正交试验设计法优选龙胆中龙胆总苷的提取工艺_向志芸

中药与临床 Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2015;6(6)?23?

龙胆（Gentiana chinensis ）为龙胆科植物条叶龙胆Gentiana manshurica Kitag 、龙胆Gentian.a scabra Bge.、三花龙胆Gentiana tri ? ora Pall.或滇龙胆Gentiana rigescens Franch.的干燥根和根茎。前三种习称“龙胆”，后一种习称“坚龙胆”。具有清热、泻肝、定惊之功效。据本草纲目[1]记载，因其叶如龙葵，味苦如胆，因此而得名。根据化学成分研究表明，龙胆苦苷(gentiopicroside ，GTP)是龙胆科植物龙胆、秦艽等的活性最强的有效成分之一[2]。现代药理研究

证明龙胆苦苷具有对多种肝损伤具有显著地保护作用，还具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎镇痛的作用，具有非常重要的开发价值[3]。为更好的开发利用它，本研究通过紫外-可见分光光度法及正交试验设计法优选龙胆总苷的提取工艺，为龙胆总苷的有效开发利用、工业化生产和剂型研究提供实验依据。

1 仪器与试药

UV-6100型紫外可见分光光度计，PS-60A 型超声波清洗器，BP-61 电子天平，B-260恒温水浴锅，Q-250B3型高速多功能粉碎机，龙胆饮片购于四川新荷花中药饮片股份有限公司 ( 批号: 1111044，产地：云南)，粉碎至粗粉，备用。龙胆苦苷对照品购于成都曼思特生物科技有限公司( 批号: MUST-14081205)，其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 方法学考察

2.1.1 对照品溶液的制备 将龙胆苦苷对照品置于五

向志芸，李小芳，罗开沛，罗佳，杨露，林浩，刘海霞

[摘要] 目的：采用正交试验设计法优化龙胆中龙胆总苷的提取工艺。方法：通过预实验和单因素试验，最终选用回

流提取法，并以乙醇浓度、乙醇的体积、提取时间为自变量，龙胆总苷的百分含量为因变量，采用 L 9(34) 正交试验设计最终确定龙胆的最佳提取工艺。结果：龙胆的最佳提取工艺为：60%的乙醇提取3次，乙醇用量为12倍，提取时间为第1次2小时，第2次1小时，第3次1小时。龙胆总苷的百分含量能达到8.73%。结论：正交试验设计法优化龙胆中龙胆总苷的提取工艺，环保，能耗低，方法简便，提取效率高，预测性良好。

[关键词] 龙胆；龙胆总苷；正交试验设计

[中图分类号] R 283.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-926X(2015)06-008-03

Study on the extraction technology of total gentiin in Longdan by orthogonal design method /XIANG Zhi-yun, LI Xiao-fang, LUO Kai-pei, LUO Jia, YANG Lu, LIN Hao, LIU Hai-xia//(Chengdu University of TCM; Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese herbal medicines; System of traditional Chinese medicine resources and Development Utilization of Ministry of State Key Laboratory Breeding Base, Chengdu 611137, China)

[Abstract] Objective: To optimize the extraction technology of total gentiin in Longdan using orthogonal design method. Method: Pre-test and one-factor test were carried to optimize the technology and re ? ux extraction was selected. Ethanol concentration, ethanol volume and extraction time were used as independent variables, the percentage of total gentiin was used as the dependent variable. L 9(34) orthogonal experimental design was applied to ultimately determine the best extraction process. Result: The optimal extraction process of gentian was as follows: 60% ethanol, extract three times(2h, 1h, and 1h each time) , 12 times of ethanol. Total gentiin percentage was 8.73%. Conclusion: The extraction process of total gentian optimized by orthogonal design is environmental with low energy consumption. The method is simple, and the extraction ef ? ciency is high with good predictability.

[Key words ] Longdan; total gentiin ; orthogonal design

正交试验设计法优选龙胆中龙胆总苷的提取工艺

?炮制制剂?

[作者单位]

成都中医药大学 中药材标准化教育部重点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

[作者简介]

向志芸，女，硕士研究生，从事中药新剂型及中药新技术研究

Tel:183******** Email:498939565@https://www.wendangku.net/doc/8d7847484.html, [通讯作者]

李小芳，女，教授，博士生导师，从事中药新剂型及中药新技术研究

Email:lixiaofang918@https://www.wendangku.net/doc/8d7847484.html, [收稿日期] 2014-04-16

中药与临床 Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2015;6(6)?24?

氧化二磷干燥器中干燥12 h以上，于十万分之一天平精密称取0.00328 g置25 mL棕色容量瓶中，先用l0 mL 70%乙醇溶解，再加乙醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液的制备 取龙胆药材粗粉(过5号筛)1 g，用10倍量70％乙醇80 ℃加热回流提取1.5 h，提取液过滤，再用8倍量70％乙醇加热回流提取1.5 h，提取液过滤，合并滤液，备用。

2.1.3 最大吸收波长的确定 分别取一定浓度的龙胆苦苷对照品溶液和供试品溶液在200~800 nm范围进行波长扫描，结果对照品和供试品均在274 nm处有较强吸收，故选择274 nm为最大吸收波长。

2.1.4 标准曲线的绘制 以龙胆苦苷为标准物，精密吸取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、

3.0 mL、3.5 mL于容量瓶中，得龙胆苦苷浓度为6.56 !

g.mL-1、13.12 g.mL-1、19.6 g.mL-1、26.24 g.mL-1、

32.8 g.mL-1、45.92 g.mL-1的溶液，以70%乙醇稀释至刻度，用紫外分光光度计在274 nm处，以70%乙醇为随行空白，测定吸光度，所得结果以龙胆苦苷溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作线性回归，得回归方程为Y=0.0192X+0.0114, （r=0.9991），对照品浓度在6.56 g.mL-1~45.92 g.mL-1范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 取同一对照品溶液，以70%乙醇为随行空白，在所确定波长处测定吸光度，连续测定五次，吸光度分别为：0.400、0.401、0.401、0.400、0.401，得RSD=0.14%，结果表明，龙胆苦苷进样精密度良好。

2.1.6 样品溶液的稳定性试验 取同一供试品溶液在室温下放置，分别于0、4、8、12、24、48 h进样测定，统计测得浓度的RSD值。结果表明，供试品溶液室温下2 d内稳定，RSD为0.2%，表明样品稳定性良好。

2.1.7 重复性实验 取同一龙胆样品5份照“2.1.2”项下制备方法制备样品溶液进行试验，测定每份样品中龙胆苦苷的百分含量。RSD为1.2%，表明该方法的重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取同一批己知含量的龙胆药材粉末9份，每份约100 mg，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入GTP对照品溶液，制备供试品溶液，测定龙胆苦苷的含量，计算高、中、低3种质量浓度的平均回收率及RSD，分别为101.2%（RSD=0.23%）、99.8%（RSD=0.41%）、98.4%（RSD=0.50%），平均回收率为99.8%，RSD为0.38%，说明该方法回收率良好。

2.2 提取方法筛选与单因素考察

为了保证实验操作方便可行以及实验结果精确，以龙胆苦苷的百分含量为指标，先进行提取方法的筛选，在此基础上在进行单因素的考察。

2.2.1 提取方法的筛选 超声提取:取龙胆药材粗粉(过5号筛)1 g，加10倍量70%乙醇，超声提取30 min，过滤，再加8倍量70%乙醇，超声提取30 min，过滤，合并滤液，备用。

加热回流提取：取龙胆药材粗粉(过5号筛)1 g，用10倍量70％乙醇80 ℃加热回流提取1.5 h，提取液过滤，再用8倍量70％乙醇加热回流提取1.5 h，提取液过滤，合并滤液，备用。

冷浸提取：准确称取龙胆药材粗粉（过5号筛）1 g，加l0倍量70％乙醇，冷浸12 h，再加8倍量70％乙醇，冷浸12 h，抽滤，合并滤液，备用。

将上述所得的3种提取液定容，测定龙胆苦苷的百分含量分别为5.87%、6.47%、6.10%。由实验结果可知，回流提取法提取效果较好。

2.2.2单因素实验考察分别考察了乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、乙醇体积（8、10、12、15、20倍）、提取时间（1h、2h、3h、4h）、提取次数（1、2、3、4次）等因素对提取龙胆苦苷的影响，有实验结果可知：提取溶媒乙醇浓度在60%~80%时，提取效果较好；提取溶剂用量为12倍、15倍、20倍时，GTP提出量显著高一些；提取2 h以上时，GTP提出量差别不大；提取3次是最适宜的。

2.3 正交试验设计

根据单因素实验考察结果，选择对实验结果影响较大的3个因素即乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)、提取时间（C）为考察因素，提取物中GTP的百分含量(Y)为考察指标，采用L

9

(34)正交表，进行4因素3水平设计，因素水平表见表1。精密称取龙胆药材粗粉1 g，按正交表依次进行实验，提取次数为3次，所得溶液滤过，用紫外分光光度计测定所含龙胆总苷的含量。正交试验安排见表2，方差分析结果见表3。

表1 正交设计因素水平表

水平

A、乙醇浓度

(%)

B、溶剂用量

（倍）

C、提取时间

（h）160121,1,1

270152,1,1

380203,2,1

中药与临床 Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica2015;6(6)?25?

表2 正交实验安排表

NO.A B C D Y（%）111117.97

212229.69

313338.43

421237.85

522318.15

62312 6.67

731328.05

832138.08

933218.81

K18.708.007.578.31

K27.568.648.788.14

K38.317.978.218.12

R 1.140.67 1.210.19

表3 方差分析表

因素平方和自由度F Sig.

提取浓度A 2.019230.3980.032<0.05溶剂用量B0.916213.7910.068

提取时间C 2.198233.0940.029<0.05误差0.0662

由极差分析结果可见，影响龙胆苦苷百分含量的因素顺序为提取时间>提取浓度>溶剂用量，P(A)<0.05，P(C)<0.05，说明提取浓度和提取时间为重要因素，P(C)>0.05，说明提取溶剂的倍数的影响没有统计学意义，可任选。因此，综合考虑生产实际，尽量节约成本，确定龙胆最优提取方案应为：60%的乙醇提取3次，溶剂用量12倍，提取时间为第1次2小时，第2次1小时，第3次1小时。

按优化得到的加热回流提取工艺重复提取三次，计算GTP提出量结果分别为8.54%、8.64%、9.02%，结果表明该加热回流提取工艺重现性良好，工艺稳定可行。

3 讨论

龙胆苦苷作为龙胆的主要活性成分，具有显著的抗肝损伤、抗病毒、抗炎作用，具有重要的开发价值。但是龙胆苦苷的提取率低严重阻碍了其开发利用，本研究旨在通过单因素试验及正交试验优选出其最佳提取工艺，为龙胆苦苷的生产及其开发利用提供实验参考。

[参考文献]

[1] 现代本草纲目[M]. 北京:中国医药科技出版社, 2001.

[2] 杨书彬, 王承. 龙胆化学成分和药理作用研究进展[J]. 中医

药学报, 2006, 33(6): 54.

[3] 刘占文, 陈长勋, 金若敏, 等. 龙胆苦苷的保肝作用研究[J].

中草药, 2002, 33(1): 47.

(责任编辑：傅舒)