提RNA+逆转录+qRT-PCR步骤

【一、提RNA】

一、实验准备：

1、试剂：75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、

2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇)，放-20℃冰箱预冷；

3、预冷离心机(1.5mL EP管用的)；

4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩；

二、操作步骤：

01、弃上清（不回收，直接倒去）；

02、1mL/孔 PBS洗两遍（不回收，直接倒去，随后用200μL枪吸尽PBS）；

03、每孔加500μL Trizol，轻晃，随后室温放置2min左右；

04、枪头吹打，吸出放入1.5mL 进口EP管；

05、加入100μL氯仿(即1/5体积的trizol)；

06、4℃离心机，12000g，15min；

07、吸200μL(可减少)上清放入新的1.5mL 进口EP管中（注意：只能吸到上清）；

08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min(15min)；

09、4℃离心机，12000g，10min；

10、倒掉液体，加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀；

11、4℃离心机，7500g，5min；

12、倒掉上清，加入1mL预冷的75%乙醇，混匀；

13、4℃离心机，7500g，5min；

14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠；

15、每管中加入40μL(40μ-60μL)的DEPC水，吹打溶解；

16、测浓度（先知楼21楼测RNA浓度，带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头）；

三、注意事项

01、如果当时不测RNA浓度，可暂时把RNA放在-20℃冰箱。但长时间(>24h)保存，需要放在-80℃冰箱；

02、异丙醇作用是沉淀RNA，作用比乙醇好；

03、

04、

05、

06、

07、

08、

09、

【二、测RNA浓度】

一、实验准备：

01、先知楼21楼-2109教室，一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10μL枪头(RNA 专用)、本子+笔；

二、操作步骤：

01、登记；

02、打开电脑==>打开“N”软件==>点击“Nucleic acid”==>选择“OK”==>选择“RNA”；

03、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；

04、DEPC水校零：即加DEPC水一滴，点击“Blank”，擦干；

05、测RNA：加样品一滴，点击“measure”，擦干，随后加下一个样品；

06、记录数据，包括RNA浓度（<1000ng/μL）、260/280；

07、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；

08、-80℃冰箱保存；

三、注意事项

230nm代表有机物水平(碳水化合物)，260nm代表RNA 水平，280nm代表蛋白水平，260/230表示有机物量，260/280代表RNA提取量；

1.A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1-1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。DNA 样品的A260 吸光度值是否>0.1。（请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于 0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值<0.1）；

2.A280nm、A270nm是蛋白最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯 DNA 的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5 相当于50％蛋白质/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm。

3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 和 RNA 的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0 标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低 DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。

4. A320nm或A340nm 为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。纯样品的A320一般是0。

5. A260/A280和A260/A230 是核酸纯度的指示值。纯度好的DNA或RNA，在pH7-8.5 下A260 / A280的比值应该在2.0 或2.5。纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍盐）等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。当0.5％BSA蛋白质污染时，蛋白污染会导致260和280的数值都下降，其净结果是260/280比值下降，但260/280的比值变化并不显著，正如分子克隆3所说。但蛋白残留会导致230的数值显著上升，显著影响260/230的比值。也就是说，如果RNA样品的260/280＝1.7，260 /230＝0.5，那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留，而是蛋白残留.用分光光度计测量RNA时，用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品会造成A260/A280比值下降。原因是低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多，那样就很容易被蛋白污染，所以现在一般取400ul左右。

6.当260/230<1时，只有两种情况。一是胍盐污染，二是蛋白污染。

【三、逆转录】

一、实验准备：

01、进口10μL枪头(qRT-PCR专用)、冰盒一个、200μL进口 EP管；

02、冰上融化1、2、4、2号试剂(提前半小时)；

03、

二、操作步骤：

试剂盒：1. 2μL

2. 0.5μL(最后加入)

3. 0.5μL

4. 0.5μL

RNA 1000ng

DEPC水

----------------10μL体系

01、200μL进口管子：EP管加相应 DEPC水==>加1号试剂（2μL）==>加3号试剂(0.5μL)==>加4号试剂(0.5μL)==>加2号试剂(0.5μL)==>加RNA==>离心==>上机；

02、上机：OPEN==>点击“User”菜单下的“clx”，点击“Accept”==>选择“run”下面的到“exp001 rt”==>修改体系“10μL”(默认为25微升)==>点击“Start”，进入界面；

03、37.0℃ 15min==>85.0℃ 5s==>4.0℃ 60min；

04、4℃冰箱保存；

三、注意事项

01、加液尽量无气泡，枪不要打到底；

02、严格冰上操作，防止RNA降解；

【qRT-PCR】

一、实验准备：

01、试剂：Roche的SyBr Green(rox)

02、1.5mL EP管、0.2mL EP管、96孔板/八连冠；10μL、20μL、100μL、200μL、2.5μL、1000μL枪；

03、冰盒一个、Rox化冻(避光)、引物化冻（GAPDH）、cDNA、DEPC水；

二、操作步骤：

01、 Rox 10μL；

+ dd H2O 6μL；

+ P1(F) 1

+ P2(R) 1

+ cDNA 2

------------20μL体系

02、计算：每个样，X个抗体(至少包括GAPDH-内参,还有目的)，三个副孔。

即如果六个样，2个抗体(GAPDH,PLK1)，三个副孔。6*1*3=18≈20(PLK1)，6*1*3=18≈20(GAPDH)；

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

6/PLK16/PLK16/PLK15/PLK15/PLK15/PLK1

6/GAP6/GAP6/GAP5/GAP5/GAP5/GAP

4/PLK14/PLK14/PLK13/PLK13/PLK13/PLK12/PLK12/PLK12/PLK11/PLK11/PLK11/PLK1 4/GAP4/GAP4/GAP3/GAP3/GAP3/GAP2/GAP2/GAP2/GAP1/GAP1/GAP1/GAP PLK1

Rox：10*20=200μL

DEPC水：6*20=120μL

F：1*20=20μL

R：1*20=20μL

GAPDH

Rox：10*20=200μL

DEPC水：6*20=120μL

F：1*20=20μL

R：1*20=20μL

03、稀释cDNA 10倍(18μL DEPC水+2μL)==>配置Mix(Rox+ DEPC水+F+R)==>加样(一横排先加18μL mix(GAPDH)，随后加入18μL mix(PLK1)。

随后六个孔加同一个cDNA；

06、去除气泡：加好样后，观察有无气泡。如果有气泡，弹开，随后>2000rpm离心，时间不定(5s即可)；

07、上机+设置程序：

A、双击打开程序“StepOne Software v2.1 ”==>点击“ OK ”==>点击“Ignore & Continue Startup ”==>点击“Advanced Setup ”==>进入“ Experment Properties界面”；

B、Experment Properties界面：

将Expriment Name从Untitled 修改为“日期，如2015-12-17”，将User Name(Optional)修改为“CZL”；

Which instrument are you using to run the experiment ?中选择“96 wells”，一般无需修改；

What type of experiment do you want to setup ?中选择“Quantitation-Comparative C T(△△C T)”；

Which reagents do you want to use to detect the target sequence ? 中选择“SYBR Green Reagents”；

Which ramp speed do you want to use in the instrument run ? 中选择“Fast(~

40 minutes to complete a run)”；

C、Plate Setup界面-Define Targets and Samples界面：

Define Targets栏中：如果有GAPDH、PLK1、Akt、PI3K三个引物，则点击“Add New Target ”三下，出现“Target1、Target2、Target3、Target4”三个==>将其重命名；

Define Samples栏中：如果有6个样品(N;1.5;3;6;9;12)，则点击“Add New Sample”，出现“Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 5、Sample 6”六个==>将其重命名；

Plate Setup界面-Assign Targets and Samples界面：

GAP/1GAP/1GAP/1GAP/2GAP/2GAP/2GAP/3GAP/3GAP/3GAP/4GAP/4GAP/4 Plk1/1Plk1/1Plk1/1Plk1/2Plk1/2Plk1/2Plk1/3Plk1/3Plk1/3Plk1/4Plk1/4Plk1/4 Akt/1Akt/1Akt/1Akt/2Akt/2Akt/2Akt/3Akt/3Akt/3Akt/4Akt/4Akt/4 PI3K/1PI3K/1PI3K/1PI3K/2PI3K/2PI3K/2PI3K/3PI3K/3PI3K/3PI3K/4PI3K/4PI3K/4 GAP/5GAP/5GAP/5GAP/6GAP/6GAP/6

Plk1/5Plk1/5Plk1/5Plk1/6Plk1/6Plk1/6

Akt/5Akt/5Akt/5Akt/6Akt/6Akt/6

PI3K/5PI3K/5PI3K/5PI3K/6PI3K/6PI3K/6

D、Run Method界面：设置温度；随后修改“Reaction Volume Per Well”，将其改为“20μL体系”；

E、点击“Start Run”

三、注意事项

01、注意一定要禁止气泡。

吸液体时，观察枪头中有没有气泡和液体；打加入液体时，延管壁加入，枪头只能打到第一档，随后观察枪头有没有打尽；

02、加入引物时，一定要涡旋混匀；

03、Rox加入后，一定要避光；

04、加入的液体一定要等量；