猪瘟抗体ELISA检测方法之建立

豬瘟E2抗體ELISA檢測方法之開發及應用

豬瘟研究組

潘居祥副研究員

摘要

我國以LPC疫苗免疫來防範豬瘟的發生，測定豬瘟抗體力價，可評估疫苗保護效力亦可藉由小豬移行抗體高低狀況來調整豬瘟免疫適期。豬瘟抗體的檢測常以血清中和試驗作為金標準，但由於傳統血清中和抗體檢測法費時費力，需經細胞培養、病毒中和反應、螢光抗體染色及螢光顯微鏡下肉眼判讀等繁瑣步驟，需時3天，更無法應用於大量血清檢體的檢測。為提升豬瘟抗體檢測效能，本所與高雄醫學大學合作以哺乳類細胞株量產豬瘟病毒E2醣蛋白，開發間接型(Indirect)及阻斷型(Blocking) ELISA法檢測豬瘟抗體。新開發ELISA法操作簡便，僅需半天時間，更可應用於大量檢體的檢測。本試驗收集400支田間豬隻血清樣品測試自製豬瘟抗體ELISA檢測套組並與中和抗體力價比較相關性，進而評估ELISA檢測法應用於血清學監控之可行性，同時亦比較自製豬瘟抗體ELISA檢測套組與同類型商品化套組對豬瘟抗體力價檢測之相關性。結果顯示，自製間接型及阻斷型ELISA 套組檢測值與中和抗體力價間之相關係數r值分別為0.85及0.86。進一步分別與市售間接及阻斷型商品化套組比較檢測結果，其相關係數r值分別為0.88及0.94。綜上結果顯示，抗豬瘟E2抗體以間接型及阻斷型ELISA法檢測皆與中和抗體力價具有相關性。

Development and application of an ELISA test for the detection of E2 antibodies against classical swine fever virus

Chu-Hsiang Pan

Abstract

The Lapinized Philippines Coronel (LPC) vaccine is widely used in Taiwan to prevent classical swine fever (CSF). Furthermore, classical swine fever antibody titers are frequently used to assess immune response, vaccine efficacy, as well as enabling one to adjust the appropriate vaccine program by means of detecting the maternal antibody titer in piglets. The serum neutralization test (SNT) is considered as the “gold standard”for the detection of CSF antibody titers. However, traditional SNT is a time-consuming (3 days) and labor intesinve procedure, involving cell culture, serum-virus neutralization, fluorescent-antibody staining, and visual interpretation under fluorescence microscopy. On the other hand, the detection of CSF antibodies using ELISA is a relatively straight forward procedure and easily processed in order to enhance the efficiency of CSF antibody detection, we cooperated with the Kaohsiung Medical University using a mammalian cell line that produces high levels of the E2 CSF virus glycoprotein. We also developed indirect and blocking ELISA assays for the detection of antibodies against the CSF virus. A total of 400 serum samples collected from pig farms were tested by homemade indirect and blocking ELISA kits. The results were compared with the SNT titers for the purpose of evaluating the feasibility of the ELISA method for serological monitoring. Two homemade ELISA kits and two commercial ELISA kits were tested and analyzed. The results demonstrated that the correlation coefficient between SNT titer and the optical density (OD) values of the homemade indirect and blocking ELISA kits were 0.85 and 0.86, respectively. In addition, the correlation coefficient between the homemade ELISA kits and the commercially available indirect and blocking ELISA kits were 0.88 and 0.94, respectively. These results indicate that the level of anti-E2 antibodies which were detected by using the indirect and blocking ELISA tests were correlated with the antibody titers of SNT.

抗核抗体检测试剂注册技术审查指导原则

抗核抗体检测试剂注册技术审查指导原则 (征求意见稿) 本指导原则旨在指导注册申请人对抗核抗体( Antinuclear antibody ，ANA )检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审 评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则是对抗核抗体检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 抗核抗体作为自身免疫病( autoimmune diseases ，AID ) 重要的生物学标志，是临床应用中最广泛、最基础的一组自身抗体。临床常见于系统性红斑狼疮 ( Systemic Lupus Erythematosus ，SLE )、干燥综合征、系统性硬化病、混合结缔组织病及多发性肌炎/皮肌炎等系统性(非器官特异性) AID 患者。同时，ANA 可见于器官特异性AID 患者，如自身 免疫性肝病、自身免疫性甲状腺炎等。除此之外，ANA 也可见于慢性 感染性疾病及健康人群中 细胞核是ANA 靶抗原所在的最重要的结构部位，因此传统意义上的

ANA 是指抗细胞核抗原成分的自身抗体总称。随着检测技术的改进，尤其是培养细胞抗原基质（如HEp-2 细胞）的广泛应用，ANA 的定义扩展到以真核细胞各种成分（包括细胞核、细胞浆、细胞骨架蛋白及细胞分裂周期蛋白等）为靶抗原的自身抗体的总称。 目前，ANA 检测分成ANA 总抗体的检测和针对靶抗原的特异性自身抗体检测。其中，ANA 总抗体的检测方法主要包括间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence,IIF ）、酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ，ELISA ）等。ANA特异性自身抗体检测方法主要包括ELISA法、线性免 疫印迹法（line immunoassay,LIA ）、化学发光免疫分析法（c hemiluminescence immunoassay,CLIA ）等。 本指导原则所述抗核抗体检测试剂是指利用间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、化学发光法、线性免疫印迹法等基于抗原抗体反应原理，针对人血清、血浆样本中总抗核抗体或针对靶抗原的特异性自身抗体进行体外定性和/ 或半定量和/或定量检测的试剂。同时，本指导原则是针对抗核抗体检测试剂的通用指导原则，申请人应结合具体产品的特点进行申报。如果申报产品有具体指导原则，应参照执行。 本指导原则适用于进行注册申请和相关许可事项变更的产品。依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5 号）（以下简称《办法》）、《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管 2013 〕242 号），抗核抗体及针对靶抗原的特异性自身抗体检 测试剂属于自身抗体检测试剂，管理类别为□类6840。 二、注册申报资料要求注册申报资料的撰写应符合《办法》和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014 年第44 号）（以下简称44 号公告）

ELISA检测方法有哪些

ELISA检测方法有哪些？ 酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是研究蛋白抗体的重要方法。它是采用抗原与抗体的特异结合将被测物质与酶标抗体进行直接或间接结合，然后通过标记酶与底物产生颜色反应进行定性和定量分析。那么，它与其它检测方法的灵敏度及您了解吗？跟着小编往下看 ELISA通常分为四种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法等，直接上图： 直接法（Direct ELISA）仅需要抗原和酶标一抗，操作简便，可避免交叉反应，然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求，同时也并非所有的一抗适合标记处理。直接法在实际运用中并不多见，它并不能对样本中抗体进行定量分析，因为样本中抗体是非酶标抗体，无法进行后续显色，但是该法经过改进就是竞争性ELISA方法，见后文。 间接法（Indirect ELISA）使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。 夹心法（Sandwich ELISA）分为双抗体夹心法和双抗原夹心法： 双抗体夹心法中抗原被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体，结合于不同位点。捕捉抗体固定于载体上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的抗体需是单抗，而且对同一抗原结合位点不同，如此才能避免交叉反应或两种抗体竞争性结合同一位点。夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应（一步法），此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而不形成“夹心复合物”，

猪瘟抗体

精制克隆猪瘟抗体 一、英文名称：Classical Swine Fever antibody(cloned) 二、分子式：H2L2 分子量：145-185KD 三、质量标准：企业标准，≥200mg/ml； 四、突出特点 1、特异性直接中和猪瘟病毒； 2、刺激免疫系统，激活T细胞系统增强对病毒等异源微生物的触杀能力；刺激B细胞的粗面内质网，刺激产生二次应答， 激活和促进猪瘟抗体的大量合成；激活补体系统，调节和提高肌体免疫力； 3、纯度高、无杂病原、可常温保存； 4、效果稳定、使用过程中可以有明确的指标检测； 5、无过敏原、无残留、使用安全，不影响产品出口质量； 6、可以与各种抗生素联合使用； 7、吸收迅速； 8、分布广泛：能够遍部血液所及的部位，能够透过血脑和胎盘； 9、长效特性：一般使用后可保护3-7天； 10、给药方式多样：可以肌肉注射、也可静脉给药； 11、溶剂简单：水； 12、本品克隆分离、纯化、灭活、防酶解、保活性等程序技术和工艺为国际一流标准。 五、作用机理 能够特异性地与相应的猪瘟抗原结合，而直接中和并杀灭病原物，同时引导B、T淋巴系统产生更多的同类抗体，增强对病原物的记忆、识别水平、进一步提高肌体系统的主动防御能力，激活吞噬系统快速高效清除体内病原物，达到肌体净化之目的机能。这种特异性结合抗原特性是由其V区（尤其是V区中的高变区）的空间构成所决定的，抗原结合点由L链和H链超变区组成，与相应抗原上的表位互补，借助静电力、氢键以及范德华力等次级键相结合，由于不同抗原分子上有相同的抗原决定簇，或有相似的抗原决定簇，一种抗体可与两种以上的抗原发生反应，即：交叉反应，因此，本品还有杀灭类似病原微生物的能力，并且还有其它的效应作用： 1、调节炎症性细胞因子的合成和释放：Ig对某些细胞因子产生的调节是通过控制其转录水平而实现的，目前 已被证实的受这种转录调节的细胞因子有IL-6，TNF-γ，IL-1，IL-8，Ig与FcRs的作用还可导致细胞内第二信使环磷酸腺苷水平升高，从而激活环磷酸腺苷依赖的蛋白激酶的磷酸化，最终通过相应的信号传导途径调节细胞因子的产生.Ig中包含某些细胞因子的特异性中和抗体；2、调节补体的激活：Ig可结合补体C 3b ，C 4b 片段，阻断其与靶细胞的结合；3、促进内源性IgG的清除：内源性IgG水平的调节主要依赖于机体对其分解代谢的强弱. 当体内IgG水平增高时，过多的IgG与保护性受体FcRn结合，使IgG的分解加强，从而维持IgG的水平，这种清除作用已被广泛地应用于自身免疫性疾病的治疗；4、中和自身抗体（抗自身抗体功能）：自身免疫性疾病的发生是由于体内自身反应性B淋巴细胞产生大量的自身抗体作用于自身抗原，导致组织细胞的破坏.Ig含有正常动物体内的抗特异性自身抗体的抗体，可与自身抗体的可变区结合，从而减少与自身抗原的结合；5、中和上层抗原：上层抗原是来源于微生物的抗原物质，例如：葡萄球菌内毒素B（SEB），可激活T细胞，使其表达特异的T细胞受体Vβ序列，并有较强的亲和力，同时SEB与Ⅱ型主要组织相容性抗原复合物分子的某些区域相结合，上层抗原在主要组织相容性抗原复合物分子和T细胞受体分子间架起桥梁而进一步促进T细胞激活，同样可激活单核/巨噬细胞系统；6、调节淋巴细胞和单核细胞的增殖与凋亡： Ig可抑制淋巴细胞的增殖，这种作用主要是通过干扰调控细胞生长和死亡的基因表达来实现，此外，Ig对细胞因子网络的调节也对淋巴细胞的增殖产生正调节作用，例如IL-4水平的下降可抑制Th0细胞向Th2的分化，而IL-2的存在可以诱导T细胞的增殖和分化.因此Ig在体内可通过上调IL-2水平，下调T细胞增殖来维持T细胞数目的稳定； 7、Ig可通过间接作用使神经髓鞘修复：在胶质细胞及其前体细胞的抗体介导性的补体损伤过程中起着保护作用，它是通过抗体联合介导的，而不影响补体激活过程.这种对炎症过程的抑制作用，可能是Ig发挥髓鞘修复作用的基础；8、Ig具有脑组织的局部作用，对脑脊液有渗透性，因血管-神经屏障在神经根部及神经末端不完整，Ig可自由地在这些部位进入神经而发挥系统和局部的作用. 六、药动学特点 在体内迅速产生作用，动物给药后1h血浆中抗体蛋白浓度提高15-33%，活化补体，有效作用期可维持5-7天。 七、毒性实验结果 1、急性毒性实验表明：小鼠、大鼠口服、肌注、静脉注射的半数致死量LD50均在10000毫克以上/千克体重； 2、特殊毒性实验表明：单克隆猪瘟抗体无“三致”作用（致畸、致癌、致突变）及繁殖毒性。 八、临床应用： 1、猪瘟抗体对猪瘟发病的早、中期治疗效果确实； 2、在没有条件进行猪瘟抗体水平检测、猪瘟病毒感染阳性检测的猪场，一旦有病猪被确诊或疑似为猪瘟疾病的情况下，

HIV实验室ELISA检测方法

人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法） 1 试剂信息 试剂厂家：北京万泰生物药业股份有限公司 2 样本要求 2.1 本试剂使用样品为人血清或血浆，含有EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本实验。 2.2 不能检测含悬浮纤维蛋白或聚集物，重度溶血的样品。 2.3 样品中应无微生物，可在2-8℃储存1周，长期储存应低温冻存，避免反复冻融。 2.4 使用前请将样品室温平衡30分钟以上，冷冻样品实验前需混匀。 3 检测步骤 3.1 配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。 3.2 编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照1型、2型各1孔、空白对照1孔。 3.3 加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照100μL。 3.4 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.5 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。 3.6 加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。 3.7 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.8 洗板：操作同步骤5。 3.9 显色：每孔加入显色剂A、B液各50μL，轻轻震荡混匀，37±1℃避光显色30±1分钟。 3.10 测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。 4 参考值 临界值（CUTOFF）计算：临界值=阴性对照A均值+0.12. 5 检验结果的解释 5.1 阴性对照孔A值≦0.10，阳性对照A值≧0.80，否则试验无效。 5.2 若有1孔阴性对照A值大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照A值大于0.1，应重复试验。

5.3 阴性判定：样品A值<临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阴性。 5.4 阳性判定：样品A值≧临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阳性。（注意：初试阳性应重新取样双孔复试。复试阳性者应按《全国艾滋病检测技术规范》送HIV确证实验室进行确证实验。）

抗核抗体谱项检测项目收费标准及临床意义

抗核抗体谱（ANAs）检测项目及项目物价收费： 注明：项目编号3-2抗核提取物抗体测定，其中包含检测抗体（抗SSA、抗SSB、抗JO

－1、抗Sm、抗nRNP、抗ScL-70、抗着丝点抗体的测定） 该表中湛江及附院收费是参考2011年版的湛江物价局医疗收费及附院0212年收费，请核对并完善。 抗核抗体谱17s亚辉龙中标编号：3179998，中标价：T, 优惠价：T ，抗核抗体谱12S亚辉龙中标编号：3179999, 中标价格：T, 优惠价：T，抗核抗体谱8S亚辉龙中标编号：3180000 ，中标价格：T, 优惠价：T 项目的临床意义如下： 1.高滴度的抗U1-nRNP抗体是混合性结缔组织病（MCTD，夏普综合征）的标志， 阳性率为95-100％，抗体滴度与疾病活动性相关。在30-40％的系统性红斑狼疮患 者中也可检出抗U1-nRNP抗体，但几乎总伴有抗Sm抗体。 2.抗SmD1抗体是系统性红斑狼疮的特异性标志，与抗dsDNA抗体一起，是系统性 红斑狼疮的诊断指标，但阳性率仅为5-10％。 3.抗SS-A（Ro60）抗体最常见于干燥综合征（40-80％）、也见于系统性红斑狼疮 （30-40％）和原发性胆汁性肝硬化（20％）中，偶见于慢性活动性肝炎。此外， 在100％的新生儿红斑狼疮中可出现抗SS-A抗体。该抗体可经胎盘传给胎儿引起 炎症反应和新生儿先天性心脏传导阻滞。 4.抗SS-A（Ro52）抗体在自身免疫性疾病中是一个非特异性指标，与多种自 身免疫性疾病都有相关性，在很多疾病处于稳定期、控制好的情况下会 显示阴性；如果阳性会提示复发或者优先于其它指标预警，起到预防提 示作用。此指标合并其它指标阳性，常会提示预后不好。 5.抗SS-B抗体几乎仅见于干燥综合征（40-80％）和系统性红斑狼疮（10-20％）的 女性患者中，男女比例为29:1。在干燥综合征中抗SS-A抗体和抗SS-B抗体常同 时出现。 6.抗Scl-70抗体见于25-75％的进行性系统性硬化症（弥散型）患者中，因实验方法 和疾病活动性而异（Scl=硬化症）。在局限型硬化症中不出现。 7.抗Jo-1抗体见于多肌炎，阳性率为25-35％。常与合并肺间质纤维化相关。 8.1977年，Wolfe及其同事首先在多肌炎病人中描述了抗PM-Scl抗体，并把该抗体 叫做抗PM抗体。在1984年，Reichlin与其同事经过研究，发现了抗PM-1抗体的 更准确的特征和命名（抗PM-Scl抗体）。在50-70%的所谓的重叠综合征患者中可 检出这些抗体，在这些患者中可合并出现多肌炎（PM）、皮肌炎（DM）和进行性 系统性硬化症（Scl）。抗PM-Scl抗体在进行性系统性硬化症（弥散型）中的阳性 率为3%，在多肌炎和皮肌炎中的阳性率为8%。 9.抗着丝点抗体与局限型进行性系统性硬化症（CREST综合征：钙质沉着、Raynaud’s 病、食管功能障碍、指硬皮病、远端血管扩张）有关，阳性率为70-90%。 10.抗PCNA抗体对系统性红斑狼疮具有很高的特异性，但其阳性率仅为3％ 11.抗dsDNA抗体对系统性红斑狼疮具有很高的特异性。除抗Sm抗体外，抗dsDNA 抗体也可作为该病的一个血清学指标，阳性率为40-90%。

猪瘟知识大全

一、猪瘟 猪瘟俗称“烂肠瘟”，为区别非洲猪瘟又称古典猪瘟。猪瘟在各国都有不同程度的流行，发病率和死亡率均很高，危害极大，本病仍是威胁养猪业最重要的传染病。我国将其定为一类烈性传染病。目前，其表现形式有急性、亚急性、慢性、非典型性或不明显型等类型，给诊断带来很大的困难。 猪瘟是一种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病。传染性极强，可感染各种年龄的猪只，一年四季都可发生。其特征为发病急，高热稽留和细小血管壁变性，引起全身泛发性小点出血，脾梗死。急性猪瘟由强毒引起，发病率和死亡率很高；而弱毒感染常因其不表现临床症状则可能不被觉察。 1、病原：猪瘟病毒(HCV)属于黄病毒科，瘟病毒属。与牛粘膜病病毒、马动脉炎病毒有共同抗原性。HCV与同属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)之间，基因组序列有高度同源性，抗原关系密切，既有血清学交叉反应，又有交叉保护作用。 2、流行病学：猪是本病惟一的自然宿主，各种猪对猪瘟病毒都有易感性。 3、发病机理：猪瘟病毒进入靶器官扁桃体后，在其中增殖，16－18h血液中病毒浓度达到致病程度，15－24h病毒出现于淋巴系统和血管壁，48h出现于各实质器官。病毒主要在小血管内皮细胞增殖，致使上皮细胞肿胀、变性、血管闭锁、小血管周围发生细胞浸润，导致各器官和组织充血、出血、坏死和梗死，并引起败血症，体温升高。最急性病例，往往发生循环障碍。 在急性感染猪中，由于HCV损害造血系统和网状内皮，引起血液中白细胞减少、网状细胞逐渐消失，免疫应答发生改变，对溶菌酶的继发性抗体应答能力减弱，这样机体内细胞吞噬能力显著下降，容易引起多种病原继发混合感染，使猪瘟病程复杂化。

猪瘟病毒持续性感染多由低毒力毒株感染引起慢性型和迟发型猪瘟两种。前者猪瘟传播较慢、血液和器官中病毒滴度较低，病毒存在于扁桃体、唾液腺、回肠和肾脏的上皮细胞。循环病毒抗原和抗体可导致应答物在肾沉着，引起肾小球肾炎。后者在病猪一生都有高滴度的病毒血症，病毒在上皮组织、淋巴样组织及网状内皮组织中广泛存在。先天性持续感染猪对HCV不产生中和抗体应答，形成免疫耐性。 4、症状：自然感染潜伏期为5－7d，长的21d。人工感染强毒株，一般在3－6天体温升高。根据临床症状和特征，猪瘟可分为急性（最急性、急性及亚急性）、慢性、迟发性和非典型性（温和型）或不明显型等类型。 急性型猪瘟：由HCV强毒引起，开始时猪群内仅几头显示临床症状，表现呆滞，被驱赶时站立一旁，呈弓背或怕冷状，或低头垂尾。同时食欲减少，进而停食。病猪体温升高至41℃左右，高的可达42℃以上。体温上升的同时白细胞数减少，约为9000/mm3，甚至低达3000/mm3。少数病猪可发生惊厥，常在几小时内，至多几天内死亡。随着病情的发展，群内更多的猪发病，最初的病猪出现步态不稳等衰弱症状，随后通常发生后肢麻痹。病初的皮肤充血，到病的后期变为紫绀或出血，以腹下、鼻端、耳根和四肢内侧等部位为常见。 最急性型：突然发病，高热达41℃左右，可视粘膜和皮肤有针尖大密集出血点，病程l－3天，死亡率达100%。较为少见，多发于新疫区或未经免疫的猪群。 急性型：病猪精神沉郁，减食或厌食，伏卧嗜睡，常堆睡一起，呈怕冷状。全身无力，行动迟缓，摇摆不稳。体温达41℃以上稽留不退，死前降至常温以下。初期眼结膜潮红，后期苍白，眼角处初期有多量粘液，后期转为脓性分泌物，呈褐色而粘着两眼，严重时眼睑完全被封。体温升高之初，病猪便秘，排出粪球状，附有带血的粘液

ELISA检测

ELISA检测 ----- 固相捕获法测IgM抗体 在病原体急性感染的诊断中，通常需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM检测和TORCH项目的系列IgM检测等。IgM抗体也有使用间接法测定的，如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。在使用间接法测IgM抗体时，由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。 因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。具体操作步骤如下： 1．首先将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。 2．加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。 3．加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一定时间后洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。 4．加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。 5．加入酶底物，温育显色测定 本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(1gM类)由于其能与固相抗人u 链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应。而非特异IgM由于其

抗核抗体介绍

抗核抗体介绍 抗核抗体在多种自身免疫病中均呈不同程度的阳性率，如系统性红斑狼疮（SLE，95% ~100%）、类风湿性（RA，10%~20%）、混合性结缔组织病（MCTD，80%~100%）、干燥综合症（SjS,10%~40%）、全身性硬皮病（85%~90%）、狼疮性（95%~100%）、原发性胆汁性肝硬化（95%~100%）等，但经皮质激素治疗后，阳性率可降低。抗核抗体在类人中约有20％～50％IgG型ANA呈阳性，小儿类风湿ANA的阳性率约19％～35％，伴发虹膜睫状体炎者阳性率高（505~90%），故ANA阳性预示类风湿有发生慢性睫状体炎的可能。已发现75％类风湿病人有多形核白细胞的特异性ANA或抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）可使白细胞核受到破坏。 抗核抗体是一组对细胞核内的DNA，RNA，蛋白或这些物质的分子复合物的自身抗体。按其核内各个分子的性能不同可将各ANA区分开来，如(一)抗DNA抗体，（二）抗组蛋白抗体，（三）抗非组蛋白抗体，（四）抗核仁抗体等。每一大类又因不同抗原特性而再分为许多种类。因此ANA在广义上是一组各有不同临床意义的自身抗体，更确切的名称应为抗核抗体谱。ANA 主要存在于IgG，也见于IgM、IgA，甚至LgD及LgE中。 常见的核免疫荧光杭核抗体试验有以下几种图形：（1）均质型：核质染色均匀一致，这种染色型常与抗组蛋白和抗DNA抗体有关；（2）斑点型：核质染色呈斑点状，抗可提取性核抗原（ENA）抗体常呈这种染色型；（3）周边型：荧光染色围绕在核膜周围，它与抗DNA抗体有关；（4）核仁型：仅有核仁染色，具有抗4-6sRNA抗体呈现这种染色型；（5）着丝点型：在体外培养的细胞株（喉癌细胞）在核分裂相期时，可见到荧光染色的着丝点排列成特殊图型，而在鼠肝做底物中看不到此类图型，而被遗漏。 抗核抗体的分类，由于核抗原不同，有多种不同的ANA 。 抗DNA抗体 抗DNA抗体有抗双链DNA（ds DNA）和抗单链(ss DNA)抗体之分。抗ds DNA抗体与S LE的关系密切，且随疾病的活动度而升降，病情好转者其滴度多下降甚或转阴。抗ss DN

母猪胎次对猪瘟抗体水平的影响

母猪胎次对猪瘟抗体水平的影响 猪瘟( Classical Swine Fever，CSF)是猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪的急性、烈性、接触性传染病，属国际重点检疫动物疫病之一，我国将此病列为一类动物疫病。1956年周泰冲等研制成功的中国系（C系）猪瘟兔化弱毒疫苗是我国一直使用的唯一疫苗株日。而该疫苗是国际公认的最佳疫苗，很多欧亚国家采用了C系弱毒苗有效地控制了猪瘟流行，因此免疫接种仍是防治猪瘟的主要措施，目前我国主要通过接种猪瘟兔化弱毒疫苗来控制猪瘟，这种以防为主的防制方针，大大降低了猪瘟的感染率和发病率。但近年来随着养殖业的发展，养猪规模的增加和养殖技术水平的提高，该病又有严重发生或流行的迹象。许多猪场较合理的使用了猪瘟疫苗，但是由于免疫失败，猪瘟还是呈散发性流行，病程由急性变为慢性，出现持续性感染、胎盘感染、新生仔猪先天性感染，表现为死亡、免耐受或无明显症状的带毒猪。 母猪持续感染和仔猪胎盘感染是目前引起猪瘟免疫失败的最重要原因。国家猪瘟参考实验室首次成功地利用猪瘟野毒人工复制了猪瘟病毒持续感染的带毒母猪动物模型，证实了这种母猪带毒时间可持续750d，甚至终生带毒、排毒。这些母猪产下的仔猪多为先天免疫耐受猪，经胎盘感染出生后存活的仔猪往往成为持续感染者，不断向外界环境排毒，而本身并不表现任何临床症状，导致猪瘟在猪场中形成反复恶性循环，即猪瘟亚临床感染一胎盘感染一母猪繁殖障碍一仔猪带毒一后备母猪一亚临床感染，使得带毒猪在临床中有3%~33%的带毒率。研究还显示低水平的母源抗体不能抵抗猪瘟野毒感染，因此及时监测母源抗体滴度，结合群体抗体水平制定适合猪场的猪瘟免疫程序具有重要的意义。 当前，防止猪瘟恶性循环的核心是保证后备猪群和种猪群（包括种公猪）猪瘟抗体合格，培育出健康、合格的仔猪。本研究为了评价母猪胎次对猪瘟疫苗免疫敖果的影响，我们选取了一个大型规模化猪场，对种用母猪逐头采血，分离血清，用IDEXXELISA猪瘟抗体检测试剂盒进行测定，结合检测结果对所检猪场猪瘟抗体不合格的种猪重新接种猪瘟疫苗，4周后再检测其猪瘟抗体，观察母猪胎次对猪瘟抗体合格率的影响。 1材料与方法 1.1血清来源与份数采集福建省大型规模化猪场全部种用母猪（经产母猪和后备母猪）1290头，进行耳静脉采血，按常规方法分离血清，最后再用IDEXX ELISA猪瘟抗体试剂盒检测猪瘟抗体：随后对猪场猪瘟抗体不合格的350头种猪进行加强免疫猪瘟疫苗，28—30d后再次检测猪瘟抗体。血清按常规方法分离血清，并及时进行检测，检测后置-20℃冰箱保存。

ELISA检测方法

ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。 基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。

②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。 注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。

猪瘟抗体检测

猪瘟病毒IgG抗体检测ELISA试剂盒使用说明书 【产品简介】 猪瘟病毒（CSFV）是目前危害国内养猪业一种高发病率、高死亡率和高度接触传染的病毒。在猪的免疫预防工作中,最值得关注的就是强化免疫的接种时机问题。在过高的抗体水平进行免疫,过高的抗体水平还会中和疫苗,影响疫苗的免疫效果,导致免疫失败；在较低的抗体水平进行免疫,又会出现抗体保护真空期,威胁猪的健康。该试剂盒检测反映抗体水平，利于指导免疫时机。 【使用时间】 ①猪瘟病毒疫苗免疫后免疫效果监测 ②平时的抗体监测 【检测原理】 包被经纯化的猪瘟病毒，抗猪IgG抗体作为酶标记抗体，利用间接法来检测被检材料中是否含有猪瘟病毒抗体。 【产品内容】 1. 猪瘟病毒抗原包被微孔板条96Tx2 2. 酶标记物22ml×1 3. 样品稀释液20ml×1 4. 显色剂A 12 ml×1 5. 显色剂B 12 ml×1 6. 洗涤液（用前1：25稀释）25 ml×1 7. 猪瘟病毒抗体阳性对照血清 1.5 ml×1 8. 猪瘟病毒抗体阴性对照血清 1.5 ml×1 9. 终止液12 ml×1 10. 封口膜6张 11. 密封袋1个

12. 说明书1份 【操作步骤】 1. 使用前将试剂盒置室温30分钟，恢复至室温。 2. 取所需用量包被微孔板条，设空白、阴性及阳性对照各2孔，未用的板条尽快密封，2～8℃保存。 3. 阴性、阳性对照孔分别加阴性、阳性对照血清100μl（阴阳性血清不用稀释，直接使用）；样品孔每孔先加样品稀释液90μl，再加样品10ul（或样本1：10稀释后加100μl）；空白对照孔不加。 4. 混匀，置37℃温浴30分钟。 5. 扣去孔内液体，每孔加满洗涤液，静置60秒后弃去，重复洗涤5次，拍干。 6. 每孔加酶标记物100μl（空白孔除外）。 7. 置37℃温浴30分钟。 8. 洗涤，同步骤5。 9. 每孔依次加显色剂A、显色剂B各50μl，混匀，37℃避光反应10分钟。 10. 每孔加终止液50μl，混匀，置酶标仪450nm处测各孔A值（建议用双波长450nm、630nm）。 【结果判定】 1. 阴性对照：正常情况下，阴性对照孔A值≤0.1； 2. 阳性对照：正常情况下，阳性对照孔A值≥0.4； 3. 临界值（C.O.）的计算：临界值=0.15+阴性对照孔均值；所有阴性、阳性对照和样品的A值均须减去空白平均值后作为计算值；阴性对照孔A值大于0.10时应舍弃，如所有阴性对照孔A值都大于0.10时须重复实验；阴性对照孔低于0.05时以0.05计算。 4. 结果判定：检测标本A450值≥临界值判定为本试验阳性；检测标本A450值＜临界值判定为本试验阴性。 【注意事项】 1. 操作时必须戴手套，穿工作衣，严格健全和执行消毒隔离制度。 2. 试验结果的判定必须以酶标仪读数为准。 3. 样品稀释液应用加液器加注，并经常校对其准确性。 4. 洗涤时各孔均需加满液体，防止孔口有游离酶不能洗净。 5. 所有样品洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 6. 微孔板从冷藏环境中取出时应在室温中平衡至潮气干尽后方可，未用完的微孔板须放入有干燥剂的密封袋中保存。

临床医学检验基础知识讲解：抗核抗体检测方法

ANA的检测方法 由于ANA的复杂性及多样性，故测定方法繁多。目前ANA常用的方法有免疫荧光法、放射免疫法、ELISA、免疫双扩散、对流免疫电泳及免疫印迹技术等。 1.免疫荧光法检测血清总ANA最常用的方法是荧光免疫组化法。多用小鼠肝切片或印片作为细胞核基质，结果比较稳定可靠，在荧光显微镜下见到的细胞核有荧光着色为阳性反应。如将患者血清先进行不同比例的稀释，可以做大致的定量试验，在1：80稀释仍然虽阳性时，对SLE的诊断有较大的参考价值。在油镜下观察结果，可以将ANA阳性的荧光现象分成4种主要的荧光核型，核型的确定对临床诊断有进一步的参考价值。①周边型表示抗DNA抗体存在；②均质型表示有抗DNP抗体；③斑点（颗粒）型多为抗ENA抗体；④核仁型多为抗核小体抗体。SLE患者常出现周边型、匀质型或混合型，斑点型多见于混合结缔组织病，而硬皮病多为核仁型；周边型对SLE有较高的特异性。 近年有人用锥虫或血鞭毛虫（例如绿蝇短膜虫试验）作基质测定抗dsDNA抗体，因为这些血寄生虫的动基体内含大量的纯dsNDA，无其他抗原干扰；在阳性结果时，可见鞭毛一端的动基体显示清晰的荧光。因此该试验用于测定抗dsDNA抗体具有特异性强和敏感性高的优点。另外，短膜虫对人畜无害，可以人工养殖，来源方便，值得推广。 2.放射免疫法常用检测抗DNA抗体，有Farr法及过滤法。①Farr法的原理为用同位素标记DNA，被标记的DNA和被检血清的抗DNA抗体结合，经50%硫酸铵饱和液沉淀，然后比较沉淀物和上清液中的放射活性，从而得出DNA结合活性，一般结合率大于20%为阳性。②过滤法是在分离结合物时用纤维素酯薄膜滤器（孔径为0.45μm）进行过滤，游离的DNA被滤去而与抗体结合的复合物被阻留在滤膜上。 3.ELISA临床上主要是应用间接ELISA检测抗dsDNA抗体，其重复性及敏感性均较对流免疫电泳及双扩散为高。目前已有试剂盒供应。 4.免疫印迹（immunoblotting）先将混合抗原作凝胶电泳，分离开不同的区带，然后将这些带转印到硝酸纤维素膜上，最后用酸标抗体或放射性同位素标记抗体进行检测和分析（方法见第十五章）。由于该试验不需纯化的单个抗原，可在同一固相上作多项分析检测，灵敏度高，特异性强。故目前已广泛用于自身免疫病患者血清中多种自身抗体的检测，如检测抗Sm抗体、抗RNP抗体、抗SS-A抗体及SS-B抗体等。 另外，还可用传统的琼脂双向扩散法、对流免疫电泳法、间接血凝法和补体结合试验等。这些试验要求的实验条件比较低，但敏感性也比较低。 1 2 下页

猪瘟知识大全知识讲解

猪瘟知识大全

一、猪瘟 猪瘟俗称“烂肠瘟”，为区别非洲猪瘟又称古典猪瘟。猪瘟在各国都有不同程度的流行，发病率和死亡率均很高，危害极大，本病仍是威胁养猪业最重要的传染病。我国将其定为一类烈性传染病。目前，其表现形式有急性、亚急性、慢性、非典型性或不明显型等类型，给诊断带来很大的困难。 猪瘟是一种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病。传染性极强，可感染各种年龄的猪只，一年四季都可发生。其特征为发病急，高热稽留和细小血管壁变性，引起全身泛发性小点出血，脾梗死。急性猪瘟由强毒引起，发病率和死亡率很高；而弱毒感染常因其不表现临床症状则可能不被觉察。 1、病原：猪瘟病毒(HCV)属于黄病毒科，瘟病毒属。与牛粘膜病病毒、马动脉炎病毒有共同抗原性。HCV与同属的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)之间，基因组序列有高度同源性，抗原关系密切，既有血清学交叉反应，又有交叉保护作用。 2、流行病学：猪是本病惟一的自然宿主，各种猪对猪瘟病毒都有易感性。 3、发病机理：猪瘟病毒进入靶器官扁桃体后，在其中增殖，16－18h血液中病毒浓度达到致病程度，15－24h病毒出现于淋巴系统和血管壁，48h出现于各实质器官。病毒主要在小血管内皮细胞增殖，致使上皮细胞肿胀、变性、血管闭锁、小血管周围发生细胞浸润，导致各器官和组织充血、出血、坏死和梗死，并引起败血症，体温升高。最急性病例，往往发生循环障碍。 在急性感染猪中，由于HCV损害造血系统和网状内皮，引起血液中白细胞减少、网状细胞逐渐消失，免疫应答发生改变，对溶菌酶的继发性抗体应答能力减弱，这样机体内细胞吞噬能力显著下降，容易引起多种病原继发混合感染，使猪瘟病程复杂化。

ELISA 直接法与间接法的区别

ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不类型的检测方法. ELISA可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。 主要有以下几种类型:（直接法也称一步法） 1 双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下: 1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质. 2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质. 3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关. 4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测. 在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见 1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应. 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题. 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心. 2 双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法. 3 间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法.其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固

Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题

Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题 酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种实验室常用的检测方法，广泛应用于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。与其他基于抗体的检测方法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和非特异性相互作用的分离，并可通过最终有色产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。 ELISA 实验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以及组织裂解物等为样品。该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测方法。 该实验可迅速分析大量平行样品，在基础研究和临床诊断实践中广泛使用。 一、直接ELISA 原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。加酶标抗体进行孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反应。直接法主要用于测定抗原。 优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。 缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高。 二、间接法ELISA

原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，加酶标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，加底物显色。 优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗；不直标一抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使用标记抗体更少。 缺点：交叉反应几率升高。 三、双抗夹心法ELISA 原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。加入待检样品，保温孵育。样品中的特异性抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体（检测抗体）保温孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。加底物反应。 双抗原夹心法测抗体的反应模式与测抗原相似，用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。

抗核抗体谱17项检测项目收费标准及临床意义

抗核抗体谱(ANAs)检测项目及项目物价收费: 注明:项目编号250402003-2抗核提取物抗体测定,其中包含检测抗体(抗SSA、抗SSB、抗JO－1、抗Sm、抗nRNP、抗ScL-70、抗着丝点抗体得测定) 该表中湛江及附院收费就是参考2011年版得湛江物价局医疗收费及附院0212年收费,请核

对并完善。 抗核抗体谱17s亚辉龙中标编号:,中标价:133、00/T, 优惠价:120、00/T , 抗核抗体谱12S亚辉龙中标编号:, 中标价格:120、83/T, 优惠价:96、00/T,抗核抗体谱8S亚辉龙中标编号: ,中标价格:99、00/T, 优惠价:70、00/T 项目得临床意义如下: 1.高滴度得抗U1-nRNP抗体就是混合性结缔组织病(MCTD,夏普综合征)得标志,阳性 率为95-100％,抗体滴度与疾病活动性相关。在30-40％得系统性红斑狼疮患者中也 可检出抗U1-nRNP抗体,但几乎总伴有抗Sm抗体。 2.抗SmD1抗体就是系统性红斑狼疮得特异性标志,与抗dsDNA抗体一起,就是系统性 红斑狼疮得诊断指标,但阳性率仅为5-10％。 3.抗SS-A(Ro60)抗体最常见于干燥综合征(40-80％)、也见于系统性红斑狼疮(30-40％) 与原发性胆汁性肝硬化(20％)中,偶见于慢性活动性肝炎。此外,在100％得新生儿红 斑狼疮中可出现抗SS-A抗体。该抗体可经胎盘传给胎儿引起炎症反应与新生儿先 天性心脏传导阻滞。 4.抗SS-A(Ro52)抗体在自身免疫性疾病中就是一个非特异性指标,与多种自 身免疫性疾病都有相关性,在很多疾病处于稳定期、控制好得情况下会显 示阴性;如果阳性会提示复发或者优先于其它指标预警,起到预防提示作 用。此指标合并其它指标阳性,常会提示预后不好。 5.抗SS-B抗体几乎仅见于干燥综合征(40-80％)与系统性红斑狼疮(10-20％)得女性患 者中,男女比例为29:1。在干燥综合征中抗SS-A抗体与抗SS-B抗体常同时出现。 6.抗Scl-70抗体见于25-75％得进行性系统性硬化症(弥散型)患者中,因实验方法与疾 病活动性而异(Scl=硬化症)。在局限型硬化症中不出现。 7.抗Jo-1抗体见于多肌炎,阳性率为25-35％。常与合并肺间质纤维化相关。 8.1977年,Wolfe及其同事首先在多肌炎病人中描述了抗PM-Scl抗体,并把该抗体叫做 抗PM抗体。在1984年,Reichlin与其同事经过研究,发现了抗PM-1抗体得更准确 得特征与命名(抗PM-Scl抗体)。在50-70%得所谓得重叠综合征患者中可检出这些 抗体,在这些患者中可合并出现多肌炎(PM)、皮肌炎(DM)与进行性系统性硬化症 (Scl)。抗PM-Scl抗体在进行性系统性硬化症(弥散型)中得阳性率为3%,在多肌炎与 皮肌炎中得阳性率为8%。 9.抗着丝点抗体与局限型进行性系统性硬化症(CREST综合征:钙质沉着、Raynaud’s 病、食管功能障碍、指硬皮病、远端血管扩张)有关,阳性率为70-90%。 10.抗PCNA抗体对系统性红斑狼疮具有很高得特异性,但其阳性率仅为3％ 11.抗dsDNA抗体对系统性红斑狼疮具有很高得特异性。除抗Sm抗体外,抗dsDNA抗 体也可作为该病得一个血清学指标,阳性率为40-90%。 12.在系统性红斑狼疮患者血清中可检出抗核小体抗体,但就是,由于用传统得核小体制