人肝癌细胞株中FOXM1及NF_B的表达及意义_王琦1_柴磊2_蒋少青3_马丽4
网络出版时间：2014-02-17 09:02
网络出版地址：https://www.wendangku.net/doc/8c5487115.html,/kcms/detail/64.1008.R.20140217.0902.004.html
人肝癌细胞株中FOXM1 及NF-κB的表达及意义
王琦1，柴磊2，蒋少青3，马丽4 ，金栋5 ，殷利军5，张桂香5，谢岩青5 （1.宁夏医科大学总医院肝胆外科，银川 750004；2.宁夏回族自治区第三人民外科，银川750004；3.宁夏医科大学总医院药剂科，银川 750004；4.宁夏医科大学总医院心脑血管疾病医院药剂科，银川 750004；5.宁夏医科大学总医院心脑血管疾病医院血管外/普外科，银川750004）1
[摘要] 目的探讨不同肝癌细胞株中转录因子FOXM1（Forkhead Box M1）及核转录因子NF-κB（nuclear factor kappa B）的表达强度及意义。方法采用Western blot、RT-PCR法，检测不同肝癌细胞株（QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721）中FOXM1及NF-κ B 在蛋白及mRNA 水平的表达情况。结果在3株肝癌细胞中FOXM1及NF-κB的表达无论是mRNA水平还是蛋白水平均存在显著差异，细胞株（QGY-7703、BEL-7402）中FOXM1及NF-κB的表达同时都明显高表达于细胞株SMMC-7721。结论肝癌细胞株中FOXM1蛋白及mRNA表达与NF-κB表达趋势一致，提示FOXM的表达可能与NF-κB的活化有关。
[关键词] FOXM1；NF-κB；肝细胞肝癌
[中图分类号]R735.7 [文献标识码]A
Expression and significance of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B in human liver carcinoma cells WANG Qi1，CHAI Lei2，JIANG Shao-qing 3，MA Li4，JIN Dong5，YIN Li-jun5 ,ZHANG Gui-xiang5，XIE Yan-qing5，（1. Dept.of Hepatobiliarysurgery，the
Affiliated Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；2. Dept.of Surgical， the Third People′s Hospital of Ningxia. Yinchuan 750004；3. Dept.of Pharmacy，the
Affiliated Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；4. Dept.of Pharmacy，the Cardio-Cerebral Vascular Disease Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；5.
Dept.of Vascular/General Surgery， the Cardio-Cerebral Vascular Disease Hospital of Ningxia Med. Univ.Yinchuan 750004）
ABSTRACT Objective（1）To investigate the expression and significance of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B in human liver carcinoma cells. Methods The expression of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B protein and micro-RNA in hepatocellular carcinoma cell lines(QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721)were detected with the application of Western blot analysis and RT-PCR analysis，respectively. Results The expression
基金项目：宁夏自然科学基金（项目编号：NZ1236）
作者简介：王琦(1983-),硕士，主任医师，肝癌复发相关分子机制的研究。
通作者：谢岩青，Email：xie-yanqing@https://www.wendangku.net/doc/8c5487115.html,
levels of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B varied significantly among three cell lines.Western blotting and RT-PCR showed that hepatocellular carcinoma (QGY-7703、BEL-7402) cells expressed higher FOXM1 and NF-κ B levels than SMMC-7721（p<0.01）. Conclusion FOXM1 protein and mRNA expression in human liver cancer cells and the NF-κ B expression trend is consistent，Prompt FOXM1 expression is associated with the activation of the NF-κ B.
Keywords Forkhead Box M1; nuclear factor kappa B; HCC(hepatocellular carcinoma);
近来研究发现,转录因子FOXM1在人肝细胞癌组织中表达高于癌旁组织，并且发现FOXM1表达与肿瘤增殖、微血管形成和凋亡抑制相关[1]。课题组前期研究中应用肝细胞癌及癌旁组织样本建立的组织芯片进行免疫组化检测，综合分析后发现,FOXM1高表达与肝癌恶性病理表型和患者预后不良关系密切[2]。IKK/IκB/NF-κB是人类肝炎后肝细胞癌中常被激活的经典通路[3]，当NF-κB被释放、活化后，进入细胞核转录激活肿瘤增殖、转移、生长、血管形成、凋亡抑制等相关基因促进癌症恶性进展[4,5]。因此,本研究通过Western blot和RT-PCR技术分析FOXM1及NF-κB在肝癌细胞株中的表达情况，为进一步探讨FOXM1是否通过NF-κB的激活促进肝癌恶性进展的分子调控机制提供理论依据，希望有助于阐明FOXM1促进肝癌恶性进展的具体机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞：人肝癌细胞株QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721购于中国科学院典型培养物宝藏委员会细胞库。
1.1.2 主要试剂：兔抗人FOXM1抗体、鼠抗人NF-κB抗体、GAPDH多克隆抗体均购于美国Santa Cruz公司，HRP-山羊抗兔、鼠IgG购于BioGenex公司，细胞RPMI1640培养基购于Gibco公司，Western相关试剂购于碧云天生物技术研究所，RNeasy Mini 试剂盒购于QIAGEN公司，RT－PCR 试剂盒购于TOYOBO公司，PCR引物购于上海生工，ECM发光试剂盒购于武汉博士德公司，胎牛血清购于Gibco公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养：QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721细胞应用RPMI1640培养基，细胞株接种
于含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素/链霉素）和RPMI1640培养液的培养瓶中，置37℃、5%恒温孵育箱中培养；传代应用0.25%的胰蛋白酶消化。具体实验采用细胞为对数生长期
的CO
2
细胞。
1.2.2 FOXM1及NF-κB的蛋白表达水平：应用对数生长期的细胞QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721检测各株细胞中FOXM1蛋白及NF-κB核蛋白表达情况，具体实验方法参考本课题
组前期发表文章[6]（其中NF-κB核蛋白提取方法具体步骤参考碧云天试剂盒提供方法），FOXM1、NF-κB和内参对照GAPDH的蛋白分子量大小分别为100KD、65KD和37KD；实验中各种抗体稀释比例为：FOXM1抗体（按1︰400稀释）、NF-κB抗体（按1︰200稀释）、GAPDH 抗体（按1︰2000稀释）和二抗（按1︰5000稀释）。
1.2.3 FOXM1及NF-κB的mRNA表达水平：细胞总RNA的提取应用对数生长期的细胞（QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721），具体实验方法参考本课题组前期发表文章[6]。目的基因及内参对照扩增引物序列为：FOXM1上游（F）5，―GGGCGCACGGCGGAAGATGAA―3，,下游（R）
5，―CCACTCTTCCAAGGGAGGGCTC ―3，，产物大小为379bp；NF-κB上游（F）5，
-CGCATCCAGACCAACAACA-3，,下游（R）5，―TGCCCAGAAGGAAACACCA―3，，产物大小为269bp；GAPDH 上游（F）5，―GAAGGTGAAGGTCGGAGTC―3，，下游（R）5，―GAAGATGGTGATGGGATTTC―3，，产物大小为226bp。具体反应条件如下：FOXM1（95℃预变性2min，95℃变性40s，55℃退40s，73℃延伸1 min，循环40次，73℃延伸5min）；NF-κB（94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退30s，72℃延伸1 min，循环35次，72℃延伸5min）；GAPDH（95℃预变性2min，95℃变性40s，55℃退火40s，73℃延伸1min，循环35次，73℃延伸5min）。
1.3 统计学方法：应用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料用x±s表示，比较采用t检验进行统计学分析，以P<0.05视为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Western blot 法检测不同人肝癌细胞株中FOXM1蛋白及NF-κB核蛋白表达:各株人肝癌细胞中的FOXM1蛋白及NF-κB核蛋白表达水平见图1及图2。结果显示细胞株（QGY-7703、BEL-7402）中FOXM1及NF-κB的表达都明显高于细胞株SMMC-7721，表达有统计学意义（P<0.01），FOXM1相对光密度值QGY-7703:（0.770±0.053）、BEL-7402:（0.810±0.073）、SMMC-7721:（0.132±0.021）；NF-κB相对光密度值QGY-7703:（0.680±0.056）、BEL-7402:（0.872±0.071）、SMMC-7721:（0.141±0.015）。
1. QGY-7703；
2.BEL-7402；
3.SMMC-7721
图1 Western blot法检测人肝癌细胞株中FOXM1、NF-κB的蛋白表达水平及内参对照
*表示P<0.05各肝癌细胞株之间比较
图2人肝癌细胞中FOXM1及NF-κB蛋白的表达（Western blot）
2.2 RT-PCR法检测不同人肝癌细胞株中FOXM1及NF-κB的mRNA水平表达：各株人肝癌细胞中FOXM1及NF-κB的mRNA表达水平见图3及图4。RT-PCR目的基因FOXM1及NF-κB的碱基长度分别为379bp和269bp；管家基因GAPDH碱基长度为226bp。不同肝癌细胞中FOXM1的相对光密度值为QGY-7703:（1.021±0.095）、BEL-7402:（1.224±0.098）、SMMC-7721:（0.142±0.019）；NF-κB相对光密度值QGY-7703:（0.902±0.055）、BEL-7402:（0.945±0.087）、SMMC-7721:（0.156±0.021）。结果显示肝癌细胞株（QGY-7703、BEL-7402）中FOXM1及NF-κB的表达同时都明显高于细胞株SMMC-7721（P<0.01）。
1. QGY-7703；
2.BEL-7402；
3.SMMC-7721
图3 RT-PCR法检测肝癌细胞系中FOXM1、NF-κB的mRNA表达水平及内参对照
*表示P<0.05各肝癌细胞株之间比较
图4 人肝癌细胞系中FOXM1及NF-κB的mRNA表达水平（RT-PCR）
3 讨论
随着医学技术的进步与不断发展，对肝癌的治疗虽然取得了一定的疗效，但肝癌复发是
影响肝癌术后疗效的主要原因,其死亡率仍居肿瘤相关死亡的第三位。因此,探明肝细胞肝癌的确切发病机制、发现新的治疗靶点对肝癌的治疗具有重要意义。转录因子FOXM1是Forkhead
蛋白家族中成员之一，其通过细胞周期G
1/S及G
2
/M转变过程对细胞增殖发挥着至关重要的作
用，研究发现FOXM1在多种恶性肿瘤的发生发展过程中起着重要作用。
由于p65为活化的NF-κB，是转入细胞核中的，因此本实验中NF-κB提取物为核蛋白，NF-κB为抗凋亡因子，在其家族中，绝大部分为NF-κBp65(p65)。肿瘤浸润转移的生物学行
为与NF-κB激活相关，并且许多肿瘤的浸润转移与NF-κB活化炎性因子、黏附分子、基质
金属蛋白酶等因素有关。在本实验中研究证实了FOXM1及NF-κB在3株肝癌细胞中的表达水
平存在显著差异，RT-PCR结果提示，细胞株（QGY-7703、BEL-7402）中FOXM1和NF-κB在mRNA水平都明显高于细胞株SMMC-7721（p<0.05）；同样Western Blot检测显示FOXM1及NF-κB
蛋白在细胞株（QGY-7703、BEL-7402）中高表达，而在细胞株SMMC-7721中低表达甚至于不
表达。结果提示,肝癌细胞株中FOXM1蛋白及mRNA表达水平与NF-κB核表达趋势一致。
课题组前期研究发现,FOXM1高表达与肝癌恶性病理表型和患者预后不良关系密切，提示FOXM1在肝癌恶性行为中起着重要作用[2]。研究发现[1,7]FOXM1通过转录激活Skp2/Cks1加快DUSP1泛素化降解，从而解除对Cdk2和ERK的抑制，促进细胞G
1
/S期转化和ERK通路持续激活。IKK/IκB/NF-κB是人类肝炎后肝细胞癌中常被激活的经典通路，磷酸化IκB与SCF泛
素连接酶复合体结合经泛素化后，NF-κB则被释放、活化，进入细胞核转录激活肿瘤增殖、
转移、生长、血管形成、凋亡抑制等相关基因促进癌症恶性进展[4,5]，FOXM1下游基因产物Skp2
和Cks1是SCF型泛素连接酶复合体的核心亚基[7,8]。本研究发现肝癌细胞株中FOXM1蛋白及mRNA表达水平与NF-κB核表达趋势一致。
因此结合本研究推测,FOXM1可能通过上调Skp2/Cks1加速IκB泛素化降解，从而解除
IκB对NF-κB的抑制，激活NF-κB信号通路来参与肝癌恶性行为的机制之一。同样本研究
为选用FOXM1作为肝癌防治靶点提供了实验依据，作为细胞增殖调控的关键因子，FOXM1有可
能成为肝细胞肝癌治疗的重要靶点。
参考文献
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Gut. 2009，58(5):679-87.
[收稿日期] 2013-06-25 [责任编辑]李洁
实验室常用细胞株
ATCC? Number: CRL-2865? Price: $329.00 Designations: T47D-KBluc Depositors: VS Wilson Biosafety Level: 1 Shipped: frozen Medium & Serum: See Propagation Growth Properties: adherent Organism: Hom o sapi ens (human) Morpholog y: epithelial Source: Organ: mammar y gland; breas t Tissue: duct Disease: ductal carcinoma Derived from metastatic site: pleural effusion Cell T y p e: epithelialtransfected with reporter plas mid Permits/F orms: In addition to the MTA menti oned above, other ATCC and/or regulatory per mits may be required for the transfer of this ATCC material. Any one purchasing ATCC material is ultimatel y r esponsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the s pecific requirements for shipment to your loc ation. Reverse Transcript: N Age: 54 years adult HeLa Mar kers: N
HuH-7 人肝癌细胞
HuH-7 人肝癌细胞 Catalogue No.: C165 Product Format: a T25 flask Culture Properties：贴壁 Complete Growth Medium:89%H-DMEM+10%FBS+1%双抗 Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5% Application:Cells and cancer research NOTE: FOR RESEARCH USE ONLY. Components Operation steps for cell culture 1.吸走用于培养基，加入3-5mL PBS后轻轻晃动培养瓶润洗细胞； 2.吸干净PBS后加入1mL 0.25%胰酶-0.53mM EDTA，轻轻摇晃培养皿使胰酶 浸没细胞表面，培养瓶放37度培养箱消化； （细胞对于消化比较敏感，消化过度会严重影响细胞状态，导致细胞传代死亡漂浮或者传代后不长。细胞消化到细胞间隙变大但未脱落，可以轻轻吹下时即可终止，禁止消化到细胞完全漂浮。混匀细胞时尽量轻柔，不要吹出大量气泡。） 3.加入6-8ml完全培养基终止消化，轻轻吹下细胞混匀； 4.将混匀的细胞1000rpm（约150g）离心3min，弃上清，再用新鲜培养基 重悬37度培养箱继续培养； 传代比例: 不同细胞生长速度不一，具体传代比例视细胞生长速度而定，大部分细胞适用1:3-1:4传代，生长较慢的细胞可以1:2传代。 Cell cryopreservation 1.冻存液：92%完全培养基+8%DMSO（可以根据实验室条件自行选择） 2.降温步骤：4度10min，-20度2h，-80过夜后液氮保存。
常见细胞株中文名称及缩写
人类组织正常及永生化细胞 英文名中文名称 293E E转化人胚肾293细胞（B类） 293ET ET转化人胚肾293细胞（B类） 293KB KB转化人胚肾293细胞（B类） 293T人胚肾T细胞 A7d野生型人 C-KIT受体细胞株（B类）AMS3(SCF3)人干细胞因子单克隆抗体细胞株(B类) APP-PS1人APP-PS1双基因转染细胞株(HEK293)(B类) FC33ASP2人胚胎肾细胞转化细胞 FIP293FIP293(来源于HEK293)(B类) HEK-293人胚肾细胞 CCC-HPF-1人胚肺二倍体细胞 CCC-ESF-1人胚胎皮肤成纤维细胞HFF(ATCC? SCRC-1041?)人前皮肤成纤维细胞 HFSF人胚胎眼巩膜成纤维细胞 HFTF人胚胎眼Tenon's囊成纤维细胞 HK-2人肾小球上皮细胞 HKC人胚肾上皮细胞 HSF人皮肤成纤维细胞 MRC-5人胚肺成纤维细胞 WISH人羊膜细胞 CCC-HEL-1人胚胎肝正常细胞 CCC-HEK-1人胚胎肾正常细胞 CCC-HHM-2人胚胎心肌组织来源细胞 CCC-HPE-2人胚胎胰腺组织来源细胞 CCC-HB-2人胚胎膀胱组织来源细胞 CCC-HIE-2人胚胎肠粘膜细胞 CCC-HBE-2人胚胎气管细胞 动物组织正常及永生化细胞 3T3swiss swiss鼠胚胎成纤维细胞 3T3L1小鼠胚胎成纤维细胞(前脂肪) 3T6swiss小鼠胚胎成纤维细胞 7WCY1.0人APP-PS1双基因转染细胞株(CHO)(B类) 7WD10人APP基因转染细胞株(CHO)(B类) 7WML6.0人APP-PSI（M146L)双基因转染细胞株（CHO)(B类） 7WPS1APP-PS1双基因转染细胞株（CHO）（B类） BaF3小鼠原B细胞（B类） BHK-21金黄地鼠肾 BS-C-1非注洲绿猴肾 C2C12小鼠成肌细胞 C3H10T1/22A6小鼠成纤维细胞 CH0dhfr二氢叶酸缺陷型中国仓鼠卵巢细胞 CHO-K1中国仓鼠卵巢细胞
Rab27A和Rab27B在4种不同人肝癌细胞株中的表达
龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/8c5487115.html, Rab27A和Rab27B在4种不同人肝癌细胞株中的表达 作者：刘鼎刘建生 来源：《中国当代医药》2015年第16期 [摘要] 目的检测Rab27A与Rab27B在3种人肝癌细胞系及1种永生化肝细胞系中的表达情况，初步研究Rab27A与Rab27B表达对肝癌细胞生物学特性的影响。方法采用RT-PCR及Western blot技术，检测Rab27A与Rab27B mRNA在3种人肝癌癌细胞HepG2、Huh-7、Li-7及1种永生化肝细胞系HL-7702中的表达。结果 Rab27A与Rab27B在肝癌细胞系及原发性肝癌组织中存在差异性表达。Rab27A mRNA在3种人肝癌细胞系中表达明显强于1种人永生化肝细胞系；Rab27B mRNA在3种人肝癌及1种人永生化肝细胞系中均明显表达但无显著差异。结论 Rab27A与Rab27B与原发性肝癌密切相关，可以为临床采取合理诊断措施提供有效的参考依据。 [关键词] Rab27A；Rab27B；肝细胞癌；RT-PCR；Western blot [中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）06（a）-0004-04 Expression of Rab27A and Rab27B in the four different hepatocellular carcinoma LIU Ding LIU Jian-sheng▲ The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China [Abstract] Objective To investigate the expression of Rab27A and Rab27B in 3 human HCC lines and the immortalized hepatic cell line and its effect on biology characteristics of the cells. Methods The mRNA expression of Rab27A and Rab27B was detected by RT-PCR，and Western-blot in 3 human HCC lines of HepG2，Huh-7，Li-7 and the immortalized hepatic cell line of HL-7702. Results Rab27A and Rab27B were differentially expressed in cell lines and primary HCC tumors.The expression of Rab27A in 3 human HCC line was significantly better than that expressed in the immortalized hepatic cell line；the mRNA of Rab27B in 3 human HCC lines and the immortalized hepatic cell line were significantly expression but there was no significantly difference. Conclusion Rab27A and Rab27B expression are closely correlated HCC，it can provide the clinical reasonable diagnostic measures as valuable effective reference basis. [Key words] Rab27A；Rab27B；Hepatocellular carcinoma；RT-PCR；Western blot 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，具有极高的侵袭性和转移性，出现典型症状时，往往已经为晚期。目前与HCC进展相关的因子包括癌
Clausenidin及其结构类似物对於人类肝癌细胞株 Hep G2
Clausenidin及其結構類似物對於人類肝癌細胞株Hep G2/A2與Hep 3B/T2作用的研究 Study the effects of clausenidin and it's analogue on human hepatoma cell lines Hep G2/A2 and Hep 3B/T2 蘇俊圖 Su, Chun-Tu 生物藥學研究所 關鍵詞: 生物科技;藥學;肝癌細胞株;Clausenidin; Keyword: BIOTECHNOLOGY;PHARMACOLOGY; 摘要: B型肝炎是全球性的流行疾病，尤其在亞非地區最為盛行。由 流行病學上的研究顯示，B型肝 炎帶原者罹患肝癌的機率遠大於正常人，但至今仍無有效藥物可供治療之用，因此這方面的 新藥開發是一重要課題。本論文以帶有B型肝炎病毒基因且能表現B型肝炎病毒表面抗原的人 類肝癌細胞株Hep G2/A2、Hep 3B/T2作為藥物篩選模式，並對所篩得之化合物其抑制表面抗原產生 及對細胞生長之調節機制做探討。 在本論文中，發現到在一些pyranocoumarin的結構類似物中， Clausenidin對於抑制 B型肝炎病毒表面抗原的能力最強，其中Clausenidin之抑制濃度EC(50)為1.0μg/ml 。由RT-PCR分析，發現表面抗原基因之mRNA表現量會受影響。在另一株無HBV基因但有高效率轉 染HBV基因之人類肝癌細胞株HuH-7細胞，發現Clausenidin處理後，其HBV表面抗原的promoter-SPII，以 及HBV基因會受到影響。經對細胞預先處理TPA以去除蛋自激活酵素C(PKC)的實驗，得知Clausenidin 抑制細胞產生表面抗原的作用與PKC活化途徑無關。 人類肝癌細胞株HepG2/A2經Clausenidin處理其 抑制B型肝炎病毒表面抗原的能力具有可逆性，但處理Clausenidin長時期(6天)對HepG2/A2細胞會抑 制細胞生長；但在另一肝癌細胞株 Hep3B/T2，細胞生長則不被抑制。經由細胞週期及DNA複製分 析發現經Clausenidin處理，使HepG2/A2之細胞週期進行停止，DNA複製能力減弱。 在兩種不同人類 肝癌細胞 Hep G2/A2，Hep3B/T2經lausenidin長期處理後對於另一肝癌細胞指標?甲型胎兒蛋白(AFP) ，在Hep G2/A2 細胞中AFP分泌量增加，但在Hep 3B/T2細胞中分泌量卻減少 。 在藥物篩選中同時發 現另一pyranocoumarin?Clausarin，會造成細胞死亡的效果。經由細胞外型、去氧核糖核酸分析， 以及用螢光顯微鏡染色，觀察細胞核，認為細胞之死亡其應是細胞程序性死亡(apoptosis)。 一 些pyranocoumarin的結構類似物，對於抑制表面抗原之結構-活性間之關係(SAR)，以及Clausenidin如 何影響細胞生長、甲型胎兒蛋白在不同細胞的作用差異，與 Clausarin如何造成細胞死亡，都 值得做更進一步的探討。 Hepatitis B virus (HBV) infection is a world-wide public health and epidemiology probl em, especially in Asia and Africa. Epidemic studies have clearly shown that the chronic carriers of HBV can cause highe r percentage of liver diseases such as hepatocellular carcinoma (HCC) and cirrhosis than normal people. To date, no tru ly effective drugs against HBV are available, therefore it is important to develop anti-HBV drugs. In these studies we d emonstrated that human hepatoma, Hep G2/A2 and Hep 3B/T2 cells, cell line containing HBV genomes and by transfection HBV genomes respectively, which continually secrete HBsAg into culture medium, can serve as a quick assay system for drug s creening for anti- HBV activity. Furthermore the regulatory mechanism of suppression of production of HBsAg and cell gr owth were also investigated. In this studies from some pyranocoumarins, Clausenidin strongly suppressed the production o f HBsAg. Clausenidin suppressed the HBsA g production by bot h Hep G2/A2 and Hep 3B/T2 cells with EC5o 1.0μg/ml. RT-PCR analysis reveals that the suppression of HBsAg gene expression by Clausenidin is mainly at the mRNA level. Clausenidin n ot only suppress the endogeneously expressed HBsAg in the Hep G2/A2 cells but also suppresses the HBsAg, HBeAg produced
人肝癌细胞株中FOXM1及NF_B的表达及意义_王琦1_柴磊2_蒋少青3_马丽4
网络出版时间：2014-02-17 09:02 网络出版地址：https://www.wendangku.net/doc/8c5487115.html,/kcms/detail/64.1008.R.20140217.0902.004.html 人肝癌细胞株中FOXM1 及NF-κB的表达及意义 王琦1，柴磊2，蒋少青3，马丽4 ，金栋5 ，殷利军5，张桂香5，谢岩青5 （1.宁夏医科大学总医院肝胆外科，银川 750004；2.宁夏回族自治区第三人民外科，银川750004；3.宁夏医科大学总医院药剂科，银川 750004；4.宁夏医科大学总医院心脑血管疾病医院药剂科，银川 750004；5.宁夏医科大学总医院心脑血管疾病医院血管外/普外科，银川750004）1 [摘要] 目的探讨不同肝癌细胞株中转录因子FOXM1（Forkhead Box M1）及核转录因子NF-κB（nuclear factor kappa B）的表达强度及意义。方法采用Western blot、RT-PCR法，检测不同肝癌细胞株（QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721）中FOXM1及NF-κ B 在蛋白及mRNA 水平的表达情况。结果在3株肝癌细胞中FOXM1及NF-κB的表达无论是mRNA水平还是蛋白水平均存在显著差异，细胞株（QGY-7703、BEL-7402）中FOXM1及NF-κB的表达同时都明显高表达于细胞株SMMC-7721。结论肝癌细胞株中FOXM1蛋白及mRNA表达与NF-κB表达趋势一致，提示FOXM的表达可能与NF-κB的活化有关。 [关键词] FOXM1；NF-κB；肝细胞肝癌 [中图分类号]R735.7 [文献标识码]A Expression and significance of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B in human liver carcinoma cells WANG Qi1，CHAI Lei2，JIANG Shao-qing 3，MA Li4，JIN Dong5，YIN Li-jun5 ,ZHANG Gui-xiang5，XIE Yan-qing5，（1. Dept.of Hepatobiliarysurgery，the Affiliated Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；2. Dept.of Surgical， the Third People′s Hospital of Ningxia. Yinchuan 750004；3. Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；4. Dept.of Pharmacy，the Cardio-Cerebral Vascular Disease Hospital of Ningxia Med. Univ. Yinchuan 750004；5. Dept.of Vascular/General Surgery， the Cardio-Cerebral Vascular Disease Hospital of Ningxia Med. Univ.Yinchuan 750004） ABSTRACT Objective（1）To investigate the expression and significance of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B in human liver carcinoma cells. Methods The expression of Forkhead Box M1 and nuclear factor kappa B protein and micro-RNA in hepatocellular carcinoma cell lines(QGY-7703、BEL-7402、SMMC-7721)were detected with the application of Western blot analysis and RT-PCR analysis，respectively. Results The expression 基金项目：宁夏自然科学基金（项目编号：NZ1236） 作者简介：王琦(1983-),硕士，主任医师，肝癌复发相关分子机制的研究。 通作者：谢岩青，Email：xie-yanqing@https://www.wendangku.net/doc/8c5487115.html,
肝癌细胞培养(总结版)
BEL7402/hepG2/HCCLM等肝癌细胞培养过程 器材： 液氮冷冻灌、恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、离心机、 倒置显微镜、超净工作台、一次性吸管若干个、带塞培养瓶（不定个）、试管架、酒精灯、G6型号细菌过滤漏斗、无菌冻存管、液 氮瓶。 试剂： RPMI l640培养液，胎牛血清（生长因子）, 胰蛋白酶液，70%乙醇（消毒）,冻存培养液（培养液7ml，胎牛血清2ml，DMSO 1ml)，PBS缓冲液等。 器皿的消毒及准备： 清洗灭菌（浓硫酸、蒸馏水）： （1）浸泡（酸浸）:新使用或重复使用的玻璃器皿须经浓硫酸 溶液浸泡过夜，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷 等物质，并消除其弱碱性。操作过程需戴防护用具。 （2）刷洗:浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。刷洗后 经行烘干。 （3）冲洗、烘干备用:浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，将清洗好的玻璃器 皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器皿要求干净透明，无油烟，不能 残留任何有害物质及化学药品等。 （5）包装灭菌:器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。 实验前准备工作: 操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用酒精消毒。用紫外线消 毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线 照射60min可以消灭空气中大部分细菌。 细胞复苏： 冻存细胞保存管保存在液氮中（-196℃），取出保存管后必须 快速冷冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，致使细胞死亡。在冻存细胞的保存管中含有对细胞有毒害的成分DMSO,故在解冻应 马上将其去除。在冷冻活化前应在无菌台上将细胞培养液配好，然 后将保存管从液氮中取出，放于37℃的温水中快速使细胞解冻。解 冻后悬液快速移入培养液中混匀，离心去掉上清液，再加入细胞培 养液。
常见肝癌细胞株
实验室用肝癌细胞株 细胞英文名称Hep G2 [HepG2]细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性该细胞来源于一名15岁的白人少年的肝癌组织。该细胞表达甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、纤溶酶原、补体C4、C3激活物、纤维蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、视黄醇结合蛋白；表达胰岛素受体和胰岛素样生长因子IGFⅡ的受体；该细胞具有3-羟基-3-甲酰辅酶A还原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未证明该细胞中有HBV基因组。 培养基MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清10%FBS其它因子1%NEAA 传代方法1:4~1：6传代；每周2次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 细胞英文名称SMMC-7721 [SMMC7721]细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性取人肝癌组织，采用静置和旋转管法培养11天细胞开始生长，首次传代23天。AFP阳性。用Northern blot方法，未能检测到细胞中1.3kb LFIRE-1/HFREP-1 mRNA的表达，免疫缺陷小鼠体内可成瘤。 培养基RPMI 1640 (w/o Hepes) 血清10%FBS其它因子无 传代方法1:3传代；3~4天1次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 细胞英文名称Hep3b 细胞中文名人肝癌细胞 形态特性上皮细胞样生长特性贴壁生长。 特征特性该细胞源自一位患有肝癌的7岁黑人男童，HBV阳性。 培养基MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清10%FBS 其它因子无 传代方法1:4～1:6传代，每周换液2次传代情况C2 冻存条件基础培养基+8%DMSO+20%FBS 支原体检测培养法（-） 国内还有，： 小鼠肝癌细胞Hepa 1-6 [Hepa1-6] 人胆管细胞型肝癌细胞HCCC-9810 小鼠肝癌瘤株H22 人肝癌细胞HHCC 人肝癌细胞PLC/PRF/5 人肝癌细胞HB611 人肝癌细胞BEL-7402 人肝癌细胞QGY-7701 （有疑问细胞待定） 人肝癌细胞QGY-7703 （有疑问细胞待定） 人肝癌细胞BEL-7404 人肝癌细胞BEL-7405
肿瘤相关抗原GCF2高水平表达的肝癌细胞株的筛选
*国家自然科学基金资助项目（编号：8106016），广西科学基金资助项目（编号：2010GXNSFD013048） △通信作者。E －mail ：gwongluo@yahoo．com 肿瘤相关抗原GCF2高水平表达的肝癌 细胞株的筛选 * 蒋日婷，晁耐霞，马平，李金平，罗国容△ 广西医科大学组织胚胎学教研室（南宁530021） 【摘要】目的 筛选出肿瘤相关抗原GCF2高表达的人肝癌细胞株，为进一步探讨GCF2对肝癌发生发展的 可能作用奠定基础。方法 选择4种人肝癌细胞株（BEL －7404、 HepG2、SMMC －7721和QGY －7703）及1种成人正常肝细胞株（HL －7702），培养后分别制作细胞爬片及提取蛋白后，采用免疫细胞染色技术和Western blot 的方法筛选出GCF2表达量高的细胞株。结果 免疫细胞染色显示， GCF2在5种细胞中的胞核及胞质中均有表达。GCF2蛋白在肝癌细胞BEL －7404、HepG2、SMMC －7721和QGY －7703的表达要强于正常肝细胞HL －7702，其中以BEL －7404的表达量最高。通过Western blot 检测，BEL －7404的GCF2相对表达量为0.875?0.134，较其他细胞株高，差异有统计学意义（P ＜0.05）。结论 BEL －7404细胞中GCF2蛋白水平的相对表达量最高，可以作为下 一步探讨GCF2在肝癌发生发展的可能作用的实验材料。 【关键词】肿瘤相关抗原；GCF2；肝癌；蛋白表达 GCF2（GC binding factor 2）是一个转录抑制因子，能 够抑制多个下游基因，比如EGFR 、TNF －α、PDGF －A 链和Igf2等的转录，参与细胞增殖、周期和凋亡等进 程 ［1－6］ 。本课题组前期用SEREX 技术筛选人肝癌组织构建的cDNA 文库，发现2个克隆与GCF2的片段同 源，提示GCF2可能是肝癌相关抗原［7］ 。目前，尚未见文献报道GCF2基因在肝癌中的作用的研究，因此，2010年11月至2011年3月，本实验将采用免疫细胞化学技术检测4种人肝癌细胞和1种成人正常肝细胞中GCF2的表达情况，并且通过Western blot 筛选出GCF2高水平表达的人肝癌细胞株，为进一步探讨GCF2在肝癌发生发展的可能作用奠定基础。1材料与方法 1．1 材料人肝癌细胞株BEL －7404、 HepG2、SMMC －7721、QGY －7703和成人肝细胞株HL －7702，均购于上海细胞生物学研究所。实验仪器均由广西医科大学基础实验中心提供：CO 2恒温培养箱（Thermo ）、倒置显微镜（OLYMPUS ）、台式高速冷冻离心机（SIGMA ）、紫外分光光度计（UV2000I Tanon ）、电泳仪（北京六一仪器厂）、半干式转膜仪（BIO －RAD ）。细胞培养基高糖DMEM 及RPMI 1640均购于HyClnoe 公司。磷酸缓冲液（PBS ）、 DAB 显色试剂购于福州迈新生物技术开发有限公司。蛋白提取试剂盒购于南京凯基生物技术有限公司。GCF2抗体购自美国Santa 公司。辣根过氧化物酶（HRP ）标记的山羊抗鼠IgG 购自上海长岛生物试 剂有限公司。GAPDH 抗体、ECL 发光试剂购于碧云天生物技术研究所。 1．2 细胞培养 将4种肝癌细胞分别培养在含10% 胎牛血清的高糖DMEM 培养液中，将成人正常肝细胞 株HL －7702培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640培 养液中，并置于37?、 5%CO 2及饱和湿度的恒温培养箱中培养， 隔天更换培养液。1．3细胞爬片的制作及免疫组织化学检测 将生长 状态良好的人肝癌细胞株BEL －7404、 HepG2、SMMC －7721、QGY －7703和成人正常肝细胞株HL －7702接 种于置有圆形盖玻片的12孔培养板内，接种密度为1?104个细胞/孔，用含10%胎牛血清的高糖DMEM 及RPMI 1640培养液在37?、5%CO 2条件下培养。待细胞长到60% 70%融合时，用0.01mol /L PBS 洗涤1次，加入4%多聚甲醛室温固定15min 。将盖玻片取出，粘贴在载玻片上，按照常规免疫组织化学方法，加 入1?100稀释的GCF2抗体， 4?湿盒内温育过夜。PBS 洗片后滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG ，室温 下孵育30min ， PBS 洗片后进行DAB 显色2 3min 。常规50% 100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，香柏油 封片，显微镜下观察并拍照记录结果。以PBS 替代一抗作为阴性对照。采用Image －Pro Plus version 6.0软件分析阳性着色光密度。1．4 总蛋白的提取及Western blot 的检测常规细胞培养，当细胞贴壁生长达90%时，按蛋白提取试剂盒 操作方法提取细胞总蛋白， 分装后置于－80?保存。取4个细胞株的蛋白20μg 与1/4体积的5?SDS 上样缓冲液混合，100?沸水浴5min ，冷却后点样进行 SDS －PAGE 电泳分离。电泳完毕，按照半干转移仪公司提供的说明进行印迹操作，将电泳分离蛋白转移到PVDF 膜上。转移膜用含50g /L 脱脂牛奶的PBST （0.01mol /L PBS +0.5%Tween －20）室温封闭5h 。GCF2抗体1?200稀释液4?孵育过夜；按1?5000稀 · 1551·广东医学2012年6月第33卷第11期Guangdong Medical Journal June．2012，Vol．33，No．11
肝癌细胞
实验室用肝癌细胞株 细胞英文名称 Hep G2 [HepG2] 细胞中文名人肝癌细胞形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性该细胞来源于一名15岁的白人少年的肝癌组织。该细胞表达甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、纤溶酶原、补体C4、C3激活物、纤维蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、视黄醇结合蛋白；表达胰岛素受体和胰岛素样生长因子IGFⅡ的受体；该细胞具有3-羟基-3-甲酰辅酶A还原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未证明该细胞中有HBV基因组。培养基 MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清 10%FBS 其它因子 1%NEAA 传代方法 1:4~1：6传代；每周2次。传代情况 C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 细胞英文名称 SMMC-7721 [SMMC7721] 细胞中文名人肝癌细胞形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性取人肝癌组织，采用静置和旋转管法培养11天细胞开始生长，首次传代23天。AFP阳性。用Northern blot方法，未能检测到细胞中1.3kb LFIRE-1/HFREP-1 mRNA的表达，免疫缺陷小鼠体内可成瘤。培养基 RPMI 1640 (w/o Hepes) 血清 10%FBS 其它因子无 传代方法 1:3传代；3~4天1次。传代情况 C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性细胞英文名称 Hep3b 细胞中文名人肝癌细胞形态特性上皮细胞样生长特性贴壁生长。 特征特性该细胞源自一位患有肝癌的7岁黑人男童，HBV阳性。 培养基 MEM-EBSS: Minimum Essential Medium (MEM Eagles with Earle＇s Balanced Salts) 血清 10%FBS 其它因子无 传代方法 1:4～1:6传代，每周换液2次传代情况 C2 冻存条件基础培养基+8%DMSO+20%FBS 支原体检测培养法（-）国内还有，： 小鼠肝癌细胞 Hepa 1-6 [Hepa1-6] 人胆管细胞型肝癌细胞 HCCC-9810 小鼠肝癌瘤株 H22 人肝癌细胞 HHCC 人肝癌细胞 PLC/PRF/5 人肝癌细胞 HB611 人肝癌细胞 BEL-7402 人肝癌细胞 QGY-7701 （有疑问细胞待定）人肝癌细胞 QGY-7703 （有疑问细胞待定）人肝癌细胞 BEL-7404 人肝癌细胞 BEL-7405 人高转移肝癌细胞 HCCLM3 人肝癌细胞 Hep 3B2.1-7 人肝癌亚力山大细胞 PLC/PRF/5 人肝癌细胞 SMMC-7721 人肝癌细胞 Homo Spaniens cell line Hep B1.2 抗人肝癌单抗HAb18杂交瘤细胞 HAb18 抗人肝癌单抗F11杂交瘤细胞 F11 细工-CRO
常见细胞系
细胞株名称ATCC 编号细胞来源细胞种类生长状态使用培养基 293 CRL-1573 人胎肾贴壁、上皮样MEM/NEAA,10%FBS 2215 无人肝癌贴壁、上皮样DMEM,15%FBS 127TAg CRL-2817 小鼠多能胚胎干细胞胚胎型DMEM, 10% FBS 293/CHE-Fc CRL-2368 人肾上皮细胞、贴壁DMEM,10%FBS 3T3-L1 CL-173 小鼠胚胎成纤维成纤维DMEM,10%FBS 3T6 CCL-96 小鼠胚胎成纤维细胞、贴壁DMEM,10%FBS A431 CRL-1555 人表皮细胞癌上皮细胞、贴壁DMEM,10%FBS A549 CCL-185 人肺癌贴壁、上皮样F12,10%FBS A9 CRL-6319 小鼠结缔组织成纤维细胞、贴壁DMEM,10% FBS+ AR42J CRL-1492 大鼠胰腺肿瘤贴壁、上皮样Ham'sF-12K, 20%FBS AtT-20 CCL-89 小鼠垂体肿瘤上皮细胞、贴壁F-10, 15% HS和2.5% FBS B95-8 CRL-2311 绒猴EB病毒感染的白血病细胞成淋样RPMI-1640, 10% FBS BALB/3T3 CCL-163 小鼠胚胎成纤维细胞、贴壁DMEM, 10% FBS bel7402 无人肝癌贴壁、上皮样RPMI-1640,15%FBS BeWo CCL-98 人绒毛癌上皮细胞、贴壁F-12K, 15%F12 BHK-21 CCL-10 仓鼠肾成纤维细胞、贴壁MEM/NEAA, 10% FBS BHL-100 无人乳房上皮细胞、贴壁McCoy'5A, 10% FBS BRL 3A CRL-1442 大鼠肝上皮细胞、贴壁MEM/NEAA, 10% FBS BT CRL-1390 牛鼻甲骨细胞成纤维细胞、贴壁DMEM, 10% FBS Caco-2 HTB-37 人结肠腺癌上皮细胞、贴壁MEM/NEAA, 10% FBS Chang 无人肝脏上皮细胞、贴壁BME, 10% FCS
Rac1在肝癌细胞株生长和侵袭中的意义
Rac1在肝癌细胞株生长和侵袭中的意义 【摘要】目的：证实Rac1在肝癌细胞的生长与侵袭中的意义，寻找可能的肿瘤基因治疗新靶点。方法：特异性抑制Rac1蛋白表达的siRNA干扰肝癌高转移细胞株97H，观察肝癌高转移细胞株97H 内Rac1表达、细胞生长、肿瘤细胞的活力和体外侵袭力的变化。结果：肝癌高转移细胞株97H内Rac1表达、细胞生长受抑制，肿瘤细胞的活力和体外侵袭力显著降低。结论： Rac1表达的减少能够显著抑制肝癌细胞的生长和侵袭，可能成为肿瘤基因治疗新的靶点。 【关键词】 Rac1 肝癌高转移细胞株 siRNA 移 ［Abstract］Objective: To prove Rac1 might play an important role in the proliferation and transference of hepatoma cell.Methods： small interference RNA technique was employed to knock down gene expression of Rac1 in hepatoma cell line 97H. Results： The protein level of Rac1, the cell proliferation, the cell vitality and the ability to invade the reconstituted basement membrane were decreased dramatically after transfection with a Rac1specific siRNA vector. Conclusion：Rac1 might play an important role in the development, progression,transference of hepatoma and also provide a possible strategy for the interference of tumor angiogenesis by targeting the Rac1. ［Key words］ Rac1; hepatoma cell; siRNA;transference
分离肝癌细胞及其转移性细胞株的建立
【摘要】【目的】建立新的肝细胞癌细胞系,为肝癌实验研究提供更多纯化癌细胞。【方法】从肝细胞癌患者原发灶和门脉癌栓中获取癌组织,采用Percoll浓度梯度分离癌细胞进行培养,用微环境消化法获取癌细胞克隆并建立细胞系,对培养成功的细胞系进行生长曲线测定、染色体G带核型分析、对比基因组杂交和裸鼠接种成瘤实验。【结果】对20例肝癌组织进行癌细胞分离培养和克隆,成功建立2例细胞系H2M和H4M,这2株细胞均来自门脉癌栓,它们的染色体数目测定均为超3倍体(71~78条)。CGH检测显示H2M主要的细胞遗传学改变为染色体4q、13q、16q、17p和19p缺失和1q、3q、5p、6p、7q和8q扩增,其中有一条标记染色体含有1q 和6p[t(1;6)染色体];而H4M染色体8p,9,13q,16q缺失和6p,7p,11p,11q13扩增,其中有一条标记染色体含有一长的均染区(hsr)。H2M细胞接种裸鼠1个月,产生典型的人肝细胞癌,但H4M接种尚未能成瘤。【结论】Percoll浓度梯度分离癌细胞和微环境消化法取得癌细胞克隆是建立原代细胞系的有效方法。2例肝癌细胞系的建立为以后肝癌研究提供了实验材料,所测出的肝癌细胞系的细胞遗传学改变及在裸鼠接种成瘤,为肝癌细胞癌基因和抑癌基因筛选提供了研究线索和实验模型。 【关键词】肝癌;细胞株;核型;比较基因组杂交 肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是常见癌症之一。尽管已有多个肝癌细胞系供实验室研究用,但这些细胞多由国外研究人员建立,而且极少从门脉转移灶建立[1]。此外,已建立的细胞系缺乏细胞遗传学改变的资料,不能为肝癌癌基因、抑癌基因的筛选及肝癌转移机制研究提供线索。本文描述2例门脉转移性肝癌细胞系的建立过程并检测其分子遗传学改变,旨在为HCC的深入研究提供实验工具。 1材料和方法 1.1标本来源 20例肝癌组织取自中山大学附属第一医院肝胆外科手术标本,每份癌组织均取原发灶和门脉癌栓,经病理检查证实和进行细胞培养。 1.2细胞培养 1.3癌细胞克隆 培养数天后,通过微环境消化法获取癌细胞克隆。具体方法如下:先将细胞稀释传代,待细胞生长2~3d,然后在倒置显微镜下对单个分散存在的癌细胞克隆位置在平皿底部用油性笔定位标记。将培养液吸去,加入2mL的0.25胰酶与0.02íTA的消化液预消化。用一弯头管口平整的玻璃吸管吸取约10?滋L的消化液,让消化液保持在吸管口处,将吸管口置于所标记的细胞克隆上面,吹出微量的培养液,随即将培养液重新吸回吸管。将含细胞的消化液置入24孔培养板内,加入约1mL的培养液继续培养。待细胞增多时再进行扩大培养。 采用这种方法,成功培养2例男性肝癌患者的肝癌细胞系,2例均取自门脉癌栓,分别命名为H2M和H4M。 1.4生长曲线 将培养第12代的H4M细胞5.4×104接种在直径5cm的塑料平皿,于接种后第2天开始将细胞消化计数,每天消化3个平皿的细胞数并计算平均值,连续7d,最后绘制细胞生长曲线和倍增时间。H2M采用第16代细胞,接种密度为7×104每平皿,计算方法同上。 1.5细胞核型分析 于培养的H2M和H4M细胞中加入0.3?滋g/ml的秋水仙素,继续培养3h,胰酶消化收获细胞,经0.07mmol/L氯化钾低渗处理30min,于1:3冰醋酸甲醇液固定2h后滴片,所获的中期分裂相染色体用标准胰酶-基姆萨(G带)分带染色法染色。 1.6比较基因组杂交 用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)消化培养的H2M和H4M细胞,抽提肿瘤细胞基因组DNA。取健康人周围血淋巴细胞制备基因组DNA作正常参照。从健康男性淋巴细胞培养中获取中期
常用细胞株
常用细胞株【转】 CHO-K1细胞 CHO-K1细胞是实验中非常常用的一个细胞株，在生物制 药中使用也非常广泛。该细胞株培养条件简单，贴壁强度适中， 比较容易转染，很适合用它来研究一般哺乳动物基因的功能。 来源：Cricetulus griseus (中国仓鼠) 卵巢形态：表皮细胞生 长特性：贴壁 注释：CHO-K1由CHO衍生而来，CHO是T. T. Puck 在1957年从一只成年中国仓鼠卵巢获得的（1）。 培养液：Ham's F12K （含2 mM L-谷氨酰胺，1.5 g/L NaHCO3），10% 胎牛血清。 传代：吸去培养液。用0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：4到1：8为宜，传代期间培养液更换1-2次） 冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。 1. Puck TT , et al. Genetics of somatic mammalian cells III. Long-term cultivation of euploid cells from human and animal subjects. J. Exp. Med. 108: 945-956, 1958. PubMed: 13598821 293细胞 293细胞比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基 因的细胞株。293细胞的一个衍生株：293T/17的转染效率更 高，成为广大研究者研究基因功能的一个强大工具。 293细胞的缺陷是生长过程中贴壁强度比较小。所以在实 验过程中容易流失，从而影响实验结果。如果一个实验室新得 到的293细胞是邮寄得到的并且细胞在培养瓶中，就需要让细胞沉降几天时间，因为大量细胞会漂浮在培养液里。 来源：人体肾脏形态：上皮细胞生长特性：贴壁注释：该细胞含腺病毒5 DNA 。 培养液： MEM（含 2 mM L-谷氨酰胺和Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸钠），10% 马血清（热灭活）。 传代：吸去培养液。用0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：2到1：4为宜，传代期间培养液2-3天更换1次） 冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。 vero细胞