土壤硝态氮铵态氮的测定
（二）土壤硝态氮的测定
1、酚二磺酸比色法
1）方法原理
土壤用饱和CaSO4 2H2O溶液浸提，在微碱性条件下蒸发至干，土壤浸提液中的NO3－—N在无水的条件下能与酚二磺酸试剂作用，生成硝基酚二磺酸。
C6H3OH(HSO3)2+HNO3→C6H2OH(HSO3)2 NO2+H2O
2，4-酚二磺酸6-硝基酚-2，4-二磺酸
此反应必须在无水条件下才能迅速完成，反应产物在酸性介质中无色，碱化后则为稳定的黄色溶液，黄色的深浅与NO3－—N含量在一定范围内成正相关，可在400～425nm处（或用蓝色滤光片）比色测定。酚二磺酸法的灵敏度很高，可测出溶液中?L-1 NO3－—N，测定范围为～2mg?L-1。
2）主要仪器
分光光度计、水浴锅、瓷蒸发皿。
3）试剂
（1）酚二磺酸试剂：
称取白色苯酚（C6H5OH，分析纯）置于500mL三角瓶中，以150mL纯浓H2SO4溶解，再加入发烟H2SO475mL并置于沸水中加热2h，可得酚二磺酸溶液，储于棕色瓶中保存。使用时须注意其强烈的腐蚀性。如无发烟H2SO4，可用酚，加浓H2SO4225mL，沸水加热6h配成。试
剂冷后可能析出结晶，用时须重新加热溶解，但不可加水，试剂必须贮于密闭的玻塞棕色瓶中，严防吸湿。
（2）10μg?mL-1 NO3－—N标准溶液：
准确称取KNO3（二级）溶于水，定容1L，此为100μg?mL-1 NO3－—N 溶液，将此液准确稀释10倍，即为10μg?mL-1 NO3－—N标准溶液。（3）CaSO4?2H2O（分析纯、粉状）、
（4）CaCO3（分析纯、粉状）、
（5）1:1 NH4OH、
（6）活性碳（不含NO3－），用以除去有机质的颜色。
（7）Ag2SO4（分析纯、粉状）、Ca(OH)2（分析纯、粉状）和MgCO3（分析纯、粉状），用以消除Cl-1的干扰。
4）操作步骤
（1）浸提：
称取新鲜土样（注1）50g（风干土样25g）放在500mL三角瓶中，加入CaSO4?2H2O （注2）[凝聚剂的作用，使滤液不混浊而澄清]和蒸馏水，盖塞后，用振荡机振荡10min。放置5 min后，将悬液的上部清液用干滤纸过滤，澄清的滤液收集地干燥洁净的三角瓶中。如果滤液因有机质而呈现颜色，可加活性碳除之（注3、4）。还有NO2-干扰和Cl干扰：
（1）同时做空白。
（2）测定
吸取清液 25～50mL（含NO3－—N 20～150μg）于瓷蒸发皿中，加CaCO3约（注5）[调节pH，防止NO3－—N在酸性和中性条件下蒸干分解而损失]，在水浴上蒸干（注6），到达干燥时不应继续加热。稍冷，迅速加入酚二磺酸试剂1---2 mL，将皿旋转，使试剂接触到所有的蒸干物。静止10min使其充分作用后，加水20 mL，用玻璃棒搅拌直到蒸干物完全溶解。冷却后缓缓加入1：1 NH4OH（注7）并不断搅拌混匀，至溶液呈微碱性（溶液显黄色不再加深）再多加2mL，以保证NH4OH试剂过量。然后将溶液全部转入100mL容量瓶中，加水定容（注8）。在分光光度计上用光径1cm比色杯在波长420nm处比色，以空白溶液作参比，调节仪器零点。
（2）同时，NO3－—N工作曲线绘制：分别取10μg?mL-1NO3－—N标准液0、1、2、5、10、15、20mL于蒸发皿中，在水浴上蒸干，与待测液相同操作，进行显色和比色，绘制成标准曲线，或用计算器求出回归方程。
5）结果计算
土壤中NO3－—N含量（mg?kg-1）
=
式中：C(NO3－-N)——从标准曲线上查得（或回归所求）的显色液NO3－-N 质量浓度（μg?mL-1）；
V——显色液的体积（mL）；
ts——分取倍数；
m——风干样品质量，g。
H——风干样品水分质量含量百分数。6）注释
注1．
硝酸根为阴离子，不为土壤胶体吸附，且易溶于水，很易在土壤内部移动，在土壤剖面上下层移动频繁，因此测定硝态氮时注采样深度。即不仅要采集表层土壤，而且要采集心土和底土，采样深度可达40cm、60 cm以至120 cm。试验证明，旱地土壤上分析全剖面的硝态氮含量能更好地反映土壤的供氮水平。和表层土壤比较，则全剖面的硝态氮含量与生物反应之间有更好的相关性，土壤经风干或烘干易引起NO3－—N变化，故一般都用新鲜土样测定。
注2．
用酚二磺酸法测定硝态氮，首先要求浸提液清彻，不能混浊，但是一般中性或碱性土壤滤液不易澄清，且带有机质的颜色，为此在浸提液中应加入凝聚剂。凝聚剂的种类很多，有CaSO4、CaO、Ca(OH)2、CaCO3、MgCO3、KAl(SO4)2、CuSO4等，其中CuSO4有防止生物转化的作用，但在过滤前必须以氢氧化钙或碳酸镁除去多余的铜，因此以CaSO4法提取较为方便。
注3．
如果土壤浸提液由于有机质而有较深的颜色，则可用活性炭除去，但不宜用H2O2，以防最后显色时反常。