铁皮石斛 组织培养 栽培 试验 实验
铁皮石斛茎段组织培养与栽培
摘要: 为试验铁皮石斛茎段组织培养与栽培，以铁皮石斛茎段为外植体，结合铁皮石斛的生物学特性，综述铁皮石斛组织培养与栽培的过程技术。观察研究基本培养基、天然附加物和植物生长调节剂对铁皮石斛生长的影响。验证和探究铁皮石斛茎段组织培养技术并对铁皮石斛的组织培养与栽培管理技术进行了思考与展望。
关键词: 铁皮石斛; 组织培养; 茎段; 移栽; 驯化
0.引言
铁皮石斛( Dendrobium officinale Kimura et Migo) 是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw．)多年生草本植物，又名黑节草，俗称铁皮枫斗，分布于云南、安徽、贵州、浙江、江西、广东和广西等地，是我国传统名贵珍稀中药材，其有效成分主要为石斛多糖、石斛碱、氨基酸等，其中石斛多糖的含量高达21.7%，能显著提高机体免疫功能，具有养胃出津、补肾益力、滋阴清热、耐缺氧、抗疲劳、抗肿瘤等功效。现代药理学研究发现，石斛还具有抗衰老和扩张血管的作用。
铁皮石斛喜荫凉、湿润的环境，常附在高海拔悬崖峭壁或林内树干和岩石缝隙中。由于其药用价值高、生长条件特殊和分布受局限，且经长期人为采挖，野生资源濒临灭绝。铁皮石斛是2005版《中华人民共和国药典》收载的3种石斛属植物之一，为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛蒴果成熟时易开裂，且种子粒径小，自然繁殖率低，是一种珍稀的药用植物和和名贵的室内观赏植物.。
铁皮石斛自然繁殖力极低, 常规繁殖又较困难, 且多年来对铁皮石斛的采集量远大于其生长量, 野生铁皮石斛自然繁殖已濒临绝迹。由于药用价值高，人为的过度开采与生态破坏，野生铁皮石斛已濒临灭绝，1987年国务院将其列为国家重点保护植物。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
野生云南铁皮石斛，取材于浙江农林大学组培实验室，取其茎段作为外植体进行组织培养。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 外植体消毒
取铁皮石斛的茎，去除多余叶片后用解剖刀将茎切成含 3 ～ 4 个节点的茎段，保留节点。依次用中性洗涤剂清洗，自来水冲洗20min，用70% 的乙醇浸泡10 ～60 s，再转入0. 1% 的氯化汞中，灭菌 5 ～11 min 后倒去氯化汞溶液，用无菌水反复漂洗材料3-5 次。用无菌纸吸去茎段上多余水分，将其切成1 ～2 cm 带一个芽点的茎段，接种到培养瓶中培养。
1. 2. 2 培养基制备
铁皮石斛培养基均添加3% 蔗糖，0. 7% 琼脂，pH 值为5. 8。按不同目的在基本培养基中加入6-BA、NAA、IBA，每个培养瓶分装50 m 培养基，密封。经过121 ℃高温灭菌25 min。不定芽的诱导培养基是在基本培养基MS 中加入细胞分裂素和生长素，采用不用浓度水平的NAA 和6-BA。组培苗的壮苗与生根，将生长状态稳
定的试管苗接种于添加不同激素组合的1/2 MS 培养基上。
(1)诱导培养基: ①MS+6-BA0.5mg／I。+NAA 0.05mg／L+AC(活性炭)29／L；
②MS+6-BAl．0mg／L+NAA0．1mg／L+AC29／L。
(2)增殖培养基: 花宝3号39／L+6一BA2．5mg／L+NAA0．25mg ／I。+AC29／L。
(3)生根培养基:1／2 MS+IBA0．5mg／L+AC29／L。培养基中添加蔗糖209／L，pH5．2～5．4
1. 2. 3 培养条件
接种铁皮石斛培养材料的组培苗在组织培养室中培养，培养温度为( 26 ±2) ℃，光照14 h/d，光强1 500 ～2 000 lx。
1. 2. 4诱导培养
用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基①中进行培养。15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织。继续培养20天后，转入培养基②中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物。
1. 2. 5增殖培养
将诱导形成的原球茎转入到增殖培养基中，原球茎增殖速度很快，增殖倍数可达3～4倍，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，原球茎的增殖与芽分化同时进行。
1. 2. 6 生根培养
取诱导形成的不定芽，要求芽高2 ～3 cm，带3 ～5片叶的不定芽，将其接种到不同处理的生根培养基上，进行培养。培养30天左右，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根，随后逐渐伸长，生根率达到90％以上。
2.移栽与驯化
2.1移栽前的准备
2.1.1炼苗
当苗高3cm以上、具3～4片叶时，便可炼苗。移栽前先将瓶苗至炼苗房进行2~3周的炼苗，让瓶苗从封闭稳定的环境向开放变化的环境过渡，慢慢适应自然环境，等瓶苗生长健壮、叶色正常，根长3cm以上，肉质茎有3~4个节间、长有4~5片叶，叶色正常，根长3cm以上，有4~5条根，根皮色白中带绿，无黑色根，无畸形，无变异。
炼苗目的：
炼苗的主要目的是使组培苗适应外界的环境——温差，湿度差以及微生物环境。
炼苗方法：
1）将待炼苗的材料放置于欲移栽的环境，不开盖保持4-5天；
2）半开盖保持1-2天后，全开盖再炼苗2-3天
2.1.2出瓶
组培苗出瓶时，打开瓶塞将培养基与小苗一起轻轻取出，整齐放置于盆中待清洗，污染苗、裸根苗或少根苗分别放置。正常组培苗先
在自来水中洗净培养基，特别要洗掉琼脂，以免琼脂发霉引起烂根，再换自来水清洗一次。裸根或少根组培苗经过上述清洗后，还需将小苗根部置于100mg/L的ABT生根粉中浸泡15分钟，以进行生根诱导。污染苗经过清洗后，用1000倍多菌灵浸泡整株小苗10分钟。后期管理得当可有效控制污染的发生。栽种于已灭菌的基质中(移栽前浇透水)，放置在遮光度50％～60％、湿度达80％以上的温室中，2个月后，成活率达90％以上。
2.1.3基质的准备
移栽铁皮石斛组培苗要选择适宜的基质。铁皮石斛的根是气生根，有明显的好气性和浅根性，因此，要求基质以疏松透气、排水良好、不易发霉、无病菌和害虫潜藏者为宜。可以选择水苔、石灰石、碎砖、树皮、刨花、蕨根、板边、菌糠、木糠等为移栽基质。
铁皮石斛不宜深植，种植时根系向四周均匀展开，将基质填充根部、基部必须露出，否则易造成烂根。移栽后隔5天再浇水效果较好。30天内每隔1天喷雾1次，水量不宜过多，期间勿施肥，待小苗恢复正常生长后才开始常规的水肥管理。
2.1.4栽培场地的选择
铁皮石斛喜温暖、多雾、微风、清洁、散射光环境，忌阳光直射和曝晒。在移栽过程中要创造条件，为铁皮石斛创造最佳的生长环境。铁皮石斛原产区大多处于温带和亚热带，全年气候温暖、湿润，冬季气温在0℃以上。根据铁皮石斛的生长习性，要考虑场地的光照、温度、湿度、通风等自然因素。笔者认为最好选择在大棚内移栽，而且
要移栽在高架畦，这样容易满足铁皮石斛生长的最佳环境要求，而且很多自然因素容易控制。在建造育苗大棚时要满足以下三个条件：（1）育苗大棚要通电、通水、通路，要求棚宽6m、长30m、棚肩高107m以上、棚顶高2.8m以上，棚顶覆盖塑料无滴薄膜和70%遮荫度的遮荫网，棚内安装有自来水管，大棚四周和入口装有40目的防虫网。有条件的，棚内还要装有自动或手动控制的喷雾系统（最好既能喷雾，又能喷肥、喷药），这样可以防晒、防雨、防虫、保温、保湿、透气，还能大大减少劳动量。
（2）棚内搭建畦底架空的高架种植畦。可用角钢、砖头、木条或方条等材料作为种植畦的框架，然后铺设孔径为0.3~0.5cm的塑料平板作为栽培基质的支撑面，要求畦宽1~1.2m，畦长度可自定，畦底架空高度30~50cm。种植畦上方装有可随时喷雾的喷头，喷雾饿时间最好能控制。没有条件的，也可以用喷雾器来代替。搭建高架种植畦的目的是为了使水分和透气容易控制，从而为组培苗生长提供最佳水分，保证通风透气，又能同时喷肥喷药，移栽成活率高，大面积移栽时能大大节省劳动力。
（3）在种植畦上铺5~8cm厚的基质，摊平。移栽前用0.3%高锰酸钾或1000倍多菌灵药液对基质喷洒消毒。
2.2移栽
2.2.1移栽时间
移栽最佳季节应为日平均气温在15~30℃时，气温过低或过高均不宜出瓶移栽。一般来说，在铁皮石斛主产地，除了最冷的1-2月以
及最热的7-8月外均可栽培。部分高海拔地区，除了12月至次年3月，其余时间均可栽培。
2.2.2移栽方法
用镊子将组培苗小心取出，洗去培养基后，即可移植到种植畦上。移栽时用手指在基质挖2~3cm深的小洞，轻轻把石斛根部放入小洞，注意不要弄断石斛的肉质根，然后用基质盖好。裸根苗或少根苗最好分开种，以便于管理。移栽密度为500株/m2，株行距为4cm×5cm。
2.3移栽后的管理
2.3.1温度管理
人工移栽铁皮石斛组培苗要满足其冬暖夏凉的要求。组培苗生长适宜温度为20~30℃。夏季温度高时，大棚内须通风散热，并常喷雾来降温保湿，每天喷雾3~5次，每次喷雾2~5分钟；冬季气温低时，大棚四周要密封好，以防冻伤组培苗。
2.3.2湿度管理
刚移栽的组培苗对水分很敏感，缺水则生长缓慢、干枯、成活率低。而喷雾过多则渍水烂根，温度高、湿度大时还易引发软腐病大规模发生。移栽后一周内（幼苗尚未发新根）空气湿度宜保持在90%左右，一周后，植株开始发新根，空气湿度可保持在70%~80%。种植畦干湿交潜有利于发根长芽。
2.3.3肥水管理
大棚移栽期间的施肥以叶面肥为主。由于石斛为气生根，因此要喷施适宜的叶面肥作为营养液，以供给植株充足的养分，利早发根长
芽。叶面肥可以选择硝酸钾、磷酸二氢钾、腐植酸类等，以及进口三元复合肥和稀释的MS培养基等。一般移栽后一周，植株新根发生后开始喷施千分之一的硝酸钾或磷酸二氢钾，7~10天喷一次，连续喷3次。长出新芽后每隔10-15天喷3‰的三元复合肥等。一般情况下，施肥后两天停止浇水。若空气对流太大，则视基质干湿度适当喷雾补水。
3.病虫害防治
铁皮石斛的主要病害有软腐病、黑斑病、炭疽病等。软腐病发病快，严重时整株腐烂解体呈湿腐状；黑斑病危害叶片，使叶片枯萎；石斛炭疽病危害叶片及肉质茎，受害叶片出现黑色或褐色病斑。针对这些常见病害要加强棚内管理、注意通风透光、适当降低棚内湿度，及时施药并拔出病株带离。铁皮石斛的主要虫害有蜗牛、菲盾蚧、红蜘蛛等。其中，蜗牛是常见害虫，危害幼茎、嫩叶、花蕾和幼果。可用诱杀、人工捕杀或撒石灰、茶麸防治；石斛菲盾蚧寄生于植株叶片边缘或背面吸食汁液，可将集中有菲盾蚧的老枝烧毁或用40％乐果乳油1 000 倍等喷雾杀灭；红蜘蛛可通过除周边环境的杂草或喷低毒杀螨剂800～1 000 倍防治。铁皮石斛为珍贵药材，因此铁皮石斛的病虫害防治应尽可能以预防、物理防治和生物防治为主，不用或采用低毒农药；一旦发现有病虫害应及时采取相应措施，避免病虫害情的加重。
4.思考与展望
有效地控制污染是植物离体培养成功的关键。外植体造成的污染
最复杂，也最难控制，其原因可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的。微生物可能是腐生的，也可能是内生的，最难处理的则是内生菌。铁皮石斛外植体含有较多的内生真菌，从铁皮石斛根中分离出内生真菌约25种，因此铁皮石斛的外植体消毒应特别注意也较为困难。不定芽诱导和增殖的基本培养基以MS为宜，同时，植物生长调节物质对铁皮石斛的组织培养起重要作用，虽然用量小，但在植物组织培养中使用的激素包括生长素、细胞分裂素等，而NAA 和6-BA组合常用于诱导不定芽和生根。结果与其他研究报道的铁皮石斛不定芽诱导培养基配方有所不同，可能与培养的石斛品种有关。同时，适宜的接种密度和不同的外植体部位都会对不定芽的诱导和增殖产生一定的影响。试验结果表明，低浓度的NAA、IBA 对组培苗根系生长具有显著的促进作用，而高浓度的NAA、IBA 均对组培苗根系生长有明显的抑制作用。适合铁皮石斛组培苗生根培养基为: 1/2 MS + 0. 5mg/LNAA，其次为1/2 MS + 0. 5 mg/L IBA。
目前，铁皮石斛组织培养的研究大多集中在快速繁殖、扩大繁殖系数等方面，今后应加强铁皮石斛的基础性研究，如共生菌、光照、温度、湿度、栽培基质等对石斛生长发育的影响，从而深入掌握石斛生长发育的营养需求，物质合成与分解等新陈代谢规律，确定铁皮石斛类群生长的最佳生态环境，将研究方向和成果与大田栽培紧密结合起来，才能从根本上解决铁皮石斛培养困难，人工种植困难，产量低等问题。
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铁皮石斛组织培养
铁皮石斛组织培养研究进展组织培养 摘要：近年来，对铁皮石斛的需求日趋增加，而野生资源难以满足市场需求，组织培养技术使大规模人工栽培成为可能。从种子萌发、原球茎分化、生根与壮苗、原球茎增殖等方面阐述了近年来关于铁皮石斛组织培养技术的研究概况，并展望了发展前景。 铁皮石斛为兰科石斛属植物，是传统名贵中药材。《神农本草经》列为上品，具有益胃生津、滋阴清热、止咳润肺的功效。现代药理研究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力和扩张血管的作用。由于石斛自然繁殖力低，种子需与真菌共生才能萌发，加上长期采挖，使得野生铁皮石斛资源日渐枯竭，成为濒危植物，被列为国家重点保护的野生药材品种。为了满足市场的需求，国内许多科研人员进行了铁皮石斛组织培养技术的研究。 1 种子萌发 1.1 胚龄 不同种龄的种子萌发率不一样。叶秀嶙等取铁皮石斛2~ 6 个月种龄的种子进行组织培养发现，种龄愈长，萌发率愈高。2 个月种龄的种子接入改良N6培养基中，萌发率仅为6 % ; 3 个月种龄的种子接入改良叹培养基中，培养2 周后开始萌发，萌发率为87 % ; 4 一6 个月种龄的种子接入培养基中，只要培养一周即可萌发，萌发率为95 ％。曾宋君等将铁皮石斛种子接入改良N6培养基中进行组织培养，亦得到相似的结论，幼胚胚龄在60d 以下时，萌发率极低，随着胚龄的增长，其萌发期逐渐缩短，萌发率逐渐升高，成苗率也逐渐
升高，但到达一定的胚龄后，差异并不明显。 1.2 基本培养基 铁皮石斛种子在N6，改良N6，MS , 1 / 2 MS , SH 、KS 、VW 、KundsonC , 1 / 2N6，White等培养基上均可萌发。赵天榜等比较风、MS 等14 种培养基对铁皮石斛种胚成苗率的影响，除残外，所有的基本培养基均优于其减半培养基，其中以N6最好，SH 、Kn 、MS 次之，l /2MS 、1 / 2 Vw 最差。曾宋君等田将铁皮石斛种子在SH 、改良N6、MS 、KS 、VW 、KundsonC 培养基中培养，得出最适培养基为改良N6或自制PT 培养基。罗吉凤等比较了MS 、l / 2MS 、1 / 2 N6和White 培养基对铁皮石斛种子萌发的影响，30d 种子发芽率均达到95 % ，但1 / 2MS 培养基上所萌发的原球茎较大。 1.3 激素 在培养基中添加一定浓度的NAA 可促进种子的萌发，浓度以0.2 一0.5mg/L最适合胚的萌发和生长，过高起抑制作用。2 , 4-D对胚的萌发起抑制作用。6 一BA 对胚萌发后的生长起抑制作用。KT 、IAA 对胚萌发和成苗的影响不大，当浓度超过1mg/L 时，对胚萌发和成苗起抑制作用。ABA 有抑制种子萌发和抑制植物生长的作用，但张铭等发现ABA 能显著提高铁皮石斛原球茎的质量，浓度以0.5mg/L 为最佳。 1.4 天然添加物 在培养基中添加适量的马铃薯汁、香蕉汁、椰乳可促进铁皮石斛种胚的萌发，但张玲等认为香蕉提取物和椰乳对种子萌发和正常发育有不
植物组织培养实验室 组培室 规划设计
植物组织培养实验室组培室规划设计 一、实验室要求理想的组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染 源的地方，最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染。规模化生产的组织 培养实验室最好建在交通方便的地方，便于培养产品的运送。实验室的建设均 需考虑两个方面的问题：一是所从事的实验的性质，即是生产性的还是研究性的，是基本层次的还是较高层次的；二是实验室的规模，规模主要取决于经费 和实验性质。无论实验室的性质和规模如何，实验室设置的基本原则是：科学、高效、经济和实用。一个组织培养实验室必须满足3个基本的需要：实验准备(培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌)、无菌操作和控制培养。此外，还可根据从事的实验要求来考虑辅助实验室及其各种附加设施，使实验室 更加完善。在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的 设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规 模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养 程序来没计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格 无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同 时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。二、实验室组成(一)基本实 验室基本实验室包括准备室、洗涤灭菌室、无菌操作室、培养室、缓冲间，是 组织培养实验所必须具备的基本条件。如进行工厂化生产，年产4万-20万， 需3-4间实验用房，总面积60平方米。1、准备室(化学实验室)功能：又叫化 学实验室，进行一切与实验有关的准备工作：完成所使用的各种药品的贮备、 称量、溶解、器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养 材料的预处理等。要求：最好有20平方米左右。要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备，方便多人同时工作；同时要求通风条件好，便于气体交换；实验室地面应便于清洁，并应进行防滑处理。分类：分体式-研究性质实验室，分开的若干房间将准备室分解为药品贮藏室、培养基配制与洗涤室和灭菌 室等，功能明确，便于管理，但不适于大规模生产。通间式-规模化实验室，准备室一般设计成大的通间，使试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成。 准备试验的过程在同一空间进行，便于程序化操作与管理，试验中减少各环节 间的衔接时间，从而提高工作效率。此外还便于培养基配制、分装和灭菌的自
植物组织培养报告
植物组织培养报告内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）
大蒜茎尖的组织培养 谢婷婷江宋青万嫣文吕凌宇一、实验目的 掌握植物组织培养的相关理论知识及操作方法； 通过自行设计并完成实验，提高动手能力和思维能力； 利用植物细胞的全能性，使大蒜茎尖经过脱分化作用形成愈伤组织，再分化为有结构的组织和器官，最终增殖培育出大量品质优良的大蒜试管苗。二、实验原理 植物组织培养是利用植物细胞的全能性原理。植物组织培养是在无菌环境下，将离体的植物器官、组织以至单个细胞，在人工配置的培养基上培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化”。已经脱分化的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化”。 三、实验材料、试剂和器材 1 供试材料 以购于府前菜场的大蒜为实验材料，实验在丽水学院生态学院组培实验室进行。 2 仪器与设备 超净工作台、培养事、电子天平、烧杯、容量瓶、玻璃棒、量筒、移液
管。 3 试剂 70%酒精、95%酒精、0.1%升汞、蔗糖、琼脂条、6-BA（1.5 mg/L；2.0 mg/L）、2,4-D（2.0 mg/L）、NAA（1.0 mg/L；）、IBA（2.0 mg/L）、10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的铁盐、100倍的有机物。 四、实验步骤 1.培养基的配制及灭菌 诱导培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L 出芽培养基：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L 生根培养基：MS+IBA 2.0 mg/L （1）将MS母液（10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的铁盐、100倍的有机物）按顺序排列、检查是否失效。 （2）在装有3/4蒸馏水的容器中加入0.7%琼脂和3%蔗糖，加热溶化。（3）依次吸取适量各种母液移到容器中。 （4）用蒸馏水定容到相应体积。 （5）调节pH值(用0.1M的NaOH或HCl调节)至5.8-6.0。 （6）向培养基中加入适量激素。 （7）将配制好的培养基进行分装（20-30ml/瓶）。 （8）用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中121 ℃下灭菌 20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（烧杯、培养皿、灭菌水等），需同时灭菌。 （9）将灭菌后的培养基于常温下放置一星期，观察有无污染。
铁皮石斛组织培养研究进展组织培养.
铁皮石斛组织培养研究进展 1、1 种子萌发1.2 基本培养基 铁皮石斛种子在N6，改良N6，MS , 1 / 2 MS , SH 、KS 、VW 、KundsonC , 1 / 2N6，White等培养基上均可萌发。赵天榜等比较风、MS 等14 种培养基对铁皮石斛种胚成苗率的影响，除残外，所有的基本培养基均优于其减半培养基，其中以N6最好，SH 、Kn 、MS 次之，l /2MS 、1 / 2 Vw 最差。曾宋君等田将铁皮石斛种子在SH 、改良N6、MS 、KS 、VW 、KundsonC 培养基中培养，得出最适培养基为改良N6或自制PT 培养基。罗吉凤等比较了*** / 2MS 、1 / 2 N6和White 培养基对铁皮石斛种子萌发的影响，30d 种子发芽率均达到95 % ，但1 / 2MS 培养基上所萌发的原球茎较大。 1.3 激素 在培养基中添加一定浓度的NAA 可促进种子的萌发，浓度以0.2 一0.5mg/L最适合胚的萌发和生长，过高起抑制作用。2 , 4-D对胚的萌发起抑制作用。6 一BA 对胚萌发后的生长起抑制作用。KT 、IAA对胚萌发和成苗的影响不大，当浓度超过1mg/L 时，对胚萌发和成苗起抑制作用。ABA 有抑制种子萌发和抑制植物生长的作用，但张铭等发现ABA 能显著提高铁皮石斛原球茎的质量，浓度以0.5mg/L为最佳。 1.4 天然添加物
在培养基中添加适量的马铃薯汁、香蕉汁、椰乳可促进铁皮石斛种胚的萌发，但张玲等认为香蕉提取物和椰乳对种子萌发和正常发育有不利影响，干扰其正常发育过程。 1.5 炭源 在组培过程中适当添加活性炭，可以吸附代谢过程中产生的废弃物，防止组织褐变，并刺激胚胎的发生与生根，可加人2 ％蔗糖。曾宋君等在改良N6＋NAA 0.2mg/L 的最适培养基上，发现以白糖、片糖为炭源时，胚萌发和成苗的效果比蔗糖好，这可能是白糖、片糖中含有适合胚萌发和成苗的矿质元素 2 原球茎增殖 2.1 基本培养基 铁皮石斛原球茎增殖可以1/2 MS，MS等作为基本培养基。张治国等研究了6 种不同培养基对铁皮石斛原球茎增殖的影响，结果表明，l /2 MS 是原球茎增殖的适宜培养基。 2.2 激素 适宜的NAA 、KT 、6 一BA 浓度对原球茎的增殖起促进作用。唐桂香等以1 / 2 MS 为基本培养基，发现BA 1.0mg/L和NAAO.lmg/L有利于原球茎诱导增殖。蒋林等叫研究表明，l / 2Ms + NAA1.0mg/L+ KTO.2mg/L比较适合嗓球茎的增殖。蒋波等以1 / 2MS 为基本培养基.添加BA 2.0mg/L + NAA0.5mg/L或6 一BA3.0mg/L + NAAO.5 mg/L的激素，原球茎
植物组织培养实验设计及.doc
植物组织培养实验设计及 常用设备的使用与维护 一．实验目的 1.熟悉植物组织培养实验室的组成及设备 2.掌握植物组织培养实验室的设计要求 3.熟悉植物组织培养所需的仪器设备 二．实验原理 植物组织培养是通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。要达到无菌操作和无菌培养，就需要人为创造无菌的环境，使用无菌的器皿及器械，同时还需要人工控制的温度,光照，湿度等培养条件。无菌环境和培养条件的创造需要一定的设施及设备。 三．实验步骤 1.实验室的设计要求 功能齐全、布局合理、环境清洁、易于灭菌 2.实验室的组成及功能 实验室的组成： 洗涤室、药品室、称量室、培养基配制室、灭菌室、接种室、培养室、观察记录室、储藏室、移苗室 实验室的功能： 洗涤室用于玻璃器皿、实验用具的清洗、干燥、培养材料清洗、预处理也可在本室完成。室内应建造大型水槽和一个或几个浸泡
池，水槽最好上一内衬白瓷片的水泥槽，为防止碰坏玻璃器皿，下面可铺一活动的橡胶板。备有晾瓶架，用于放置刷净的培养器皿，配备有一定数量的周转盘或小推车，用于运输培养器皿。地面要注意防滑，排水通畅，墙壁要有耐湿、防潮功能。 药品室用于存放各种药品试剂。室内要求干燥、通风，避免光照，配有药品柜、冰箱等设备。化学试剂物品分类存放于柜中，有毒物质如升汞需要专人密封保存。原药可室温下存放，配好的母液，宜置于4℃冰箱中保存。药品室紧邻称量室较好，便于工作。 称量室进行化学药品的称量。要求干燥、密闭，无直射光照，避免腐蚀性药品和水气直接接触。有固定的水磨石平台，安放普通天平、精密天平和分析天平，要有电源插座，最好设计在阴面的房间，这样对怕光药品的保存和称量有利，称量室紧邻培养基配制室较好，以方便配制母液和培养基。房间较少时，可以与药品室合二为一。 培养基配制室主要进行母液的配制，培养基的配制、分装、包扎和灭菌前的暂时存放。在条件允许下，面积宜大不宜小，室内应有大型实验台。配有电炉、锅子、量具、培养基分装器具、吸管、培养容器、水浴锅和酸度计等。如规模较小，可与洗涤室、灭菌室合并在一起。
组织培养实验报告
植物组织培养实验报告 一、实验目的 1．掌握无菌操作的植物组织培养方法； 2．通过配置ms培养基母液，掌握母液的配置和保存方法； 3．通过诱导豌豆根、茎、 叶形成愈伤组织学习愈伤组织的建立方法； 4．通过诱导豌豆茎、叶形成愈伤组织学习愈伤组织的建立方法； 5．了解植物细胞通 过分裂、增殖、分化、发育, 最终长成完整再生植株的过程, 加深对植物细胞的全能性的理 解。 二、实验原理（一）植物组织培养 植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下， 能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分 化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称 为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统 以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。（二）植物细胞的全能性 植物细胞的全能性即是每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，在一 定培养条件下每个细胞都可发育成一个与母体一样的植株。（三）组织的分化与器官建 成 外植体诱导出愈伤组织后，经过继代培养，可以在愈伤组织内部形成一类分生组织即具 有分生能力的小细胞团，然后，再分化成不同的器官原基。有些情况下，外植体不经愈伤组 织而直接诱导出芽、根。 （四）培养基的组成 培养基中各成分的比例及浓度与细胞或组织的生长或分化所需要的最佳条件相近，似成 功地使用该培养基进行组织培养的主要条件。营养培养基一般由无机营养、碳源和能源、维 生素、植物激素（生长调节剂）和包括有机氮、酸和复杂物质的添加剂组成。 三、实验器材 高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养室镊子、记号笔、橡皮筋、玻 璃器皿、三角烧瓶、烧杯、量筒、剪刀、棉塞、绳子、牛皮纸、酒精灯、喷雾器等。 四、实验材料 豌豆种子 五、实验药品 药品、70% 酒精、 0.1% 升汞、ms培养基、蒸馏水、naoh、 84消毒液、蔗糖、琼脂 等。 六、实验步骤 （一）培养基母液的配制 表1.ms培养基个成分的含量（单位：mg/l） 表2.ms培养基所需母液以及扩大倍数 名称大量元素微量元素 ca盐 mg盐 fe盐有机肌醇激素 扩大倍数 50 50 50 50 50 100 100 100 定容体积(ml) 500 500 500 500 500 200 200 50 吸取毫升数/l 20 20 20 20 20 10 10 5 （注：吸取毫升数为每升培养基所吸取的母液的体积） 表3.配制母液所需的药品及称取量
铁皮石斛组培技术
铁皮石斛的组织培养研究 专业班级： 姓名： 学号： 课程：植物组织培养
目录 摘要 (3) Abstract (4) 前言 (5) 1.培养基 (6) 1.1配方 (6) 1.2配制（以1000ml幼株的生根壮苗培养基为例） (6) 1.3灭菌 (8) 2.转接 (9) 2.1转接前准备 (9) 2.2转接 (9) 2.3培养 (9) 3.炼苗 (10) 3.1炼苗目的 (10) 3.2炼苗方法 (10) 4.移栽 (11) 4.1基质选择 (11) 4.2移栽技术要求 (11) 5.结论与分析 (12) 参考文献 (13)
摘要 铁皮石斛(Dendrobium officinale)是兰科(Orchidaceae)石斛属(DendrobiumSw．)多年生草本植物。铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。铁皮石斛是传统名贵中药材，有生津益胃、清热养阴和清咽利嗓等功效，主要药用成分石斛多糖是一种免疫调节剂。铁皮石斛蒴果成熟时易开裂，且种子粒径小，自然繁殖率低。为了保护和有效利用铁皮石斛，通过组织培养技术大量快速繁殖铁皮石斛组培苗显得尤为重要。 关键词：铁皮石斛组织培养移栽培养基转接快速繁殖
Abstract Dendrobium orchid Dendrobium is a perennial herb. It is the ultimate in DendrobiumSw,named for its ferric green epidermis.As a rare traditional Chinese herbal medicine,it contributes to dry dampness and strengthen the spleen,clear away lung-heat ,nourish yin ，clear away heat ,and so on.The main medicinal components of Dendrobium polysaccharide is a kind of immune modulators.When mature,its capsule cracks,in which seeds are in small particle size and have a low rate of natural reproduction.In order to protect and utilize the Dendrobium orchid Dendrobium ,it is particularly important to establish a rapid propagation by the tissue culture technique . key words:Dendrobium orchid Dendrobium tissue culture culture medium adapter rapid propagation
铁皮石斛的组织培养
由于石斛自然繁殖力极弱，生长缓慢，加之人们掠夺性采挖，资源已严重枯竭。而石斛栽培一直未解决其存活率低、进入盛产期年限长等问题，故石斛药源一直处于紧张状态。因此，组织培养、遗传转化、菌根技术、悬浮培养等生物技术在石斛的应用意义重大，甚为迫切。石斛的组织培养，可用种子、根、茎尖、茎节及叶等为外植体，但以种子进行组培快繁的为多。原球茎的增殖分化是石斛试管苗繁殖的关键，因此，研究原球茎增殖分化的适宜培养条件非常重要。特别是应用组织培养技术快速大量繁殖石斛试管苗，是解决其种苗与发展生产的有效途径。 铁皮石斛的组织培养 铁皮石斛，又名铁皮兰、节草、耳环石斛等。野生铁皮石斛为国家珍稀濒危保护植物（三级）。由于其生长环境要求特殊，野生资源已濒临灭绝。现云南晨安生物科技开发有限公司对铁皮石斛的组培快繁已获成功，月出苗量50万瓶以上，为铁皮石斛工厂化育苗和大面积栽培闯出了一条新路。 1 胚培养（种子培养）：取人工授粉的铁皮石斛果实，用75％的乙醇表面消毒，30s后再用0.1％升汞溶液消毒8min，无菌水冲洗4~5次。在无菌操作下，把果实切成0.1mm见方的小块，接种到培养基上，每瓶3~5块。研究结果表明，N6培养基对种子萌发和生长最好，蔗糖浓度2％最佳，NAA浓度0.2~0.5mg/L最适合胚的萌发和生长；种子培养中加入椰乳对胚萌发和萌发后的初期生长起促进作用；而香蕉汁对继代培养中石斛的生根和壮苗起促进作用，生根和壮苗培养中不加入NAA，只用N6+10％香蕉汁，苗长得更粗壮。培养温度25~28℃，光照强度1600~2000lx，每日10~12h。种子萌发后，转管3~4次，当幼苗长出4~5片真叶并具有3~4条1~2cm长的根时，可将试管苗进行炼苗后移栽。 在实验中尚发现，石斛原球茎的增殖与胚龄相关，不同胚龄培养，其萌发率不同：胚龄45
植物组织培养实验基本步骤。。
植物组织培养实验基本步骤 一、母液的配置 1、MS大量元素母液的配制 将大量元素配制成10倍的母液，使用时再稀释10倍。按照配方表中用量依次分别称取扩大10倍的：NH4NO3 、KNO3 、KH2PO4 、 MgSO4·7H2O 、CaCl2·2H2O ，所有药品称取完毕后用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，最后定容至500ml，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。 2、MS微量元素母液的配制 将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别依次称取：MnSO4· 4H2O 、ZnSO4·7H2O 、 H3BO3 、KI 、CuSO4·5H2O 、CoCl2·6H2O ，用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至500ml，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。 3、MS铁盐母液配制 将铁盐配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：称
FeSO4·7H2O 和Na2·EDTA ，把FeSO4·7H2O和Na2·EDTA·2H2O分别置于200ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解（磁力搅拌器，边加热，边搅拌）。保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2·EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后加蒸馏水到最终容积500ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡1～2min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4℃冰箱中保存备用。 4、MS有机化合物母液的配制 将有机化合物配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：肌醇、维生素B1 、烟酸、甘氨酸、维生素B6 、蔗糖，用蒸馏水依次溶解并定容至500ml后，转入500ml 细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。 二、植物激素的配置 常见激素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚－3－丁酸（IBA）、激动素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、6－苄氨基嘌呤（6－BA）、赤霉素（GA3）、 1、生长素类： （1）、生长素类在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织
植物组织培养实验报告
植物组织培养实验报告 一实验目的 让植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。 二实验原理 植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸（IAA ）和 6 –苄基氨基腺嘌呤（6 – BA ）的比例，决定了根和芽的分化。 三实验器材 （一）试剂 乙醇、IAA 或 2 ，4 – D 、HgCl 2 （或次氯酸钠）、6- 苄基氨基腺嘌呤（6-BA ） MS 培养基 （二）仪器设备 培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（100mL ），烧杯，量筒，培养皿，超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，橡皮筋等 三实验步骤 1. 配制培养基 （1 ）愈伤组织诱导培养基：MS 培养基（蔗糖含量为10 g/L ，2,4 – D 含量为 2 mg/L ，琼脂10 g/L ）。 （2 ）试验培养基：在MS 培养基中按表33 – 1 加入IAA 和6–BA 。 吲哚乙酸先用少量0.1 mol/L NaOH 溶解，6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量0.1 mol/L HCl 溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。 2. 培养基灭菌 将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至pH 5.8 ，趁热分装于100 mL 三角烧瓶中，每瓶约20 mL 。待培养基冷却凝固后，用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中121 ℃（ 1 kg/cm 2 ）下灭菌20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，
植物组织培养实验报告
植物组织培养实验报告 学院：生命科学技术学院 班级：11生物技术(制品) 学号：2011192017 姓名：李鹏
植物组织培养实验报告 实验一植物组织培养母液的配制 一、实验目的 1.了解植物组织培养基本培养基的组分及其作用。 2.学习掌握植物组织培养MS培养基的配制方法。 二、实验原理 培养基是植物组织培养中离体组织赖以生存和发育的条件。大多数培养基的成分是有无机盐、有机化合物（碳源、维生素、肌醇、氨基酸等）、生长调节物质、水分和其他附加物等五大类物质组成。 无机盐类由大量元素和微量元素组成。大量元素中，氮类化合物主要以硝酸类和铵类化合物的形式存在，但在培养基中多用硝酸类，也可以将硝酸类和铵类混合使用；磷和硫常用磷酸盐和硫酸盐来提供；钾是培养基中主要的阳离子；钙、钠、镁的需要量较少。微量元素包括碘、锰、铜、锌、钴、铁。培养基中的铁离子，大多数以螯合物的形式存在，即硫酸亚铁与乙二胺四乙酸二钠的混合。 有机化合物包括碳源、维生素、肌醇、氨基酸等。培养中的植物组织和细胞的光合作用较弱，因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物物来提供营养需要。培养基中的碳水化合物通常为蔗糖。蔗糖除了作为培养基的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起着重要的作用。在培养基中加入维生素有助于细胞的分裂和增长。一般包括VB1、B6、烟酸、生物素、叶酸、泛酸钙、VC。肌醇在糖类的相互转化、维生素和激素的利用等方面具有重要的催进作用。 常用的植物生长调节物质包括以下三类：①生长素类：吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2,4-D）②细胞分裂素：玉米素（ZT）6-苄基嘌呤（6-BA）和激动素（KT）。③赤霉素：组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸（GA3）。 培养基中的其他附加物包括人工合成和天然的有机物附加物。其中最为常见的为酵母提取物。琼脂作为培养基的支持物，也是最常用的邮寄附加物，他可以是培养基呈固体状态，以利于组织和细胞的培养。 植物组织培养是否成功，在很大的程度上取决于培养基的选择之上。目前普遍使用的是MS培养基。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，或用于胚胎、茎段、茎尖及花药的培养等。MS培养基的硝酸盐、钾和铵的含量略高于其他的培养基，也是它被普遍使用的原因之一。 三、实验材料、试剂、配方和仪器设备 1．试剂 NH 4NO 3 ,KNO 3 ,KH 2 PO 4 ,CaCl 2 ·2H 2 O ,MgSO 4 ·7H 2 O,FeSO 4 ·7H 2 O Na 2-EDTA,MnSO 4 ·4H 2 O,ZnSO 4 ·7H 2 O,H 3 BO 3 ,KI,Na 2 MoO 4 ·2H 2 O CuSO 4 ·5H 2 O,CoCl 2 ·6H 2 O,肌醇，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸， 蒸馏水。 2.仪器设备 电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml）量筒（1000ml、100ml、25ml），容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，移液管（10ml，5ml，1ml）试剂瓶，玻璃棒数支，药匙，称量纸等。
铁皮石斛组培方案
铁皮石斛组织培养方案报告 一、实验目的 了解铁皮石斛培养的方法和步骤，熟练掌握外植体的取材、消毒、接种、初代培养的操作过程。 二、实验器材 超净工作台、高压灭菌锅、电磁炉、长镊子、培养皿、酒精灯、接种工具、烧杯、玻璃棒、移液管、培养箱、剪刀、培养瓶等。 三、实验步骤 配方： 根据不同阶段，培养基配方有所差异。如表1 表1 各种培养基配方 配制（以1000ml幼株的生根壮苗培养基为例） 10%香蕉（w/w）+MS +3%蔗糖（w/w）+0.8%琼脂（w/w）+2.0mg/L NAA 1）量取800ml蒸馏水于洁净的大烧杯中，加热至沸腾； 2）准确称量100g香蕉果肉，切成碎片状，并倒入上述烧杯中，加热煮沸5min，其间搅拌使之充分溶解； 3）按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ顺序，量取MS各种母液于盛
有50ml蒸馏水的烧杯，混合均匀； 4）将2）和3）的溶液混合，然后加入30g蔗糖，并移取2ml NAA（0.1mg/ml），混合均匀； 5）加热至沸腾，加入8g琼脂并煮沸5min，其间不断搅拌使之充分溶解； 6）冷却至50±5℃时，调pH至5.4—5.6。分装于培养瓶内，33.3ml/瓶。 注意事项： ①溶解香蕉的蒸馏水尽可能多，以确保香蕉各种成分完全溶解； ②各种母液混合时，要按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ的顺序； ③煮沸时，小心溶液溢出； ④分装时不要污染培养瓶瓶口。 灭菌： 1）检查灭菌锅的水位、电源、排气阀、排气管、安全阀以及压力表，确保灭菌锅各指标和功能的正常，以防事故发生； 2）把带灭菌的培养基装入锅内，盖上锅盖，对称而均匀地扭紧螺丝； 3）打开电源和排气阀，调节电压至220V； 4）待排气阀排除水蒸气30s—1min后，关闭排气阀； 5）当温度上升到121℃后，调节电压至135V，保持20min； 6）关闭电源，使之自动降温至0℃。10min后，打开排气阀和锅盖； 7）5—10min后，取出培养基放于试验台上冷却，待用。
组织培养
在铁皮石斛组织培养研究进展组织培养 摘要： 近年来，对铁皮石斛的需求日趋增加，而野生资源难以满足市场需求，组织培养技术使大规模人工栽培成为可能。从种子萌发、原球茎分化、生根与壮苗、原球茎增殖等方面阐述了近年来关于铁皮石斛组织培养技术的研究概况，并展望了发展前景。铁皮石斛为兰科石斛属植物，是传统名贵中药材。神农本草经》《列为上品，具有益胃生津、滋阴清热、止咳润肺的功效。现代药理研究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力和扩张血管的作用。由于石斛自然繁殖力低，种子需与真菌共生才能萌发，加上长期采挖，使得野生铁皮石斛资源日渐枯竭，成为濒危植物，被列为国家重点保护的野生药材品种。 为了满足市场的需求，国内许多科研人员进行了铁皮石斛组织培养技术的研究。 1 种子萌发 1.1 胚龄不同种龄的种子萌发率不一样。叶秀嶙等取铁皮石斛 2~ 6 个月种龄的种子进行组织培养发现，种龄愈长，萌发率愈高。2 个月种龄的种子接入改良 N6 培养基中，萌发率仅为 6 % ; 3 个月种龄的种子接入改良叹培养基中，培养 2 周后开始萌发，萌发率为 87 % ; 4 一 6 个月种龄的种子接入培养基中，只要培养一周即可萌发，萌发率为 95 ％。曾宋君等将铁皮石斛种子接入改良 N6 培养基中进行组织培养，亦得到相似的结论，幼胚胚龄在 60d 以下时，萌发率极低，随着胚龄的增长，其萌发期逐渐缩短，萌发率逐渐升高，成苗率也逐渐升高，但到达一定的胚龄后，差异并不明显。 1.2 基本培养基铁皮石斛种子在 N6，改良 N6，MS , 1 / 2 MS , SH 、KS 、VW 、 KundsonC , 1 / 2N6，White 等培养基上均可萌发。赵天榜等比较风、 MS 等 14 种培养基对铁皮石斛种胚成苗率的影响，除残外，所有的基本培养基均优于其减半培养基，其中以 N6 最好，SH 、Kn 、MS 次之，l /2MS 、1 / 2 Vw 最差。曾宋君等田将铁皮石斛种子在 SH 、改良 N6、MS 、KS 、VW 、KundsonC 培养基中培养，得出最适培养基为改良 N6 或自制 PT 培养基。罗吉凤等比较了 MS 、l / 2MS 、 1 / 2 N6 和 White 培养基对铁皮石斛种子萌发的影响，30d 种子发芽率均达到 95 % ，但 1 / 2MS 培养基上所萌发的原球茎较大。 1.3 激素在培养基中添加一定浓度的 NAA 可促进种子的萌发，浓度以 0.2 一 0.5mg/L 最适合胚的萌发和生长，过高起抑制作用。2 , 4-D 对胚的萌发起抑制作用。6 一 BA 对胚萌发后的生长起抑制作用。KT 、IAA 对胚萌发和成苗的影响不大，当浓度超过 1mg/L 时，对胚萌发和成苗起抑制作用。ABA 有抑制种子萌发和抑制植物生长的作用，但张铭等发现 ABA 能显著提高铁皮石斛原球茎的质量，浓度以 0.5mg/L 为最佳。 1.4 天然添加物在培养基中添加适量的马铃薯汁、香蕉汁、椰乳可促进铁皮石斛种胚的萌发，但张玲等认为香蕉提取物和椰乳对种子萌发和正常发育有不利影响，干扰其正常发育过程。 1.5 炭源在组培过程中适当添加活性炭，可以吸附代谢过程中产生的废弃物，防止组织褐变，并刺激胚胎的发生与生根，可加人 2 ％蔗糖。曾宋君等在改良 N6＋NAA 0.2mg/L 的最适培养基上，发现以白糖、片糖为炭源时，胚萌发和成苗的效果比蔗糖好，这可能是白糖、片糖中含有适合胚萌发和成苗的矿质元素 2 原球茎增殖 2.1 基本培养基铁皮石斛原球茎增殖可以 1/2 MS，MS 等作为基本培养基。张治国等研究了 6 种不同培养基对铁皮石斛原球茎增殖的影响，结果表明， /2 l MS 是原球茎增殖的适宜培养基。 2.2 激素适宜的 NAA 、KT 、6 一 BA 浓度对原球茎的增殖起促进作用。唐桂香等以 1 / 2 MS 为基本培养基，发现 BA 1.0mg/L 和NAAO.lmg/L 有利于原球茎诱导增殖。蒋林等叫研究表明，l / 2Ms + NAA1.0mg/L+ KTO.2mg/L 比较适合嗓球茎的增殖。蒋波等以 1 / 2MS 为基本培养基.添加 BA 2.0mg/L + NAA0.5mg/L 或 6 一 BA3.0mg/L + NAAO.5 mg/L 的激素，原球茎的增殖系数较大。陈兆贵等认为原球茎增殖以 MS + NAA1.0mg/L + 6 一 BA1.0mg/L + KT1.0mg/L 为最佳，35d 增殖倍数达到 5 倍。
植物组织培养实验报告
植物组织培养实验报告 摘要：以大豆子叶为外植体，在MS培养基上附加不同浓度、不同种类的植物激素，以研究不同激素组合和不同浓度对大豆子叶愈伤诱导率的影响，并练习无菌操作。实验结果显示第2组即MS+6-BA（2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)和第 3 组即MS+KT（0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 培养基中愈伤组织诱导率较高，为较佳的愈伤组织诱导组合。 关键词：大豆；植物组织培养；无菌操作；愈伤组织 1.材料与方法 1.1实验材料：大豆子叶 1.2实验试剂与仪器 （1）试剂：75%酒精、MS干粉、蔗糖、琼脂、植物生长调节剂（NAA、2，4-D、KT、6-BA）、无菌水、升汞、NaOH溶液 （2）仪器：超菌净工作台、圆纸片、培养皿、封口膜、称量纸、千分之一天平、不锈钢杯子、移液枪、试管、高压灭菌锅、注射器、酒精灯、镊子、手术刀、搁置架、烧杯、电炉。 1.3实验方法 1.3.1培养基的配制与灭菌 1.3.1.1 配制培养基的准备阶段 （1）准备80个培养试管及封口膜，2个小培养皿、1个大培养皿，用洗衣粉、自来水洗净，再用蒸馏水把每个培养试管、润洗一下。带晾干后将试管编号1-80；（2）在称量纸上用百分之一天平分别称取1.5g 琼脂4份，7.5g 蔗糖4份，在烧杯里用千分之一天平上称取1.185g MS干粉4份（烧杯不要清洗）；
（3）剪小圆纸片40，均分在两个小培养皿小能从中自由取出为宜；剪大圆纸片10，均分在两个大培养皿中。然后分别用报纸包好。 （4）把接种工具手术刀、镊子、剪刀等用报纸包好。 1.3.1.2 配制培养基 （1）在装有MS干粉的烧杯中按下表加入植物生长调节剂 实验所用的所有激素浓度均为0.5mg/mL 激素的加样量(ml) 编号培养基配置 6-BA NAA KT 2,4-D 1 MS+6-BA（1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L) 0.5 0.25 2 MS+6-BA（2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L) 1.0 0.5 3 MS+KT（0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 0.25 0.5 4 MS+KT（1.0mg/L)+2,4-D(2.0mg/L) 0. 5 1.0 （2）用量筒量取250ml（稍多）蒸馏水，取一个不锈钢杯子加入150ml蒸馏水和称量好的琼脂，在电炉子加热沸腾2min，再加入混合好的MS培养基1号和蔗糖，混合沸腾2min，用剩余的蒸馏水定容至250ml； （3）当温度降到60℃左右时，将溶液pH 调至5.8，一般加4滴NaOH溶液即可；（4）取编号1-20的培养试管，用大量注射器以每瓶12.5ml 左右培养基分装在培养试管中，用封口膜封口，4支一捆捆扎好。 （5）用相同的方法配置2-4号培养基，并分装、捆扎。 1.3.1.3高压湿热灭菌 （1）将包好的接种工具，包好的培养皿，以及分装好的试管一起放到高温灭菌
铁皮石斛组织培养
铁皮石斛组织培养研究进展组织培养摘要：近年来，对铁皮石斛的需求日趋增加，而野生资源难以满足市场需求，组织培养技术使大规模人工栽培成为可能。从种子萌发、原球茎分化、生根与壮苗、原球茎增殖等方面阐述了近年来关于铁皮石斛组织培养技术的研究概况，并展望了发展前景。 铁皮石斛为兰科石斛属植物，是传统名贵中药材。《神农本草经》列为上品，具有益胃生津、滋阴清热、止咳润肺的功效。现代药理研究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力和扩张血管的作用。由于石斛自然繁殖力低，种子需与真菌共生才能萌发，加上长期采挖，使得野生铁皮石斛资源日渐枯竭，成为濒危植物，被列为国家重点保护的野生药材品种。为了满足市场的需求，国内许多科研人员进行了铁皮石斛组织培养技术的研究。 1 种子萌发 1.1 胚龄:不同种龄的种子萌发率不一样。叶秀嶙等取铁皮石斛2~ 6 个月种龄的种子进行组织培养发现，种龄愈长，萌发率愈高。2 个月种龄的种子接入改良N6培养基中，萌发率仅为6 % ; 3 个月种龄的种子接入改良叹培养基中，培养2 周后开始萌发，萌发率为87 % ; 4 一6 个月种龄的种子接入培养基中，只要培养一周即可萌发，萌发率为9 5 ％。 1.2 基本培养基:铁皮石斛种子在N6，改良N6，MS , 1 / 2 MS , SH 、KS 、VW 、KundsonC , 1 / 2N6，White等培养基上均可萌发。赵天榜等比较风、MS 等14 种培养基对铁皮石斛种胚成苗率的影响，除残外，所有的基本培养基均优于其减半培养基，其中以N6最好，SH 、Kn 、MS 次之，l /2MS 、1 / 2 Vw 最差。 1.3 激素:在培养基中添加一定浓度的NAA 可促进种子的萌发，浓度以0.2 一0.5mg/L最适合胚的萌发和生长，过高起抑制作用。2 , 4-D对胚的萌发起抑制作用。6 一BA 对胚萌发后的生长起抑制作用。KT 、IAA对胚萌发和成苗的影响不大，当浓度超过1mg/L 时，对胚萌发和成苗起抑制作用。 1.4 天然添加物:在培养基中添加适量的马铃薯汁、香蕉汁、椰乳可促进铁皮石斛种胚的萌发， 1.5 炭源:在组培过程中适当添加活性炭，可以吸附代谢过程中产生的废弃物，防止组织褐变，并刺激胚胎的发生与生根，可加人2 ％蔗糖。 2 原球茎增殖 2.1 基本培养基:铁皮石斛原球茎增殖可以1/2 MS，MS等作为基本培养基。 2.2 激素:适宜的NAA 、KT 、6 一BA 浓度对原球茎的增殖起促
石斛组织培养研究进展
石斛组织培养研究进展 张明1,夏鸿西2,朱利泉2,张玉进2 (1.重庆市中药研究院,重庆400065; 2.西南农业大学,重庆400716) [摘要]目的:综述国内外对石斛组织培养进行的深入研究。方法:系统查阅国内外近10年来的有关文献20余篇。结果与结论:介绍了石斛组培的多种方法,对培养基、激素及多种条件对组培的影响作了论述,并提出了存在的问题及对策。 石斛属Dendrobium为兰科第2大属,多年生草本植物,全球计有1 500种。多生于树皮或岩石上,开花多,结果少,每果可含100万粒种子。种子细如粉尘[1],每粒重约0.3～0.4μg。种胚不超过球形阶段,即存在后熟现象。由于缺乏胚乳组织,需与真菌共生(symbiotical)才能萌发,自然条件下发芽率一般不及5%。石斛为合轴生长(sympodial),分株是其繁殖的主要方式,对生长条件的要求较为苛刻。石斛属植物中有不少是名贵中药,在《本草纲目》中石斛被列为上品。我国76种石斛属植物中有近40种作药用[2],著名的有 D.nobile(金钗石斛)、D.candium(铁皮石斛)、D.huosanness(霍山石斛)等。具有强阴益精、补肾益力、轻生延年等作用,其应用范围正迅速扩大。石斛属植物约有四分之一可供观赏[3],称为石斛兰 D.orchids,以花艳丽而著称,近年作为观赏植物发展迅速,已形成独立产业。集药用和观赏于一体的价值,加之过度的采伐利用和繁殖率低,造成了石斛供需之间的紧张状况,
我国已将其列为濒于绝灭的受保护的中药品种之一。自1960年法国人Gmorel利用石斛基尖组织培养无病毒植株的无性繁殖技术创立以来,石斛组织培养逐步走向深入化。近年来,石斛组织培养的最佳条件,包括光照、温度、pH以及如何选用外植体,选用激素等取得长足进展,并利用组培技术研究种子萌发过程中的生理生化变化等,还获得了转基因石斛植株。我国石斛组织培养研究起步较晚,直到1984年,徐云鹏等才首次报道获得霍山石斛试管苗[4]。此后又利用铁皮石斛、束花石斛、兜唇石斛的茎尖、叶尖或种胚获得了再生植株。 1石斛组织培养再生植株的获得 组织培养获得石斛再生植物株的途径有器官发生型和原球茎发生型两种。器官发生型通过外植体组织培养,使预先存在的分生组织形成芽(如腋芽)或不定分生组织(如子叶、茎段、愈伤组织等)形成不定芽。此途径又可分为3种类型:无菌短枝型(又称节培法),芽增殖型,器官发生型;原球茎发生途径通过石斛适宜外植体诱导产生胚性愈伤组织并增殖,随后形成类胚组织原球茎进而发育成完整的再生植株。通常由种子离体培养产生的胚性组织称原球茎(protocorm),而上外植体叶尖、基尖等诱导形成的胚性组织称为拟原球茎(protocorm like bodies)即PLBs。原球茎或拟原球茎转入不含任何激素或生长素的培养基(如MS)便可再生出完整小植株。 1.1原球茎发生 影响原球茎发生的主要有外植体的大小、来源、生理状态、培养基类型、激素浓度,种类、处理时间及一些其它因素。
第五章 植物组织培养技术实验方案
第五章植物组织培养技术 一、植物组织培养中的基本概念 (1) 植物组织培养技术: 在无菌培养的条件下，将离体的植物器官（根，茎，叶，花，果实等）、组织（形成层，花药组织等）、细胞（体细胞，生殖细胞等）以及原生质体等培养在人工配制的培养基上，并给予适当的培养条件，使其长成完整植株的过程。 (2) 理论依据： 植物细胞的全能性，即指植物机体的每个细胞都含有该物种全套的基因组，具有发育成完整个体的潜力。 (3) 外植体： 从活体植株上切下的，用于组织培养的细胞、组织和器官。一般包括茎尖、根、茎、叶、花、种子等器官以及他们形成的体细胞胚等材料。 (4) 分化： 在个体发育过程中，由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程称为细胞分化。 (5) 脱分化： 已经高度分化的植物器官、组织或细胞，在切割损伤和培养物内外因素的共同作用下，逐渐丧失原来的分化结构和功能，最后形成无组织的细胞团或愈伤组织的过程。 (6) 愈伤组织： 在人工培养基上由外植体脱分化形成的一团无序生长的薄壁细胞。（具有细胞分裂能力）。 (7) 再分化： 已经脱分化的细胞在一定条件下，又可经过愈伤组织或胚状体，再分化出根和芽，形成完整植株，这一过程叫作再分化。 (8) 不定芽： 在高等植物正常的个体发育中，芽一般是只从茎尖或叶腋等的一定位置生出。所以这种象顶芽、腋芽、副芽等均在一定部位生出的芽，称为定芽。与此相反，凡从叶、根、或茎节间等通常不形成芽的部位生出的芽，则统称为不定芽。 (9) 胚状体： 在离体植物细胞、组织或器官培养过程中，由一个或一些体细胞，经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。 二、植物组织培养过程（菊花为例） 1、培养基的配制: 方法：培养基干粉配制法 称取培养基干粉42g加水加热煮沸溶解后定溶至1L，按照需要的浓度分别加入激素。 （其中生根用的植物激素NAA为0.2mg/1000ml） 用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调节pH至5.8。将配好的培养基迅速分装至150ml组培瓶中，拧上盖子，放入灭菌锅121℃，灭菌20min。 2、菊花接种与培养：