始生产出商品扫描电镜，其以显著优点广泛用于生物学、医学、物理学、化学、电子学及勘探、冶金、国防、公安、机械与轻工业等诸多领域，并已成为非常有用的研究工具。

电镜主要特点：1）景深大，较光学显微镜大几百倍；2）图像富有立

体感，是一个具有真实感的三维结构立体图象；3）图像放大范围大，光学显微镜有效放大倍数为1000倍左右，透视电镜的放大倍数为几百倍至100万倍，扫描电镜可放大十几倍至几十万倍；4）分辨率高，扫描电镜可达6－3nm；5）样品可在三度空间平移和旋转，聚焦后可以任意放大倍数，而不需调整重新聚焦。

六、细胞、细胞器、及细胞间质的分离技术、

1、细胞的分离分离不同的细胞及亚细胞组分在现代生物学研究中起着重要的作用。如研究某种药物治疗白血病的机理，需要分离培养人或动物的骨髓细胞，观察药物的细胞作用；研究与细胞生长分化有关的生长因子的作用，需将与此类因子有关的细胞分离出来；分离细胞膜，线粒体等细胞的亚组分，对于研究信号传递，某些遗传疾病，也都是必不可少的手段。

2、细胞膜的分离细胞内的膜系统与细胞质膜统称为生物膜（biomembrane）,他们都有共同结构和特征。首先要分离出形状完整的、具有生物活性的、高纯度的细胞膜，用于研究细胞膜的结构和功能，以利于观察膜在细胞与环境进行能量交换及信息传递的过程。

3、细胞核的分离细胞核作为一个功能单位，完整的保存遗传物质，幷指导RNA合成，后者为蛋白质及其它细胞组分合成所必需。因此细胞核分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，用分级离心或超声波处理等方法进行纯化。

4、溶酶体的分离溶酶体是处理细胞吞噬物的细胞器，含有高浓度的各种水解酶类，调控细胞内的消化过程。溶酶体的分离常用于研究因溶酶体功能缺陷而引起的多种疾病。

5、线粒体的分离线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需要的能量，主要由在线粒体内进行氧化所产生的能量供给。制备线粒体关键是保持其完整性及高纯度。

6、细胞DNA、RNA分离与纯化核酸是遗传信息及基因表达的物质基础。核酸的提取与纯化关键是保持核酸的完整性，但较困难，主要因为：一是细胞内有活性很高的核糖核酸酶；二是酸碱等化学因素；三是高温机械损伤等物理因素，需严格遵守操作规程。

七、细胞凋亡研究方法

细胞凋亡(apoptosis),又称为程序性死亡（programmedcelldeath,PCD）指的是有核细胞在一定条件下，通过激活其自身内部机制，尤其是开启与关闭某些基因以及内源性DNA内切酶活化，导致产生细胞自然性死亡的过程。可以认为细胞死亡的这种方式是一种生理性的自发过程。为此有人也称其为细胞自杀。

目前认为程序性死亡几乎和细胞的增殖同样重要，如果没有细胞凋亡，个体不能形成与存活，或者发生疾病。只有通过细胞凋亡的发生，使特定细胞群体在特定的时间和特定的部位死亡。从而使机体在总体上保障其细胞数

量，以及形态与功能的平衡。近年来如何用药物诱导癌细胞死亡也成为细胞凋亡的热点之一。透视电镜观察是研究细胞凋亡的首选方法。

八、原位杂交

原位杂交技术是将分子杂交与组织化学相结合，用标记的DNA或RNA 为探针，在原位检测组织细胞内特异互补的DNA或RNA序列。它分为三类：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA。已广泛用于生物学的各个领域。原位DNA末端标记可以用于细胞凋亡的定量研究。原位杂交技术和PCR 技术结合用于检测人乳头瘤病毒（HPV）

九、单克隆抗体

是1975年被描述的一种可产生无限量，并可预测其性质的抗体制备技术。该技术的关键步骤在于淋巴细胞之间的融合，所以称为“淋巴细胞杂交瘤技术”；由于杂交瘤经过筛选可产生针对单一抗原决定簇抗体的细胞克隆，故称为单克隆抗体技术。该技术的问世使得免疫学研究与实践发生了革命性的改观，同时还为生物学和医药学的许多领域提供了前所未有的研究工具。人们利用其可精确地识别出极为复杂的分子，测定出无法测定的物质，识别出新的细胞群体，揭示了以往未曾了解的细胞分化途径，为肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等的诊断和治疗创造出令人兴奋的前景。

十、神经细胞培养神经细胞培养是指从体内取出某一种神经组织，在无菌、适当温度和一定营养条件下模拟在体生理环境，使之存活和生长，幷

保持其结构和功能。

神经细胞培养按培养前切割程度分为器官培养、组织快培养和细胞分离培养。

1、器官培养（organculture）是切割最少型的培养。全器官或器官大片放在保温的营养液中可保存数日。这类培养切断了正常的血供，器官的营养交换取决于简单的灌流。

2、组织块培养（explantculture）是真正最小器官培养。组织块通常厚度为0.5－1mm，一个或几个组织块放在一个培养皿内存活数周。实验在其组织块周围生长出的边缘细胞上进行。

3、细胞分离培养（dissciatedcellculture）是由分散其原始组织至其组成的细胞。常用酶进行消化。

第三节信息传递的研究方法与技术

一、受体与配基结合试验技术

受体与配基结合试验是一种在体外直接观察受体的实验手段。随着各种高比活度的特异性受体配基的合成，此方法已成为药理学的基本技术之一，幷广泛用于生理、生化、细胞生物等许多相关学科。

二、G蛋白的纯化分离技术

G蛋白是细胞膜上一类结构和功能都非常相似的蛋白质。其主要功能是偶联受体及其效应器。受体与激动剂结合并被激活时，先激活其相应的G

蛋白，然后G蛋白再与相应的效应器（酶离子通道等）发生反应，改变效应器的活性。与G蛋白偶联的受体种类繁多，受G蛋白调控的效应器包括腺苷酸环化酶，磷脂酶C，cGMP磷酸二酯酶，离子通道等。因此，G蛋白的研究对阐明跨膜信息传递机理有非常重要的意义。

三、环核苷酸测定技术

环核苷酸是重要的细胞内信使物质，参与调控各种激素、神经递质和调质所导致的各种细胞生命活动。常用的测定方法有：cAMP蛋白质竞争结合法；cGMP放射免疫测定技术；腺苷酸环化酶测定技术等。

四、花生四烯酸代谢产物测定技术

细胞内磷脂、甘油三酯及胆固醇经酰基水解酶的作用释放出花生四烯酸（arachidonicacid,AA）。而AA通过环加氧酶和脂加氧酶途径分别代谢转化为一系列活性物质，如前列腺素、前列环素、血栓素、白三烯等。这些物质在体内含量少，但有极强的生物活性。能调节多种系统（神经、内分泌、消化、呼吸、生殖、血液、心血管、肾等）,并在炎症、免疫、过敏、凝血、肿瘤和心血管等一系列的病理过程中发挥作用而具有重要的临床意义。常用的检测方法：生物测定法、高效液相测定法、放射免疫分析法、酶免疫测定法、放免配基受体结合法。

五、肌醇磷脂及其代谢产物的测定技术

肌醇磷脂是细胞膜中的一种脂质，能被磷脂酶C水解生成三种重要的

细胞内信使物质，都已成为药理学和生物化学等学科中研究的热点。常用实验方法有：肌醇磷脂的测定、磷酸肌醇的分离及测定、甘油二酯的测定、同位素标记测定肌醇磷脂等。

六、蛋白激酶C的纯化和测定

蛋白激酶C是一种普遍存在于生物体内的磷脂依赖的激酶家族。在细胞的信息传递和生长调节中起到重要作用。蛋白激酶C参与多种激素、神经递质及生长因子调控过程。测定蛋白激酶C活性及纯化该酶成为跨膜信息传递研究的重要技术。

七、离体器官受体生物测定

使用某些离体器官进行受体激动剂、拮抗剂的生物检定，是一项目前仍在广泛应用的经典的药理学方法。可以测定药物对受体的亲和力，对特定亚型的选择，能决定药物是激动剂还是拮抗剂，并能分析药物与受体的构效关系，反映的是药物在器官水平上的作用，因此，与细胞或分子水平上的实验结果可以互相印证，有其不可替代的意义。

第四节钙研究方法与技术简介

钙是人体内极其重要的金属离子，广泛存在于细胞和体液中。它在细胞活动乃至生命过程和疾病的发生、发展中扮演重要角色，已成为化学、生物学、基础和临床医学及其它许多科学研究的一个重要领域。

一、细胞内游离钙研究方法与技术

（一）钙指示剂

钙指示剂是近十多年来发展起来的一类离子指示剂，也称离子探针或染料，已成为观察细胞内游离离子浓度及其动态变化和空间分布极有价值的工具。目前常用钙指示剂根据其物理特性一般可分为两类

1、钙荧光指示剂：是指在一定波长的激发光照射下，钙指示剂复合物可发出荧光。属于此类的指示剂有Fura-

2、Quin-2、Fiuo-

3、Indo-1等。

2、光吸收指示剂：是指它们与钙离子结合后，其吸收光谱峰值随Ca2+——指示剂复合物浓度的不同而变化，据此便可观察细胞内游离钙的动态变化并测定细胞内钙浓度。属于此类指示剂的有Purpuratediaceticacid(PDAA)、AntipyrylazoⅢ等。光吸收指示剂一般属于低钙亲和力指示剂。

（二）双波长荧光分光光度计测定方法

应用双波长荧光分光光度法不仅可以检测细胞悬液，单层培养细胞及单个细胞内游离钙浓度的变化，也可以测定细胞内瞬间平均钙浓度的变化及亚细胞水平钙离子的梯度分布等。各种细胞测定方法差异在于标本的制备过程，其余步骤基本相同。基本方法为制备标本的细胞悬液，加入荧光指示剂，用双光束荧光分光光度计测定荧光。测定条件：激发光光栅5nm，发射光光栅10nm，以300-420nm扫描激发光谱，然后固定激发波长在高峰波长，观察不同实验条件下荧光强度的变化，由公式计算游离钙浓度。

二、钙结合蛋白的研究方法

钙结合蛋白的研究方法包括钙调素的纯化及测定、钙调素的表达与突变的研究方法、钙调素结合蛋白检测方法及钙依赖性磷脂结合蛋白的研究方法。

三、细胞内钙释放研究方法

1、放射性标记法测定钙释放：

将分离的内质网或线粒体囊胞用放射性标记的钙离子负载，负载后的囊胞置于一滤器上，通过过滤与负载液分离。在滤器中加入各种促钙释放介质后，定时测定滤器中残留的放射活性即可推断内钙释放情况。

2、三磷酸肌醇刺激内钙释放的研究方法

制备细胞或细胞器悬液，加入钙离子荧光指示剂负载，再加入一定浓度的三磷酸肌醇（IP3）刺激内钙释放，观察荧光强度的变化即可反应钙释放情况。

四、钙离子受体测定方法

从牛或人甲状旁腺细胞的cDNA文库中筛选出编码钙离子受体的cDNA，将其mRNA注入爪蟾卵细胞，使其表达，在细胞膜上形成具有天然活性的钙离子受体。当细胞培养液中存在一定浓度的钙或其它阳离子时，激活钙受体，使胞内钙离子浓度增加，打开氯离子通道，测定氯离子通道电流的变化，便可用于筛选钙离子受体激动剂或拮抗剂。

第五节放射配体受体结合实验方法与技术

一、基本概念

1、受体（receptor）一类介导细胞信号转导的功能蛋白质，可与周围环境中微量化学物质发生特异性结合，通过信息放大系统，触发后续的生理或药理效应。

2、配体（ligand）能与受体特异结合的物质，如神经递质、药物或激素等。

3、判断受体的标准真正的受体必须具备：饱和性、特异性、可逆性、高亲和性、结构专一性、立体选择性、区域分布性、亚细胞或分子特征、有内源性配体等。

4、受体的基本分类化学门控离子通道受体；G蛋白耦联受体。

5、受体调节的方式

1）共价调节（covalentmodification）尤其是蛋白磷酸化反应在受体的脱敏过程中起了非常重要的调节作用。以乙酰胆碱受体为例，细胞内c AMP 升高所引起的蛋白磷酸化可使乙酰胆碱受体对乙酰胆碱的脱敏速度增加8～10倍。

2）非共价调节（non-covalentmodification）影响受体功能的非共价调节机制包括①膜电位的变化；②机械性改变受体的分布（斑片钳技术）；

③受体和其他膜蛋白（如G蛋白）或某些小配体（阴离子，阳离子，核苷

酸）之间的变构影响；④膜脂质环境的改变等。

3）协同性调节（coordinateregulation）已知不同受体可含有同源受体区如胰岛素受体和上皮生长因子-抗溃疡素受体中的酪氨酸激酶区。由此可推测一种受体被激活后可能通过一共同密码（code）来调节同一细胞上的其他许多受体。

4）链锁反应（receptorcascades）另外一种可能的调控机制，即一个受体被激活之后，可能会释放一种细胞外信使，激活第二个细胞表面受体。称之为放大性的链锁反应。

二、放射配体结合法的应用领域

1、阐明药物作用机制；

2、新药设计和药物筛选；

3、探讨疾病的病因、发病机理，提高临床合理用药和诊断水平；

4、测定组织或血液中药物浓度；

5、探寻新的受体、受体亚型和内源性配体。

三、放射受体结合实验技术简介

1、放射配体的选择需要非常高的选择性，并要求与靶受体有很高的亲和性，解离常数最好小于10nmol/L，还要考虑配体的生物学以及生物化学特征。拮抗剂性配体必须能阻断激动剂与靶受体结合引起的生物学效应。放射性受体结合试验中，最常用的放射性同位素是氚，[3H]配体的主要优点是氚化过程不影响配体的生物活性，使用较安全，其信号必须用闪烁技术加以放大。放射配体的另一个重要特性是特异性结合与非特异性结合的比率，理

想的配体应有不少于99%的特异性结合。

2、组织的选择和制备用于放射受体结合试验的理想的组织应含有高密度的靶受体和低密度的与配体非特异结合的受体。用于放射受体结合试验的组织可取自脑、外周组织、天然表达或移植受体的细胞株等。

3、缓冲液最常用的缓冲液是50mmol/L，PH为7.4的Tris-Cl的缓冲液；重碳酸盐、磷酸盐和HEPES缓冲液亦可用于结合试验。

4、非特异性结合的测定非特异性结合的测定原理是加入大量的对靶受体具有药理活性的并可使受体饱和的非放射性配体。特异性结合量是指配体与靶受体结合量，可由总结合量中减去非特异性结合量求出。

5、孵育条件结合实验应该用能产生最大特异结合和适宜的孵育条件。需要经过大量的实验才可摸索出最佳的测定条件。

6、放射配体-受体复合体与游离放射配体的分离

最常用的最有效的分离方法是过滤，结合试验中最常用的滤纸是玻璃纤维滤纸。通常用2～5ml冷缓冲液冲洗2～3次就足够了。过滤完成后，滤纸置于盛有闪烁液的闪烁瓶中进行液闪测定。当放射配体解离较快时，可用离心的方法将放射配体-受体复合物从游离配体中分离出来。其它方法还有：凝胶过滤色谱法、凝胶过滤透析术、免疫沉淀法等。

第六节免疫药理学实验方法与技术简介免疫药理学是介于免疫学和药理学间的边缘学科，主要研究药物对机体免

疫系统和免疫功能的作用及其机制，为某些疾病药物治疗提供理论基础。

免疫药理学方法一般是采用体外的试管内研究和体内的整体研究相结合，体外试验研究可澄清药物对免疫应答某一特定环节如T细胞增殖、细胞因子等产生的具体影响，而整体研究则可探讨药物对抗原介导的的免疫应答、正常的体液免疫及细胞免疫功能、同种异体移植排斥反应、异常免疫应答如超敏反应和自身免疫病以及初次及再次免疫应答等的影响。在未来免疫药理学的研究领域中，基因工程、基因治疗、细胞因子治疗以及其它各种生物治疗的研究和应用将是研究的热点和前沿区域。

一、免疫细胞的分离与纯化

体内外的免疫药理学实验研究都需要从动物或人的血液或淋巴组织中分离免疫细胞，获得高纯度的免疫细胞是进行本研究的最基本的前提条件。

外周血中白细胞的分离常用自然沉降法和高分子聚合物沉降法；外周血单个核细胞（peripheralmononuclearcells，PMNC）分离多采用密度梯度离心法。

从淋巴组织中分离淋巴细胞悬液---制备脾细胞悬液、淋巴结细胞悬液、胸腺细胞悬液。

淋巴细胞的分离纯化包括：①分离PMNC中的淋巴细胞和巨噬细胞常用方法有玻璃粘附法、磁铁吸引法、羰基铁乳胶分层液法、补体溶解法及葡聚糖凝胶过滤法等。②T细胞、B细胞及T细胞亚群的分离纯化常用技术：E花结

分离法、Percoll非连续性密度梯度离心分离法、洗淘法（panning）、补体细胞毒法、尼龙毛分离法、磁性激活细胞分离器（magneticactivatedcellsorter，MACS）分离技术及流式细胞术（flowcytometry，FCM）。

二、药物对免疫系统功能影响的实验技术简介

1、对免疫细胞表面抗原分子的影响对细胞表面的CD （clusterofdifferentiation，分化簇）抗原的检测与分析可通过细胞毒法、葡萄菌体蛋白A法、免疫细胞化学法和免疫荧光染色分析法等，借助流式细胞仪进行的免疫荧光染色分析法使该项技术的标准化、定量化和自动化水平大大提高，体内外药理试验均可采用之。

2、对免疫细胞功能的影响常用：3H-TdR掺入试验、固相抗CD3单克隆抗体诱导细胞增殖的检测、混合淋巴细胞反应、抗原刺激的T细胞增殖反应、预激淋巴细胞对抗原的增殖反应等。

3、淋巴细胞功能的体内实验小鼠接触性超敏反应、移植物抗宿主反应（graft-versus-hostdisease，GVHD）、迟发性超敏反应（delayed-typehypersensitivity，DTH）、体内检测T H细胞活性。

4、对B细胞影响的体内外实验血清中IgG、IgA、IgM的测定（单向免疫扩散法、散射比浊法）；抗体生成细胞检测（溶血空斑试验、溶血分光光度法）。

5、对单核巨噬细胞功能的影响实验巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、白色念

(整理)《药理学》实验讲义.

《药理学》实验讲义

实验一药理学实验的基本知识和基本技术一、目的 1. 掌握基本操作，锻炼动手、动脑能力； 2. 更好地掌握药理学基本理论知识； 3. 培养科学思维二、基本要求 1. 实验前：预习实验内容并复习相关理论知识； 2. 实验时 ⑴实验器材要妥善保管； ⑵实验操作按步骤进行，仔细观察实验中出现的现象，实事求是地做好记录； ⑶注意节约实验药品； ⑷维持良好的课堂纪律。 3. 实验后 ⑴各组同学将实验动物处死，实验台擦干净，将实验方盘送回准备室； ⑵值日生搞好实验室卫生，将死亡动物送至指定场所； ⑶书写实验报告。三、实验报告的书写 1. 题目 2. 目的 3. 原理 4. 材料：实验动物，器材，药品 5. 方法：用自己的语言简单扼要描述出来； 6. 结果：要求真实、清楚； 7. 讨论：将实验结果进行比较、分析；实验中有哪些不足之处；结果异常或失败的原因； 8. 结论：将实验结果进行归纳总结，应带有提示性质。四、药理学实验实验设计原则 1.随机原则按照机遇均等的原则进行分组。其目的是使一切干扰因素造成的实验误差减少，而不受实验者主观因素或其他偏性误差的影响。 2.对照原则空白对照（指在不加任何处理的条件下进行观察对照）；阴性对照也称假处理对照（给予生理盐水或不含药物的溶媒）；阳性对照也称标准对照（指以已知经典药物在标准条件下与实验药进行对照）。 3.重复原则能在类似的条件下，把实验结果重复出来，才能算是可靠的实验，重复实验除增加可靠性外，也可以了解实验变异情况。五、实验动物

1. 动物的选择（1）小白鼠：适用于需大量动物的实验，如某些药物的筛选，半数致死量的测定。也较适用于避孕药实验、抗炎镇痛药实验、中枢神经系统药实验、抗肿瘤药及抗衰老药实验等。（2）大白鼠：比较适用于抗炎药物实验，血压测定、利胆、利尿药实验，也可用于进行亚急性和慢性毒性实验。（3）豚鼠：因其对组胺敏感，并易于致敏，故常被选用于抗过敏药、平喘药和抗组胺药的实验。也常用于离体心脏、心房、肠管实验。又因它对结核敏感，常用于抗结核病药的实验。（4）家兔：常用于观察研究脑电生理作用，药物对小肠的作用。由于家兔体温变化敏感，也常用于体温实验，用于热原检查。（5）狗：狗是记录血压，呼吸最常用的大动物。还可利用狗做成胃瘘、肠瘘，以观察药物对胃肠蠕动和分泌的影响。在进行慢性毒性实验时，也常采用狗。2. 实验动物的编号狗、兔等较大的动物可用特制的铝质号码牌固定在颈部或耳上。大鼠、小鼠如为白色可用黄色苦味酸在不同的体表标志上标记。 3. 动物固定及给药（1）小鼠捉拿小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。在一些特殊的实验中，如进行尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定，如尾静脉注射架或专用小鼠固定筒。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作，如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。（2）小鼠灌胃用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力,此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为3～4cm，大鼠或豚鼠为4～6cm。常用灌胃量小鼠为0.2～1ml,大鼠1～4ml,豚鼠1～5ml。（3）小鼠腹腔注射先将动物固定,腹部用酒精棉球擦试消毒，然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进约0.5 厘米，再使针头与皮肤呈45 度角方向穿过腹肌刺入腹腔，此时有落空感，回抽无肠液、尿液后，缓缓推入药液。此法大小鼠用的较多。（4）皮下注射注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入,固定后

药理学实验方案

元胡止痛片对小鼠镇痛抗炎镇痛活性研究 ——药理实验设计设计人：级药学一班张礼杰 515010 信盼 515024 陈茂琴 515026 何朵朵 515028 药学四班杨森 515101 冯禹 515110 王同月 515102

元胡止痛片中抗炎和镇痛作用研究 1.实验目的：探讨元胡止痛片的镇痛和抗炎作用 2.实验原理：（1）元胡止痛片收载于《元胡止痛片收载于《中国药典》是由元胡、白芷两味药组成的中药复方制剂为行气活血止痛剂临床用于治疗气滞血瘀胃痛、胁痛、头痛及月经痛等症疗效确切。本实验是为验证元胡止痛片的镇痛和抗炎作用进行验证。实验对四川禾邦阳光制药厂家生产元胡止痛片不同剂量进行了药效学研究采用小鼠醋酸扭体法、小鼠热板法和耳肿胀法实验分别测定小鼠扭体反应抑制率、小鼠痛阂值提高率和肿胀率从而确定不同剂量的镇痛和抗炎作用效果。在基础医学研究中筛选镇痛药的常见致痛方法概括有物理法（热、电、机械）和化学法。动物的疼痛反应常表现出嘶叫、舔足、翘尾、蹦跳及皮肤、肌肉抽搐。化学法，即将某些化学物质，如强酸、强碱、钾离子、缓激肽等，涂布于动物的的某些敏感部位或腹腔注射。腹腔注射损伤物质引起受试动物腹痛，动物表现出“扭体反应”（即腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起）。 3.实验方法 :使用小鼠热板法、醋酸扭体法、耳肿胀法 ,并分别建立小鼠疼痛和炎症模型 ,灌胃给予不同剂量元胡止痛片配成的溶液，观察对动物的镇痛和抗炎作用。 4.实验过程： 1.内容

4.1 药品与试剂元胡止痛片：四川禾邦阳光制药股份有限公司，国药准字z51021658，规格：片芯重0.25g,12片阿司匹林: 浙江金华市第三制药厂, 国药准字: H13023716, 临用前用蒸馏水配制为适当浓度的混悬液。 4.2动物：健康昆明种小白鼠，雌性，32只 4.3 器材：数控超级恒温槽，烧杯、1ml 注射器、电子秤 4.4分组：空白对照组 (灌胃0.9%生理盐水 10 mL/kg) 元胡止痛片高、低剂量组 (0.2，0.4mg ／10g) 阳性药阿司匹林对照组 (灌胃阿司匹林 0. 4 g/kg) 4.5人和动物剂量换算公式小白鼠=20 0026 .0?人/g 2 方法（1）热板法 1.动物筛选：致痛潜伏期 (痛阈值)为 5~30s 之间的合格雌性小鼠。32只，热板法镇痛试验筛选痛阈值合格的小鼠，取♀小鼠于给药前先用热板仪于55 ± 0． 5 ℃分别测定每只小鼠的正常痛阈值［将小鼠放于智能热板仪上至出现舔后足的所需时间作为痛阈值( s) ，连续 2 次，间隔30 s ，测定平均值即为正常痛阈值］。将舔后足时间＜ 5 s 或＞30 s ，或跳跃者不用于此实验

药理学实验方法

第一章现代药理学实验方法与技术简介第一节分子生物学试验方法与技术分子生物技术在药理学实验中应用较为广泛，包括核酸分子探针的标记、核酸分子杂交、多聚酶链反应、蛋白印迹杂交技术、cDNA文库、随机分子库技术、外核基因在真核细胞中的表达、转基因动物、人类基因治疗等。现将更为常用的技术介绍如下：一、核酸分子探针的标记标记核酸分子探针（nucleic acid probe）是进行核杂交的基础，根据核酸分子探针的来源及性质进行选择，选择的基本原则是具有高度的特异性，探针选择直接影响杂交结果的分析。根据检测对象和目的不同，，可选择不同的探针种类及标记方法。㈠探针种类 1．基因组DNA探针是克隆化的各种基因片断，也是最常用的核酸探针，探针应尽可能选用基因编码（外显子），避免使用内含子及其它非编码序列。 2．cDNA探针与mRNA互补的DNA链称cDNA，是一种较为理想的核酸探针，特异性较高。 3．RNA探针RNA与RNA或DNA杂交体的探针稳定性，特异性高。 4．寡核苷酸探针人工合成寡核苷酸片段做探针，可根据需要合成相应序列。㈡标记物常用的探针标记物有两类：放射性同位素和非放射性同位素。标记物的检测具有高度灵敏性和特异性。标记和探针结合不影响杂交的特异性和稳定性。其中放射性同位素是应用最多的探针标记物，但易造成放射性污染，多数同位素的半衰期短，不能长期存放。常用的放射性同位素有32P?3P?35S，有时也用14C,125I或131I。二、核酸分子杂交（nucleic acid hybridiazation ）是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定的条件下，按碱基互补配对原则形成异质双链的过程。核酸分子杂交是分子生物学领域应用最广泛的技术，灵敏度高、特异性强，主要用于特异DNA或RNA的定性定量检测。三、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外酶促扩增特异DNA片段的方法。传统的DNA扩增法是分子克隆法，需经过DNA 酶切、链接、转化等步骤构建含有目的基因的载体。然后导入细胞中进行扩增，再用同位素标记的探针进行筛选，操作复杂，耗时。PCR技术灵敏度

《药理学实验》教学大纲

西南科技大学本科实践教学大纲《药理学实验》教学大纲【课程编号】17315272 【英文名称】Experiments of Pharmacology 【课程学时】16 【适用专业】制药工程一、本实验课程的教学目的和要求药理学实验是与药理学理论教学密切的重要实践环节。以药理学实验的基本知识、技术和方法为基础，结合不同作用类别的药物，使学生掌握药理学实验的基本知识，掌握药理学实验的基本技能，验证药理学中的基本理论，牢固掌握药理学的基本概念；了解在药物发现和评价过程中，药理学研究的内容和必要性。通过药理学实验，使学生了解获得药理学知识的科学途径，同时培养学生实践操作、互助协作、独立思考、综合分析和解决问题能力，体验科学研究的基本程序，全面提高学生的综合素质。二、本实验课程与其它课程的关系药理学实验是对《药理学》和《生理学》理论课程教学的补充和完善，同时有利于《生物化学》的理论知识中的有关部分的理解。三、实验课程理论教学内容安排本实验课程不安排理论教学内容四、实验内容安排实验一、药理学实验的基本知识和基本技术

生命科学与工程学院【目的要求】熟悉药理学实验的基本技术；能掌握药理学实验的基本知识和基本技术【内容】药理学实验基本知识；实验动物的捉拿和固定方法；实验动物标记方法；实验动物给药方法。实验动物取血方法；实验动物处死方法。【方法】理论讲授结合实际操作实验二、不同途径、不同剂型、不同剂量的阿托品对药物作用的影响【目的要求】学习不同途径、不同剂型、不同剂量对药物作用的影响；了解不同给药途径及同一药物不同剂型对药物吸收的影响及特点。通过实验比较不同途径给予阿托品的药效学有何不同。通过实验比较不同剂型、不同剂量的阿托品的作用。实验动物为健康昆明种小鼠（雌雄不拘）。【内容】1 介绍静脉注射及静脉滴注、肌肉注射、皮下注射、动脉注射、锥管注射、腹腔注射、胃肠道给药、舌下给药及黏膜给药、直肠给药、吸入给药、透皮给药等途径的药物吸收特点。 2 介绍药物制剂对药物作用影响 3 结合理论进行实验观察 4 根据结果讨论剂型及途径与药物效应的关系。【方法】静脉注射、胃肠道给药等方法实验三、水杨酸钠血药浓度及血浆半衰期测定【目的要求】了解药物血浆半衰期的意义。掌握分光光度法测定水杨酸钠血药浓度，并根据血药浓度计算半衰期的方法。【内容】1 讲授分光光度法测定药物浓度的原理和半衰期计算方法。 2 分组进行家兔取血、给药、测定等实验过程。 3 根据实测结果计算半衰期。 4 讨论半衰期的临床意义。【方法】家兔灌胃给药、家兔静脉取血、分光光度法测定水杨酸钠血药浓度实验四、传出神经系统药物对家兔血压的影响【目的要求】学习家兔固定、麻醉、气管插管、动脉插管、血压记录；【内容】1 分组完成家兔固定、麻醉、气管插管、动脉插管、血压记录等过程。 2 根据实验讲义依次给药、观察结果。 3 总结【方法】动脉插管法实验五、镇痛药实验及统计学分析【目的要求】学习镇痛药的实验方法；掌握实验性疼痛的诱导方法，观察各类镇痛药的作用。根据实验结果，运用统计学原理进行结果分析，从而理解各类镇痛药的作用特点并初步掌握统计学在药理学实验中的应用。【内容】1 介绍统计学基本概念及实验注意事项。 2 分组进行实验操作和观察。 3 以班为单位统计各组实验结果，在教师指导下进行统计学处理分析。 4 根据统计学结果得出结论并理解不同类型镇痛药的镇痛效果。【方法】光电法实验六、子宫兴奋药及实验【目的要求】学习掌握子宫兴奋药的作用特点和临床应用【内容】介绍平滑肌实验装置、分组进行实验、总结实验结果

药理学设计性实验

药理学设计性实验实验一、石菖蒲的镇静作用【目的】 1应用小动物自主活动学习镇静药物的实验方法。 2、应用小动物自主活动仪，研究地西泮、石菖蒲对小鼠自发活动的影响。【原理】小动物自主活动仪的原理：在活动箱内，将一束或几束光线照射到对侧光电感应器上，动物在箱内每活动一次，感应电流发生改变，经过放大装置，使电脉冲驱使继电器启动, 通过记录器记录动物活动次数。地西泮是镇静催眠的代表药。石菖蒲具有宁心安神作用，其挥发油对中枢有广泛的抑制作用。本实验以小鼠自发活动次数为指标，观察药物的镇静作用。【动物】小鼠6只，实验前禁食12h o 【药品】0.05%地西泮溶液，石菖蒲水煎液，生理盐水【主要器材】动物自主活动仪1台，电子称1台，1ml注射器2支，烧杯2杯。【方法】将6只动物随机分为甲乙丙组，甲组灌胃生理盐水，乙组灌胃石菖蒲水煎液(连续两天)，丙组灌胃地西泮1次，0.2ml/10。给药后1小时各组动物放入小动物自主仪，先适应2分钟，再记录5分钟内小鼠自主活动次数。【结果】地西泮、石菖蒲对小鼠自主活动的影响。(结果见表1) 表1地西泮、石菖蒲对小鼠自主活动的影响参考文献： [1] 胡锦官，顾健，王志旺?石菖蒲及其有效成分对神经系统作用的药理研究[J].中药药药理与临床.1999.15 (30: 19 [2] 刘新民.石菖蒲的研究现状J].中医药研究.1992. (4): 57 [3] 吴启端，吴清和，石菖蒲的药理学研究进展[J].2006,17 (6) :477-480 实验二、石菖蒲对记忆障碍小鼠模型的改善作用【目的】 1、学习小鼠跳台原理和操作，正确运用跳台实验仪器对小鼠进行学习记忆能力行为学测试。 2、观察石菖蒲对小鼠记忆获得障碍的疗效作用。【原理】鼠跳台实验装置由DT-200小鼠跳台测试箱和DT-200小鼠跳台测试仪组成。测试箱由6个小房间构成，一次可同时试验6只动物，每个小房间有一橡皮台，箱底是可通电的铜栅，在训练期通电小鼠跳下平台在箱底不断被电击，这个过程中小鼠获得记忆，24 h后测试时观察小鼠第一次跳下平台的时间和 5 min内跳下平台的次数，比较各组老鼠记忆保持的能力。戊巴比妥钠能造成小鼠学习记忆障碍。石菖蒲具有开窍醒神，宁心安神的作用，能够促进学习记忆。本实验以小鼠跳下潜伏期及5min内错误次数作为指标，观察药物对小鼠学习

药理学复习

药理名词解释 1.中药药理学:是在中医理论指导下，运用现代药理学方法研究中药与机体相互作用及规律的科学。 2.中药药动学:研究中药及其化学成分在人体的吸收、分布、代谢和排泄过程及特点。 3.中药药效学：用现代科学的理论和方法，研究和揭示中药药理作用产生的机理和物质基础。 4.不良反应:是指在正常用量用法下，机体产生的与治疗目的无关的反应。 5.双向调节作用：中药具有双向作用，表现为同一种中药可产生相反的药理作用。 6.适应原样作用：是指某些补虚药能增强机体的适应性，增强机体对物理、化学和生物等各种有害刺激损伤的非特异性的抵抗力，使紊乱的功能恢复正常。 7.中药四性: 所谓四性，又称四气，就是指寒、凉、温、热四种药性。 8.双相调节:指某些药物可使两种极端的病理现象向正常的方向转化. 药理大题 1、是否可以把清热解毒药与抗生素完全等同？答：不可以。因为目前还没有在实验研究中得到证实有哪一个清热解毒药的体外抗菌作用强度与抗生素相似。但是，有的清热解毒药虽然没有较强的体内外抗菌作用，但在临床上对许多感染性疾病有很好的疗效。目前认为，清热解毒药的抗菌作用与其调节机体的功能有关，是其它药理作用（对免疫功能的影响、解热、抗炎等）的综合作用的结果，其药理作用比抗生素要广泛。 2.柴胡“疏肝解郁”功效的药理学基础是什么？答：柴胡“疏肝解郁”功效的药理基础是其具有明显的保肝、降脂和利胆作用，其保肝作用机理是由于皂甙对生物膜直接保护的结果，也认为是肾上腺分泌糖皮质激素有关，柴胡皂甙可使血浆中促肾上腺皮质激素增加，进而使皮质甾醇含量升高，因此认为柴胡皂甙有

《药理学实验》课程教学活动大纲

《药理学实验》课程教学大纲（执笔人：尹艳艳审核人：周兰兰教学院长：陈志武）一、课程简介（一）课程代码：（二）课程名称（含英文名称）：药理学实验（pharmacology experiments）（三）课程类别：专业基础课（四）修读对象：药学专业（五）总学时与学分：其中实验54学时，3学分。（六）相关课程：药理学（七）内容提要本课程涵盖了药理学部分的模拟实验及经典实验项目，以大量的实验尤其是动物实验为基础，复制疾病动物模型，研究用药后的生物体功能活动变化及其规律，以巩固药理学及相关基础理论知识，进一步强化实验操作技术，提高动手能力，培养分析问题和解决问题的能力。二、教学目的和教学方法（一）教学目的 1．加强学生的药理学基本理论、基本知识和基本技能的训练，培养理论联系实际和独立开展科学研究的能力。药理学实验可以帮助学生验证药理学理论知识，巩固和加强对药理学理论的掌握；促进学生对药理学一些抽象概念的理解；了解药理学研究的一些基本方法，培养学生药理学实验设计和科研能力；初步掌握药物研究的基本技能，并且通过科研模拟实验加强学生的创新思维能力的培养。

2.药理学实验主要以学生在教师指导下自己动手操作为主，少量示教实验为辅，并且配合课堂讨论和多媒体等方法，达到既验证理论，巩固和加强药理学理论知识学习的目的，又要做到培养学生科研能力和创新思维的开发。（二）教学方法采用课堂讲授、现场指导、模拟实验、双语教学、自主设计、病例讨论和课外训练等多种教学手段相结合的教学方法。三、实践教学学时分配四、选用教材和主要教学参考书

1.陈志武,董六一,《药理学实验指导》,中国协和医科大学出版社,2013年10月 2.孔德虎，《医学机能学实验教程》，科学出版社，2009年2月。五、实验教学内容实验一、动物捉拿及各种药方法（录像）主要讲授内容：介绍动物捉拿及各种给药方法教学时数：3学时重点与难点： 1.小鼠、大鼠和家兔的捉拿方法。 2.小鼠、大鼠和家兔常见的给药方法实验二、小鼠戊巴比妥钠LD50和ED50的测定主要讲授内容：ED50及LD50的概念，其测定方法和小鼠腹腔注射的方法教学时数：4学时重点与难点： 1.小鼠腹腔注射的方法。 2.LD50和ED50的计算方法。思考题或练习题： 1. 半数有效量（ED50）和半数致死量（LD50）测定的目的意义如何？ 2. 药物的剂量与药物作用有何关系？ 3. 治疗指数和安全范围之间有何联系？实验三、吗啡的镇痛作用（小鼠热板法和小鼠扭体法）主要讲授内容： 1.镇痛药物的热板实验方法测定，观察镇痛药的镇痛作用，熟练掌握小鼠皮下注射的方法； 2.镇痛药物的扭体实验方法测定，观察镇痛药的镇痛作用，熟练掌握小鼠腹腔注射的

药理学实验教程资料

药理学实验教程（中、英文版）主编叶春玲钟玲暨暨南南大大学学药药学学院院药药理理教教研研室室 22000077年年55月月

药理学实验教程目目录录第一篇药理学实验基本知识第一章药理学实验须知一、药理学实验课的目的和要求二、实验结果的整理和实验报告的撰写第二章药理学实验设计的基本知识一、实验设计的基本原则二、药理实验设计中的剂量问题三、药理实验设计中的预试问题第三章药理学实验的统计处理原则一、计量资料的统计分析二、计数资料的统计分析三、药效和剂量依赖关系（相关性）的统计分析四、两药药效的等效性分析第四章常用实验动物的基本操作一、实验动物的选择及捉拿固定二、实验动物的编号三、实验动物的给药方法四、实验动物的麻醉和取血第五章药理学实验常用仪器操作技术 BL-410生物机能实验系统第六章药物剂型与处方学一、药物剂型二、处方学第二篇药理学总论实验第一章药动学实验实验一磺胺类药物静脉给药后的药时曲线实验二磺胺类药物非血管内给药后的药时曲线实验三 3P87 计算药物动力学参数

实验四磺胺类药物在体内的分布实验五磺胺嘧啶的血浆蛋白结合率测定实验六磺胺类药物在麻醉大鼠体内经胆汁和尿排泄的实验第二章药效学总论实验实验一不同给药途径对药物作用的影响实验二肝功能状态对药物作用的影响实验三量效关系曲线和有关药效学参数测定第三章安全性试验实验一药物急性半数致死量（LD50）的测定实验二最大耐受量（MTD）测定第三篇药理学各论实验第一章传出神经系统药物实验实验一药物对麻醉动物血压的影响实验二药物对麻醉动物血流动力学的影响实验三药物对离体兔主动脉环的作用第二章中枢神经系统药物实验实验一药物对小鼠自发活动的影响实验二药物对益智作用的影响实验三抗癫痫药和抗惊厥实验实验四镇痛药实验第三章心血管系统药物实验实验一利多卡因对哇巴因诱发心律失常的拮抗作用实验二强心苷对家兔在体衰竭心脏的作用实验三药物对垂体后叶素所致的急性心肌缺血心电图变化的影响第四章内脏系统药物实验实验一呋塞米对小鼠尿量及电解质的影响实验二药物对组胺诱发豚鼠哮喘的作用实验三药物对大鼠的利胆作用第五章激素类及抗炎药物实验实验一糖皮质激素对毛细血管通透性的影响

药理学实验的基本知识和基本技术

药理学实验的基本知识和基本技术一、实验动物的种类选择药理学实验常用的动物有小白鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猫、犬、蛙、蟾蜍等。常根据实验目的和要求选用不同的实验动物。由于不同的动物具有不同的特点，故所选用的动物应能较好地反映试验药物的选择性作用，并符合节约的原则。小白鼠：系实验室最常用的一种动物。易于大量繁殖，且价廉，适用需要大量动物的实验，如药物筛选、半数致死量测定、药物效价比较、抗感染、抗肿瘤药物及避孕药物的研究等。大白鼠：与小白鼠相似。一些在小白鼠身上不便进行的实验可选用大白鼠，如药物抗炎作用的实验常选用大白鼠踝关节制备关节炎的模型。此外也可用大白鼠直接记录血压、作胆管插管，或用大白鼠观察药物的亚急性或慢性毒性。大白鼠的血压和人相近，且稳定，现常用于抗高血压药物实验。豚鼠：是实验室常用动物之一。对组织胺很敏感，容易致敏，常用于平喘药和抗组胺药的实验。对结核菌亦敏感，故也用于抗结核药的研究。此外还用于离体心脏及平滑肌实验，其乳头肌和心房常用于电生理特性及心肌细胞动作电位实验，研究抗心律失常药物的机理。家兔：温顺、易饲养，常用于观察药物对心脏、呼吸的影响及农药中毒和解救的实验。亦用于研究药物对中枢神经系统的作用、体温实验、热原检查及避孕药实验。猫：与家兔比较，猫对外科手术的耐受性强，血压较稳定，故常用于血压实验。但价格较贵。此外，猫也常用于心血管药物及中枢神经系统药物的研究。犬：药理实验需大动物时常用犬。常用于观察药物对心脏泵功能和血流动力学的影响，心肌细胞电生理研究，降压药及抗休克药的研究等。犬还可以通过训练，用于慢性实验研究，如条件反射、高血压的实验治疗、胃肠蠕动和分泌实验、慢性毒性实验。蛙和蟾蜍离体心脏能较持久地有节律地搏动，常用于观察药物对心脏的作用；坐骨神经和腓肠肌标本可用来观察药物对周围神经、神经肌肉或横纹肌的作用；蛙的腹直肌还可以用于鉴定胆碱能药物的作用。须注意：由于动物对外界刺激的反应存在个体差异，在选择实验动物时，还应注意动物的年龄、体重、性别、生理状态、健康状况及其品系、等级等因素对实验的影响。二、实验动物的编号

药理实验方法学重点

一．1.首过效应：口服给药后，药物在到达体循环之前，经肠道、肠壁和肝脏的代谢分解使进入生物体内的相对药量降低。2，判断方法：尾静脉给药AUC和门静脉给药AUC—比较判断肝首过—是—尾静脉》门静脉;门静脉给药和十二指肠给药AUC—比较判断肠首过—是—门静脉》十二指肠十二指肠和灌胃给药AUC—比较判断胃首过—是—十二指肠AUC》灌胃AUC 二．简述肾外包扎性高血压模型制备的基本原理和注意事项?答：原理：肾外异物包扎，可致肾周围炎，肾外形成一层纤维性鞘膜，压迫肾实质，造成肾组织缺血，使肾素形成增加，进而使血管紧张素含量增加，血压上升。属肾性高血压模型。注意事项：1)肾外包扎材料除自制双层孔胶薄膜和玻璃纸外，还可用绸布、乳胶、火棉胶等材料。肾外包扎应足够紧，但不能勒破组织。2) 如果要制造2肾1扎型，则一侧肾包扎后无需切除另一侧肾，术后3~6个月10%~20%动物形成高血压；如果要制造2肾2扎型，则一侧肾包扎后同法包扎另一侧肾，术后3~4周70%以上动物形成高血压。三、（一）佐剂性关节炎1.大鼠AA的制备：选用雄性Lewis、Wistar或SD大鼠，体重200g左右，将每鼠右后足趾皮内注射完全弗氏佐剂（CFA）0.1ml致炎。CFA是将卡介苗或死结合分枝杆菌加入已经高压灭菌的液体石蜡中，浓度为10mg/ml。原发病变主要表现为早起致炎局部的炎症反应，致炎后18h右后足的肿胀达峰值，持续3d后逐渐减轻，8d后再度肿胀；继发病变一般出现于致炎后10d左右，表现为对侧和前肢的肿胀，耳和尾部出现“关节炎”小结，变应性角膜翳以及体重下降等等。2.小鼠AA 的制备：选用雄性C57BL/6小鼠，8周龄，4%氟烷吸入麻醉，左侧胫-跗关节皮下两点皮下注射100ulCFA，CFA浓度为5ug/ul，对照组同方法注射液状石蜡。造模后22d处死。造模24h 内原发侧关节出现急性肿胀，第9天肿胀较严重。模型组穿格子数和活动度明显降低。造模后小鼠对于机械异常性疼痛和热痛出现明显退缩反应。（二）II型胶原诱导的关节炎 1.小鼠CIA的制备：将鸡或牛II型胶原（CII）溶解于0.01mol/L的醋酸后与同等容积的含有低浓度卡介苗的液体石蜡油（ALCB）充分乳化，CII和ALCB的计量均为4mg/mL.,乳化在冰浴中进行。在小鼠（18g左右）根部多点皮内注射乳化剂0.1ml，第21d在尾根部加强注射。加强注射后，由第三者检查关节炎的发生情况。2.大鼠CIA的制备：CII溶解于0.01mol/L 的醋酸中（CII终浓度为4mg/ml），充分研磨，4度过夜，讲CII溶液滴加至冷的不完全弗氏佐剂（IFA）中，等体积混合，充分乳化。大鼠（体重150g左右）尾根部和背部分多点皮内注射0.1mLCII乳化剂。7d后同法再坚强注射一次。对照组注射0.01mol/L醋酸和IFA的乳化液。从第20d后开始，用组织测量仪测定后足趾的容积。评价指标：足趾肿胀度、全身表现评分、关节肿胀数、关节炎指数、X线评分、关节炎病理评分。四、祛痰药的药理试验方法 1).呼吸道分泌液量测定法小鼠酚红实验法,基本原理：利用酚红小鼠腹腔注射后部分从气道排泄的特点，测定小鼠气道酚红排泄量，以判断受试药对气道通透性和分泌液量的影响.操作步骤：小鼠饥饿16-18h--注射酚红前30min受试药物灌胃--腹腔注射酚红药物，30min 后处死--血凝后，分离气管、气管插管并与注射器相连--用5% NaHco3 0.8ml 洗气管，反复三次--合并洗液，放置，得透明红色上清液，用分光光度计波长545nm比色，根据酚红标准曲线计算出酚红量。注意事项：1.待小鼠体内血液凝固后，再切开颈部，以免血液中酚红影响。2.气道内注入NaHco3溶液后吸出时要轻轻进行，一旦用力过度，肺泡会破裂液体流入胸腔。2)呼吸道纤毛运动实验法---鸽纤毛运动实验法原理：利用气管纤毛运动带动颗粒物从气管内固定的向口腔方向的速度，测定药物祛痰药物，一般测运动2cm所需的时间.操作步骤：鸽气管分离，做2cm的标记---切开气管，将软木屑放在2cm向心端--记录2cm所需时间，观察给药前后0.5h的速度，正常是3-4min。注意事项：鸽气管暴露实验注意温度，等待时颈部用生理盐水湿润纱布防治干燥.3)豚鼠气道黏液黏蛋白的测定.原理：气道黏液主要由杯细胞和黏液性腺细胞产生和分泌，内含黏蛋白，为黏多糖和蛋白质。无机酸存在下，己糖醛酸从黏多糖中释放与咔唑起缩合反应，形成有色物，在530nm比色测定.操作：豚鼠麻醉处死，取气管称重----剪开气管用棉棒取黏液--水洗，离心，取上清液

药理学实验方法

word 药理学实验方法第－讲实验动物的选择在药理学实验中，要根据实验目的，选择不同动物，常用动物有：１、青蛙和蟾蜍心脏（离体、在体）实验, 制备坐骨Ｎ－腓肠标本等。２、小白鼠：药物初筛：镇痛、耐缺氧、抗肿瘤药物、LD５０测定、避孕药实验等。３、大白鼠：抗炎作用，大白鼠踝关节肿胀实验，血压测量，胆管插管等。长期性毒性试验。４、豚鼠：对组胺敏感，并易于致敏，常用抗过敏药（平喘药、抗组胺药）实验。离体心房、心脏、肠管实验等。豚鼠对结核菌也敏感，也用于抗结核病药物实验。 5、兔：家兔易得，驯服，便于静脉注射和灌胃，常用于观察药物对心脏的作用和对CNS 的作用。又由于其体温变化较敏感，也常用于体温实验及热原检查。家兔也常用于避孕药实验。 6、猫：猫的血压比较稳定，具有咳咳嗽反射和呕吐动作。因而常用于心血管药物实验和镇咳药、镇吐药实验。 7、狗：狗的血压比较稳定，常用于降压药、升压药和抗休克药实验。狗比较容易驯服，最适用于慢性实验。手术造瘘（胃、肠）以便观察药物对胃肠蠕动和分泌的影响。此外，长期毒性实验也常用狗来进行。 * 附:给药途径及剂量限制 1. 小白鼠（1）灌畏法:0.1～0.25ml／10g体重。（2）皮下注射：0.1～0.3ml／10g体重。（3）肌肉注射：0.2ml／每侧。（4）腔注射：0.1～0.25ml／10g体重。（5）静脉注射：0.05～0.1ml／10g体重。 1.大白鼠（1）灌畏法:2.0ml／10og体重。<3.0ml/只。（2）腔注射：0.1～0.25ml／10g体重。第二讲实验动物的麻醉和处死一、各种实验动物的麻醉药物和麻醉方法

中药药理学实验说课讲解

中药药理学实验

实验1 附子炮制前后致小白鼠中毒表现的影响（6学时）【目的】观察生附子和制附子致小白鼠的死亡数量，评价炮制对附子毒性的作用。【器材】1ml注射器、鼠笼、天平。【药品】生附子水煎醇沉液（上清液）0.5g/ml、制附子水煎醇沉液（上清液）0.5g/ml。【动物】小鼠，雌雄各半，体重18 ～ 22 g。【方法】小鼠20只，雌雄各半，随机分为2组。按0.2ml/10g腹腔注射给药，第1组给予生附子水煎醇沉液，第2组给予制附子水煎醇沉液。观察并记录30min内各组小鼠死亡情况。【结果】记录生附子水煎醇沉液组与制附子水煎醇沉液组动物死亡数，比较两者毒性的大小。【注意事项】生附子和制附子水煎液制备时均应煎煮4小时以上。【思考题】根据实验结果讨论炮制前后附子毒性作用差异的原因。

实验2 生大黄、制大黄以及大黄、芒硝配伍对小白鼠小肠运动的影响（炭末法）（4学时） [目的]了解生大黄、制大黄对肠蠕动的影响以及大黄与芒硝配伍的药理意义。[原理]利用黑色炭末作为指示剂，观察炭末在肠道的推进距离。口服生大黄可刺激肠蠕动加速，有泻下作用，故对胃肠实热有“釜底抽薪”之功。大黄久煎或炮制之后，致泻成份分解，作用减弱，而芒硝在肠内不易被吸收，使肠内渗透压升高，大量水分保留在肠腔，机械性刺激肠壁而致泻。故生大黄与芒硝配伍有“增水行舟，润燥软坚”之功效，致泻作用增强。 [器材]手术剪、眼科镊、直尺、注射器、灌胃针头、天平，烧杯，搪瓷盘或蛙板。 [药品] 炭末生理盐水混悬液0.1g/m（炭末为活性炭），生大黄水煎液1g/ml(含炭末0.1g/m1)，制大黄水煎液1g/ml(含炭末0.1g/ml，生大黄水煎液加芒硝（生大黄1g/ml+芒硝0.5g/ml+炭末0.1g/m1)，苦味酸。 [动物]小白鼠。 [方法] 取禁食20~24h成年、体重相近的12只小白鼠，随机分为4组，每组3只，用苦味酸标记。分别用上述4种炭末液0.3ml/10g体重灌胃。给药30min后脱颈椎处死，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管，置于托盘上。轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度作为“小肠总长度”。从幽门

药学大实验实验指导药理学部分

药学实验（药理学实验）实验五不同给药途径、给药剂量对药物作用的影响 (一)不同给药途径对药物作用的影响 ?实验目的观察不同给药途径对药物（硫酸镁）作用的影响，了解核酸镁不同给药途径产生不同作用的原因；掌握硫酸镁的作用以及小鼠灌胃、腹腔注射方法 ?实验原理硫酸镁为一种容积性泻药（此外还有刺激性和润滑性泻药），口服在肠道难吸收，在肠内形成高渗压而阻止肠内水分的吸收，从而扩张肠道、刺激肠壁、促进肠道蠕动，产生泻下作用。注射给药可使血中Mg2+增加，由于Ca2+和Mg2+化学结构相似，Ca2+和Mg2+间存在相互拮抗作用，Ca2+参与运动神经末梢Ach释放，而Mg2+拮抗Ca2+这种作用，结果使神经肌肉接头处Ach减少，骨骼肌紧张性降低，肌肉松弛。同时对中枢神经及心血管系统产生抑制作用。因此产生抗惊厥及降压效果。本实验观察不同给药途径对硫酸镁作用性质的影响。大多数药物需进入血液分布到作用部位才能发生作用。药物自给药部位进入全身血液循环的过程为吸收（absorption），吸收速度的快慢及吸收数量的多少直接影响药物的起效时间及强度。其中给药途径是决定药物起效时间及强度的重要因素之一。给药途径不

同，则药物吸收快慢亦不同，其吸收快慢顺序除静脉注射外是：腹腔注射>吸入>舌下>直肠>肌内注射>皮下注射>口服>皮肤。给药途径不同，其吸收程度又不同，由此使药物作用强度不同。药物经不同给药途径所致的吸收程度是：吸入、舌下、直肠、肌内注射较为完全，口服次之，皮下较差；皮肤表面吸收程度最差，一定要脂溶性特别高的药物才能通过此途径较好地吸收。而胃肠道给药，影响因素较多，包括有首关消除的影响等，使药物吸收程度有所不同。首关消除（first pass elimination）：从胃肠道吸收入门静脉系统的药物在到达全身血循环前必先通过肝脏，如果肝脏对其代谢能力很强或由胆汁排泄的量大，则使进入全身血循环内的有效药物量明显减少，这种作用称为首关消除。有的药物在被吸收进入肠壁细胞内而被代谢一部分也属首关消除。首关消除也称首关代谢（first pass metabolism）或首关效应（first pass effect）。注射、舌下和直肠给药可避免肝代谢。 ?实验学时 2学时 ?实验对象小白鼠，体重18-22g，雌雄不限 ?实验器材 1ml注射器2支、小白鼠灌胃针头1个、5号针头1个、250ml烧杯2个 ?药品与试剂

药理学实验的基础知识.doc

第一章药理学实验的基础知识第一节药理学实验的目的和要求药理学实验的目的在于通过循序渐进的常规实验，使学生验证和巩固所学的基木理论；通过综合实验了解较为先进的科研方法和技能，同时培养学生联想及综合分析问题的能力；通过设计性实验，培养学生独立思考、科学思维及创新的能力，建立实事求是、严谨的科学态度，提高解决实际问题的能力，为后续知识的学习和毕业麻的科研工作奠定良好的基础。为了达到上述H的，要求学生做到以下几点。【实验前】 1.仔细阅读实验指导，了解实验目的、原理、要求、方法和操作步骤。 2.结合实验内容，复习有关药理学、生理学、生物化学及免疫学等方面的理论知识，做到充分理解。 3.预测实验屮可能岀现的情况和发生的问题。【实验时】 1.实验器材的放置力求稳当、桀齐、有条不紊。 2.严格按照实验指导上的步骤进行操作，准确计算给药量，节省器材和药品。要注意保护实验动物和标本，避免与实验内容无关的刺激。 3.仔细、耐心地观察实验过程屮岀现的各种现象，实事求是地记录药物出现反丿'V的时间、表现以及最后的转归，联系课堂讲授的内容进行思考。 4.在实验过稈屮遇到疑难之处，先要白己设法解决，如一时解决不了，应向指导教师说明情况，请求教师协助解决。对于贵重仪器，在未熟悉其性能Z前，不可轻易调试。 5.实验室内保持安静、整洁。用药示须用原瓶塞塞好，公丿IJ药品和器材不可随意挪动。【实验后】 1.将实验用器材清洗擦干，清点整理后放到指定位置。如有损坏、缺少，应及时报告老师。将存活和死亡动物分别送至指定处所。 2.认真整理实验记录，经过分析思考，撰写实验报告，按时交给指导老师。 3.做好实验室的清洁一卫生工作。第二节药理学实验设计的基本原则在进行药理学实验时，为保证实验结果的客观性和可信性必须遵循以下基木原则: