细胞

1. 蛋白质上主要由哪两类分选信号？

①. 信号序列（signal sequence）：是存在于蛋白质一级结构上的线性序列，通常15-60个氨基酸残基，有些信号序列在完成蛋白质的定向转移后被信号肽酶（signal peptidase）切除.

②. 信号斑（signal patch）：存在于完成折叠的蛋白质中，构成信号斑的信号序列之间可以不相邻，折叠在一起构成蛋白质分选的信号。

2. 细胞内蛋白质的分选运输途径主要有那些？

①. 门控运输（gated transport）：如核孔可以选择性的运输大分子物质和RNP复合体，并且允许小分子物质自由进出细胞核。

②. 跨膜运输（transmembrane transport）：蛋白质通过跨膜通道进入目的地。如细胞质中合成的蛋白质在信号序列的引导下，通过线粒体上的转位因子，以解折叠的线性分子进入线粒体。③. 膜泡运输（vesicular transport）：蛋白质被选择性地包装成运输小泡，定向转运到靶细胞器。如内质网向高尔基体的物质运输、高尔基体分泌形成溶酶体、细胞摄入某些营养物质或激素，都属于这种运输方式。

④. 细胞质基质中的蛋白转运：与细胞骨架相关，但具体机制不清楚

3. 哪些蛋白质需要在内质网上合成？

①向细胞外分泌的蛋白、如抗体、激素；

②膜蛋白，并且决定膜蛋白在膜中的排列方式；

③需要与其它细胞组合严格分开的酶，如溶酶体的各种水解酶；

④需要进行修饰的蛋白，如糖蛋白；

4. 高尔基体具有那三个功能区隔？

①高尔基体顺面的网络结构（cis Golgi network，CGN），是高尔基体的入口区域，接受由内质网合成的物质并分类后转入中间膜囊。

②高尔基体中间膜囊（medial Gdgi），多数糖基修饰，糖脂的形成以及与高尔基体有关的糖合成均发生此处。

③高尔基体反面的网络结构（trans Golgi network，TGN），由反面一侧的囊泡和网管组成，是高尔基体的出口区域，功能是参与蛋白质的分类与包装，最后输出。

5. 简述溶酶体的功能

①. 细胞内消化：在高等动物细胞中，一些大分子物质通过内吞作用进入细胞，如内吞低密脂蛋白获得胆固醇；在单细胞真核生物中，溶酶体的消化作用就更为重要了。

②. 细胞凋亡：溶酶体可清除，凋亡细胞形成的凋亡小体

③. 自体吞噬：清除细胞中无用的生物大分子，衰老的细胞器等。

④. 防御作用：如巨噬细胞可吞入病原体，在溶酶体中将病原体杀死和降解。

⑤. 参与分泌过程的调节，如将甲状腺球蛋白降解成有活性的甲状腺素。

⑥. 形成精子的顶体。

什么是细胞的化学通讯，有哪些类型？

是间接的细胞通讯，指细胞分泌一些化学物质（如激素）至细胞外，作为信号分子作用于靶细

胞，调节其功能。根据化学信号分子可以作用的距离范围，可分为以下4类：

①.内分泌（endocrine）：内分泌细胞分泌的激素随血液循环输至全身，作用于靶细胞。其特

点是：①低浓度，仅为10-8-10-12M；②全身性，随血液流经全身，但只能与特定的受体结合而发挥作用；③长时效，激素产生后经过漫长的运送过程才起作用，而且血流中微量的激素就足以维持长久的作用。

②.旁分泌（paracrine）：细胞分泌的信号分子通过扩散作用于邻近的细胞。包括：①各类细

胞因子（如表皮生长因子）；②气体信号分子（如：NO）

③.突触信号发放：神经递质（如乙酰胆碱）由突触前膜释放，经突触间隙扩散到突触后膜，

作用于特定的靶细胞。

自分泌（autocrine）：与上述三类不同的是，信号发放细胞和靶细胞为同类或同一细胞，常见于癌变细胞。如：大肠癌细胞可自分泌产生胃泌素，介导调节c-myc、c-fos和ras p21等癌基因表达，从而促进癌细胞的增殖。

简述磷脂酰肌醇信号途径中蛋白激酶C的活化过程？

在未受到刺激的细胞中，PKC以非活性形式分布于细胞质中，当细胞接受外界信号时，PIP2水解，质膜上DAG瞬间积累，由于细胞溶质中Ca2+浓度升高，导致细胞溶质中PKC转位到质膜内表面，被DAG活化，进而使不同类型的细胞中的不同底物蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化。

简述cAMP信号途径中蛋白激酶A的活化过程？

蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA）由两个催化亚基和两个调节亚基组成，在没有cAMP时，以钝化复合体形式存在。cAMP与调节亚基结合，改变调节亚基构象，使调节亚基和催化亚基解离，释放出催化亚基。活化的蛋白激酶A催化亚基可使细胞内某些蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化，于是改变这些蛋白的活性，进一步影响到相关基因的表达。

细胞通过哪些途径使受体失活，对刺激产生适应？

①修饰或改变受体，如磷酸化，使受体与下游蛋白隔离，即受体失活(receptor inactivation)。

②暂时将受体移到细胞内部，即受体隐蔽（receptor sequestration）

③通过内吞作用，将受体转移到溶酶体中降解，即受体下行调节（receptor down-regulation）G蛋白耦联型受体有什么特点和作用？

G蛋白耦联型受体为7次跨膜蛋白，受体胞外结构域识别胞外信号分子并与之结合，胞内结构域与G蛋白耦联。通过与G蛋白耦联，调节相关酶活性，在细胞内产生第二信使，从而将胞外信号跨膜传递到胞内。G蛋白耦联型受体包括多种神经递质、肽类激素和趋化因子的受体，在味觉、视觉和嗅觉中接受外源理化因素的受体亦属G蛋白耦联型受体。

什么是酶偶联型受体？

酶偶联型受体（enzyme linked receptor）可分为两类：其一是本身具有激酶活性，如肽类生长因子（EGF等）的受体；其二是本身没有酶活性，但可以连接胞质酪氨酸激酶，如细胞因子受体超家族。

这类受体的共同点是：①通常为单次跨膜蛋白；②接受配体后发生二聚化而激活，起动其下游

信号转导。

简述JAK-STAT信号途径

①配体与受体结合导致受体二聚化；

②二聚化受体激活JAK；

③JAK将STAT磷酸化；

④STAT形成二聚体，暴露出入核信号；

⑤STAT进入核内，调节基因表达。

简述RPTK-Ras信号通路

配体→RPTK→adaptor→G E F→Ras→Raf（MAPKKK）→MAPKK→MAPK→进入细胞核→转录因子→基因表达。

简述NO的作用机理

血管内皮细胞接受乙酰胆碱(Ach)，引起胞内Ca2+浓度升高，激活胞内一氧化氮合酶，细胞释放NO，NO扩散进入平滑肌细胞，与胞质鸟苷酸环化酶（GTP-cyclase，GC）活性中心的Fe2＋结合，改变酶的构象，导致酶活性的增强和cGMP合成增多。cGMP可降低血管平滑肌中的Ca2+离子浓度。引起血管平滑肌的舒张，血管扩张、血流通畅。

1、概述细胞核的基本结构与功能。

答：⑴细胞核包括核被膜、染色质、核仁和核骨架。

核被膜是细胞核与细胞质之间的界膜，由内膜、外膜以及二者之间的核间隙组成，其上还有的核孔是核质交换和信息交流的重要通道。

染色质由DNA、组蛋白、非组蛋白及少量RNA组成，是遗传信息储存的主要场所。

核仁含r DNA、RNA聚合酶、转录因子、r RNA 和RNP颗粒，主要完成r RNA转录加工和核糖体亚单位的组装。

⑵功能：是遗传信息的储存场所，在这里进行基因复制、转录和转录初产物的加工过程，从而参与细胞的遗传与代谢活动。

2、试述核孔复合体的结构及其功能。

答：（1）结构：核孔复合体由胞质环、核质环、辐和中央栓四部分组成。

（2）功能：是核质交换的双功能、双向性亲水通道，主要进行核质间的物质交换和信息交流。双向性表现在既介导蛋白质的入核转运，又介导RNA、核糖核蛋白颗粒的出核转运。双功能表现在它有两种运输方式：被动扩散与主动运输。在物质交换的过程中，通过信息物质的出核和入核转运并同细胞核内或细胞质内相关受体结合，实现核质间的信息交流。

3、试述核小体的结构要点及其实验证据。

结构要点：

1）每个核小体单位包括200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体及一个分子H1；

2）组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构；

3）146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈, 组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bp DNA，锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。包括组蛋白H1和166bp DNA的核

小体结构又称染色质小体；

4）两个相邻核小体之间以连接DNA 相连，典型长度60bp，不同物种变化值为0～80bp；5）组蛋白与DNA之间的相互作用主要是结构性的，基本不依赖于核苷酸的特异序列，实验表明，核小体具有自组装（self-assemble）的性质；

6）核小体沿DNA的定位受不同因素的影响，进而通过核小体相位改变影响基因表达。

主要实验证据：

1）铺展染色质的电镜观察：未经处理的染色质自然结构为30nm的纤丝，经盐溶液处理后解聚的染色质呈现10nm串珠状结构；

2）用非特异性微球菌核酸酶消化染色质，部分酶解片段分析结果，基本是200bp 或其整数倍的片段；

3）应用X射线衍射、中子散射和电镜三维重建技术研究，发现核小体颗粒是直径为11nm、高6.0nm的扁园柱体，具有二分对称性（dyad symmetry），核心组蛋白的构成是先形成（H3）2﹒（H4）2四聚体，然后再与两个H2A﹒H2B异二聚体结合形成八聚体；

4）SV40微小染色体（minichromosome）分析与电镜观察：预测含有5000 bp/200 bp=25个核小体，实际观察到23个核小体，基本吻合。

4、染色质按功能分为几类？它们的特点是什么？

答；染色质可分为活性染色质和非活性染色质。

（1）活性染色质是有转录活性的染色质，呈疏松结构，利于转录因子和DNA结合，发生活跃的基因转录。主要特点如下：具有DNase I超敏感位点；很少与组蛋白H1结合；组蛋白乙酰化程度高；核小体组蛋白H2B很少被磷酸化；其H2A少有变异形式；H3的变种只在活性染色质存在；HMG14和HMG17只存在于活性染色质中；组蛋白存在泛素化修饰。

（2）非活性染色质是指没有转录活性的染色质。常高度凝缩，其中DNA和组蛋白结合紧密，其特点和活性染色质相反。

5、分析中期染色体DNA的3种功能元件及其作用

答：自主复制DNA序列（ARS）：确保染色体在细胞周期中能够自我复制；

着丝粒DNA序列：保证染色体平均分配到子细胞中；

端粒DNA序列：DNA末端的高度重复序列，保持染色体的独立性和稳定性。包装功能基因在复制过程中不被切除，从而能够正常向下代传递。

6、试述从DNA到染色体的包装过程。DNA为什么要包装成染色质？

答：①包装模型有两种：多级螺旋模型和骨架-放射环结构模型。

从染色质DNA分子包装成染色体要压缩近万倍，多级螺旋模型认为，从DNA到染色体要经过四级包装：(1)由DNA与组蛋白压缩7倍包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接成直径约10nm的串珠结构，这时染色质包装的一级结构(2)直径约10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，压缩6倍，形成每圈6个核小体，外径30nm，内径10nm，螺距11nm的螺线管，螺线管是染色质包装的二级结构(3)螺线管进一步螺旋化，压缩40倍，形成直径为0.4um 的超螺线管，是三级结构(4)超螺线管进一步螺旋折叠，形成长2-10um的染色单体，为四级结

构。

②DNA包装成染色质后，长度压缩了近万倍，更易在细胞核的狭小空间中存在，病例与顺利完成复制、转录和分离。染色质结构的形成使得真核生物基因结构更加复杂，调节机制更加多样，从而使真核生物更能适应环境。

7.概述核仁的结构及其功能。

答：核仁是真核细胞间期核中最明显的结构。它通常是单一的或者多个匀质的球形小体。没有被膜包裹，包括：纤维中心、致密纤维阻止和颗粒组分。核仁的主要功能涉及核糖体的生物发生，包括r RNA合成、加工和核糖体亚单位的装配。

8.组蛋白与非组蛋白如何参与表观遗传的调控？

答：表观遗传是指由非DNA序列变化引起的彪形变化，主要是由DNA化学修饰导致的。

组蛋白主要参与核小体形成，形成染色质的高级结构，位于核小体上的DNA的转录活性受组蛋白和DNA间结合状态的影响。组蛋白通过甲基化、乙酰化和磷酸化而导致和DNA的结合改变，当二者之间的结合变紧密时，基因转录活性下降或不能转录，当变疏松时，基因转录活性增强或激活，从而影响表观遗传。

非组蛋白可以和DNA上的特异位点结合，引起DNA构象变化，导致DNA和其他非组蛋白以及组蛋白的结合发生变化。最终促使DNA解螺旋，DNA和组蛋白分离使染色质结构疏松，或引起基因的失活或激活，从而影响表观遗传。

9.如何保证众多的细胞生命活动在巨小的细胞核内有序进行？

答：形成相对独立的结构区域核被膜、染色质、核仁和核基质，由它们分别行使不同的功能，这时保证细胞核内各项生命活动有序进行的重要保证。

由核被膜上的核孔复合体完成亲核蛋白和其他小分子物质的入核转运；进入的调控因子和染色质上的特异DNA序列结合，调控染色质上DNA的复制、转录；转录产物在核基质中完成加工修饰后与核中的转运蛋白结合，通过核孔出核转运。同时，核仁上完成r RNA的转录加工、RNP颗粒的组装和加工，加工修饰后核糖体亚单位也通过核孔出核转运到细胞核，与细胞质基质中的m RNA结合表达蛋白。

不同的生命活动分别在不同的结构区域中完成，而且各生命活动之间存在相互作用，这共同促使在巨小的核中生命活动的有序进行。

1.N-连接的糖基化发生的部位及糖基供体分别是什么？

发生在糙面内质网，糖基供体是N-乙酰葡糖胺

2、什么是第二信使？产生的机理是什么？

第二信使的定义：第一信使分子（激素等）与细胞表面受体识别并结合后，在细胞内产生或释放早细胞内的小分子物质，如cAMP, cGMP, IP3, Ca2+, DAG等，有助于再胞内传递信号，诱发级联途径。

产生的机理：

cAMP-GPCR激活腺苷酸环化酶，催化ATP生成cAMP.

cGMP-由鸟苷酸环化酶催化GTP生成cGMP.

IP3与DAG-由G蛋白偶联受体激活质膜上的磷脂酶C的beta异构体（PLCβ），水解磷脂酸肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）产生。

Ca2+-IP3刺激细胞内质网膜上的钙离子通道，释放Ca2+进入细胞基质而升高浓度。

3、微管有哪些重要的功能？

(1) 支持和维持细胞的形态；

(2) 维持保持内膜性细胞器的空间定位分布；

(3) 细胞内运输的导轨；

(4) 与细胞运动有关；

(5) 纺锤体与染色体运动； (6) 纤毛和鞭毛运动.

4、. 简述核小体的成份与组装方式。

成份：五种碱性的组蛋白（H1，H2A, H2B, H3, H4）及200bp DNA片段。

组装方式：

1）每个核小体单位包括200bp左右的DNA超螺旋和一个组蛋白八聚体（各两分子的H2A, H2B, H3及H4）及一个分子H1；

2）组蛋白八聚体构成核小体的盘状核心结构；

3）146bp的DNA分子超螺旋盘绕组蛋白八聚体1.75圈, 组蛋白H1在核心颗粒外结合额外20bp DNA，锁住核小体DNA的进出端，起稳定核小体的作用。

4）两个相邻核小体之间以连接DNA 相连，典型长度60bp，不同物种变化值为0～80bp；5）组蛋白与DNA之间的相互作用主要是结构性的，基本不依赖于核苷酸的特异序列，实验表明，核小体具有自组装（self-assemble）的性质；

6）核小体沿DNA的定位受不同因素的影响，进而通过核小体相位改变影响基因表达。

1、微丝的化学组成及在细胞中的功能。

答：微丝的化学组成：主要成分为肌动蛋白和肌球蛋白，肌球蛋白起控制微丝的形成、连接、盖帽、切断的作用，也可影响微丝的功能。其他成分为调节蛋白、连接蛋白、交联蛋白。

微丝的功能：（1）与微管共同组成细胞的骨架，维持细胞的形状。（2）具有非肌性运动功能，与细胞质运动、细胞的变形运动、胞吐作用、细胞器与分子运动、细胞分裂时的膜缢缩有关。（3）具有肌性收缩作用（4）与其他细胞器相连，关系密切。（5）参与细胞内信号传递和物质运输。

2、什么是微管组织中心，它与微管有何关系。

答：微管组织中心是指微管装配的发生处。它可以调节微管蛋白的聚合和解聚，使微管增长或缩短。而微管是由微管蛋白组成的一个结构。二者有很大的不同，但又有十分密切的关系。微管组织中心可以指挥微管的组装与去组装，它可以根据细胞的生理需要，调节微管的活动。如在细胞有丝分裂前期，根据染色体平均分配的需要，从微管组织中心：中心粒和染色体着丝粒处进行微管的装配形成纺锤体，到分裂末期，纺锤体解聚成微管蛋白。所以说，微管组织中心是微管活动的指挥

3、简述中间纤维的结构及功能。

答：中间纤维的直径约7～12nm的中空管状结构，由4或8个亚丝组成。单独或成束存在于细胞中。中间纤维具有一个较稳定的310个氨基酸的α螺旋组成的杆状中心区，杆状区两端为非螺旋的头部区（N端）和尾部区（C端）。头部区和尾部区由不同的氨基酸构成，为高度可变区域。

功能：（1）支持和固定作用：支持细胞形态，固定细胞核。（2）物质运输和信息传递作用：在细胞质中与微管、微丝共同完成物质的运输，在细胞核内，与DNA的复制和转录有关。（3）细胞分裂时，对纺锤体和染色体起空间支架作用，负责子细胞内细胞器的分配与定位。（4）在细胞癌变过程中起调控作用。

1、细胞质基质中Ca2+浓度低的原因是什么？

答案要点：细胞质基质中Ca2+浓度通常不到10-7mol/L，原因主要有以下几点：①在正常情况下，细胞膜对Ca2+是高度不通透的；②在质膜和内质网膜上有Ca2+泵，能将Ca2+从基质中泵出细胞外或泵进内质网腔中；③某些细胞的质膜有Na+—Ca2+交换泵，能将Na+输入到细胞内，而将Ca2+从基质中泵出；④某些细胞的线粒体膜也能将钙离子从基质中转运到线粒体基质。

2、简述细胞信号分子的类型及特点？

答案要点：细胞信号分子包括：短肽、蛋白质、气体分子（NO、CO）以及氨基酸、核苷酸、脂类的胆固醇衍生物等，其共同特点是：①特异性，只能与特定的受体结合；②高效性，几个分子即可发生明显的生物学效应，这一特性有赖于细胞的信号逐级放大系统；③可被灭活，完成信息传递后可被降解或修饰而失去活性，保证信息传递的完整性和细胞免于疲劳。

3、比较主动运输与被动运输的异同。

答案要点：①运输方向不同：主动运输逆浓度梯度或电化学梯度，被动运输：顺浓度梯度或电化学梯度；②是否需要载体的参与：主动运输需要载体参与，被动运输方式中，简单扩散不需要载体参与，而协助扩散需要载体的参与；③是否需要细胞直接提供能量：主动运输需要消耗能量，而被动运输不需要消耗能量；④被动运输是减少细胞与周围环境的差别,而主动运输则是努力创造差别,维持生命的活力。

4、NO的产生及其细胞信使作用？

答案要点：NO是可溶性的气体，NO的产生与血管内皮细胞和神经细胞相关，血管内皮细胞接受乙酰胆碱，引起细胞内Ca2+浓度升高，激活一氧化氮合成酶，该酶以精氨酸为底物，以NADPH为电子供体，生成NO和胍氨酸。细胞释放NO，通过扩散快速透过细胞膜进入平滑肌细胞内，与胞质鸟苷酸环化酶活性中心的Fe2+结合，改变酶的构象，导致酶活性的增强和cGMP 合成增多。cGMP可降低血管平滑肌中的Ca2+离子浓度，引起血管平滑肌的舒张，血管扩张、血流通畅。NO没有专门的储存及释放调节机制，靶细胞上NO的多少直接与NO的合成有关。

5、钙离子的主要作用途径有哪几种？

答案要点：主要有：①通过钙结合蛋白完成作用，如肌钙蛋白C、钙调素；②通过钙调素活化腺苷酸环化酶及PDE调节cAMP水平；③作为双信使系统的传递信号；④参与其它离子的调节。

6、G蛋白的类型有哪些？

答案要点：G蛋白有两种类型一种是刺激型调节蛋白（Gs），另一种是抑制型调节蛋白（Gi）。二者结构和功能很相似，均由α、β和γ三个亚基组成，分子质量均为80~100000D，它们的β和γ亚基大小很相似，其α亚基也都有两个结合位点：一是结合GTP或基其类似物的位点，具有GTP酶活性，能够水解GTP；另一个是含有负价键的修饰位点，可被细胞毒素ADP核糖基化。二者的不同之处在于Gs的αS亚基能被霍乱毒素ADP核糖基化，而Gi的αi亚基能被百日咳毒素ADP核糖基化。Gs和Gi都调节其余相应受体的亲合性以及作用于腺苷酸环化酶，产生cAMP。

7、简要说明由G蛋白偶联的受体介导的信号的特点。

答案要点：G蛋白偶联的受体是细胞质膜上最多，也是最重要的倍转导系统，具有两个重要特点：⑴信号转导系统由三部分构成：①G蛋白偶联的受体，是细胞表面由单条多肽链经7次跨膜形成的受体；②G蛋白能与GTP结合被活化，可进一步激活其效应底物；③效应物：通常是腺苷酸环化酶，被激活后可提高细胞内环腺苷酸（cAMP）的浓度，可激活cAMP依赖的蛋白激酶，引发一系列生物学效应。⑵产生第二信使。配体—受体复合物结合后，通过与G蛋白的偶联，在细胞内产生第二信使，从而将胞外信号跨膜传递到胞内，影响细胞的行为。根据产生的第二信使的不同，又可分为cAMP信号通路和磷酯酰肌醇信号通路。

cAMP信号通路的主要效应是激活靶酶和开启基因表达，这是通过蛋白激酶完成的。该信号途径涉及的反应链可表示为：激素→G蛋白偶联受体→G蛋白→腺苷酸环化化酶→cAMP →cAMP依赖的蛋白激酶A→基因调控蛋白→基因转录。

磷酯酰肌醇信号通路的最大特点是胞外信号被膜受体接受后，同时产生两个胞内信使，分别启动两个信号传递途径即IP3—Ca2+和DG—PKC途径，实现细胞对外界信号的应答，因此，把这一信号系统又称为“双信使系统”。

8、磷酯酰肌醇信号通路的传导途径。

答案要点：外界信号分子→识别并与膜上的与G蛋白偶联的受体结合→活化G蛋白→激活磷脂酶C→催化存在于细胞膜上的PIP2水解→IP3和DG两个第二信使→IP3可引起胞内Ca2+浓度升高，进而通过钙结合蛋白的作用引起细胞对胞外信号的应答；DG通过激活PKC，使胞内pH值升高，引起对胞外信号的应答。

细胞生物学常用研究方法

Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。 Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。 扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。 免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。 电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。 DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信

肠系膜淋巴结细胞MLNs和固有层单核细胞LPMCs

外周血单个核细胞的分离 3．1．4．2密度梯度分离 从肘静脉无菌采集外周EDTA抗凝血5ml，用等量的生理盐水稀释，将稀释血液按1：1比例小心缓慢加在淋巴细胞分离液上，室温800xg离心30rain，离心后分四层，上层为血浆、血液稀释液和大部分血小板，下层为红细胞和粒细胞，中间层是淋巴细胞分离液，分离液和血浆交界部位的乳白色混浊液体就是单个核细胞层，小心吸取该层，加入10．15ml生理盐水洗涤，室温250xg离心10min，弃上清；再重复洗涤两次，弃上清。 3。1．4．3外周血单个核细胞样品RNA的抽提和纯化 将分离好外周血单个核细胞样品的迅速加入lml trizol，冰浴匀浆使细胞样品充分裂解。转移到一1．5ml DEPC处理的无菌离心管中，加入400ul氯仿，剧烈震荡混匀，4度12000rpm离心10min。转移上清至另一离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，剧烈震荡混匀，4度12000rpm离心10rain。转移上清至另一离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，剧烈震荡混匀，4 度12000rpm离心10min。转移上清至另一离心管中，加入等体积异丙醇，震荡混匀，室温放置2min，4度12000rpm离心10min。轻轻移弃上清，防止吸去沉淀，加入lml 70％乙醇，悬浮沉淀，4度12000rpm离心10min。轻轻移弃上清，防止吸去沉淀，4度12000rpm离心lmin，用移液器吸干残余酒精，室温空气干燥，使酒精挥发，加入50ul DEPC处理的灭菌水，溶解RNA。电泳察看RNA的浓度和完整性。 在微量Tube中配制下列反应液，全量50ul

全RNA 20ug 1 0xDnase I Buffer 5ul Dnase I(Rnase-free，5U／u1) 2ul Rnase Inhibitor(40U／u1) 0．5ul DEPC处理水 upto 50ul 37℃反应20．30分钟。加入50ul的DEPC处理水。加入100ul(等量)的苯酚／氯仿／异戊醇(25：24-1)，充分混匀。离心，取上层(水层)移至另一微量离心管中。加入10ul(1／10量)的3 M NaOAC(pH5．2)。加入250ul(2．5 倍量)的冷无水乙醇，．20。C放置30．60分钟。离心回收沉淀，用70％的冷乙 醇清洗沉淀，真空干燥。用适量的DEPC处理水溶解后，进行Agarose电泳确认是否除去基因组DNA。 3．1．4．4 RNA反转录上海交通大学博士学位论文 RNA(2u曲xul Primer(oligo dT)lul RNase抑制剂0．5ul 补DEPC水至终体积lOul。轻轻混匀并在微量离心机低速将混合液收集在 底部。75"C水浴5 min，迅速冰浴2rain。离心收集混合液至管底。 每个反应管中顺序加入以下试剂： 5×RT Buffer 4ul dNTP Mix(10 mM each) 1 ul RNase抑制剂 O．5ul

细胞研究进展概述

细胞研究进展概述——干细胞技术 20092358 谢芬霏16120901 生物技术 摘要：干细胞是人体及各种组织细胞的最初来源，具有高度自我复制、高度增殖和多项分化的潜能。干细胞的研究正在向现代生命科学和医学等各个领域交叉渗透，干细胞的研究也成为了生命科学的热点，本篇就几个干细胞的研究方向的进展展开一些介绍。 关键词：干细胞；多能性；神经干细胞；造血干细胞 引言： 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell,TSC)、多能干细胞（pluripotent stem cell）和单能干细胞（unipotent stem cell）。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。干细胞的形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。胚胎干细胞(Embrtibuc stem cell)的发育等级较高，是全能干细胞（Totipotent stem cell），而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。据最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。在胚胎的发生发育中，单个受精卵可以分裂发育为多细胞的组织或器官。在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生。胚胎的分化形成和成体组织的再生是干细胞进一步分化的结果。胚胎干细胞是全能的，具有分化为几乎全部组织和器官的能力，而成体组织或器官内的干细胞一般认为具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。 1 胚胎干细胞 1.1 胚胎干细胞的概念和生理学特性 胚胎干细胞（Embryonic Stem cell，ES细胞）。胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。胚胎干细胞的生物学特性有：①全能性，在体外培养的条件下, 胚胎干细胞可以诱导分化为机体的任何组织细胞。全能性的标志是细胞表面有胚胎抗原和Oct4蛋白【1】。②无限增殖性。胚胎干细胞在体外适宜条件下, 能在未分化状态下无限增殖。③胚胎干细胞具有种系传递的功能。④胚胎干细胞易于进行基因改造操作。⑤细胚胎干胞保留了正常二倍体的性质且核型正常。早在1970年Martin Evans已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养【2】，而人的胚胎干细胞的体外培养直到最近才获得成功。进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。目前许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组在去年成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。此后，密苏里的研究人员通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。随着ES细胞的研究日益深入，生命科学家对人类ES细胞的了解迈入了一个新的阶段。在98年末，两个研究小组成功的培养出人类ES细胞，保持了ES细胞分化为各种体细胞的全能性。这样就使科学家利用人类ES细胞治疗各种疾病成为可能。然而，人类ES 细胞的研究工作引起了全世界范围内的很大争议，出于社会伦理学方面的原因，有些国家甚至明令禁止进行

细胞固定化技术的发展历程和主要应用

细胞固定化技术的发展历程和主要应用 早在 1 9世纪初叶，人们发现某些微生物细胞具有一种吸附在固体物质表面的天然倾向和特殊功能，并以这种方式被束缚和固定起来。从20世纪印年代开始，国际上固定化酶的研究迅速发展起来;到70年代，作为发酵源的微生物菌体本身的固定化，即固定化微生物，也引起了人们极大的关注。固定化技术是将酶或细胞通过物理或化学方法固定在不溶性或水溶性的膜状、颗粒状、管状的载体上，一般能明显地提高酶对热和酸碱度的稳定性。固定化技术在连续反应过程中不会流失，可用简单的方法回收再生，可使生产连续化，具有节约能耗、降低成本、简化环保措施等诸多优点，使其在生产中被迅速推广。 固定化细胞在食品工业中的应用 目前，世界各国都把固定化细胞研究的成果很快地运用于工业生产过程中，其应用范围远远超出食品加工、轻化工业和制药工业，现已扩展到化学分析、环境保护,能源开发等领域。 一、生产果葡萄糖浆利用微生物的a一淀粉酶和葡萄糖淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖，再用葡萄糖异构酶将葡萄糖转变为较蔗糖更甜的果糖。经提纯、浓缩，即可制得替代蔗糖的新糖源，即含葡萄糖、果糖的果葡糖浆。 1966年日本在工业规模上利用微生物菌体生产果葡糖 浆，首次获得成功，并正式投人生产。1969年又采用菌 体热固法制成的固定化细胞，实现了生产的连续化，产量 达11万t,1978年产量达到100万t以上。其制得的固 定化异构酶微生物生物反应器半衰期289 d1131。 二、柑桔类果汁的脱苦柠檬苦素类脱苦酶，其最适PH值都偏向碱性，而影响其在柑桔加工中的使用，但可以将产生这些酶的细菌细胞固定化，以用于柑桔果汁的脱苦。球形节杆菌含有柠檬苦素D一环水解酶和柠檬酸A一环内醋脱氢酶，可将柠檬苦素转化成17一脱氢柠檬酸A一环内醋;球形节杆菌n含有柠檬苦素醇脱氢酶，可将柠檬苦素转化成柠檬苦素醇.2001年，张惟广等研究了用于柑桔汁脱苦的固定化醋酸杆菌细胞的特性，研究表明，固定化细胞脱苦最佳供氧为:摇床转速160r./min，最适声为4.5,最适温度为25℃;而游离细胞脱苦的相应条件分别为160 r/min,州为5.5，最适温度为25℃。低浓度NaCl对固定化细胞和游离细胞的脱苦都有强烈的抑制作用;固定化细胞在柠碱浓度达到30 mg/纯后，柠碱降解速度趋于饱和，而游离细胞的柠碱浓度则为35mg/kg，固定化细胞的热稳定性比游离细胞好。 三、酱油生产采用固定化细胞技术生产酱油，生产周期缩短。酱油风味改善，速酿优质酱油。Iwasaki等人比较研究了海藻凝胶、圆柱陶瓷和陶瓷颗粒等3种固定化细胞体系在分批发酵过程中的性能。发现3种固定化细胞的产酸能力大致相同，分别为5.2, 5 .3和 4.8k g/衬·d，高于游离细胞的0.5一1.0 kg/衬"d。并提出了一种新的酱油生产工艺，将细胞截留在一个搅拌罐反应器与超滤装置相结合的膜生化反应器中〔161。结果表明，通过膜装置连续移出发酵，产品风味良好，生产效率提高。在酱油的制作过程中，结合酵母和假丝酵母发酵产生多种重要的风味物质，赋予大豆酱油独特的风味。北京金狮酿造六厂选用聚乙烯醇作

细胞培养基种类

细胞培养基的选择及常用数据库 日期：2012-04-13来源：未知作者：网友点击：次细胞实验技术 经典的培养基有很多种，Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。 ◆MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的，其中增加了组分的范围及 浓度。 ◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的，现在常用于 贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L，这就是大家常说的低糖和高糖了。 ◆ aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸，它可广泛应用于各种细 胞类型，包括对营养成分要求苛刻的细胞。 ◆ Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于 克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物，这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。 ◆ RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的，现在已广泛应用于悬浮细胞 的培养。 以前经常听到有人问，这种细胞该用哪一种培养基呢?其实这个问题的答案可以很简单，也可以好复杂。此话怎讲?如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库，那很简单，问供应商就行了。或者找到相关的文献，作为参考。Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具，也很好用。选择你感兴趣的细胞类型，它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等，有时还有优化好的转染步骤，很方便。Sigma网站上也有一个Media Expert，包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等，它还

细胞生物学研究方法

细胞由于体积小，一般需在显微镜下观察，显微镜一般分为光学显微镜与电子显微镜。显微镜的放大倍数由目镜与物镜决定：放大倍数=物镜×目镜。清晰与否由分辨率（指能够分辨出相邻两质点间的最小距离，距离越小，分辨率越高）决定。一般来说，光镜分辨率为0.2微米，电镜分辨率为0.2纳米。分辨率的限制因素为：入射光波长，介质折射率，物镜镜口角。 光学显微镜结构为：光学显微系统，光源，机械支撑系统，有些还有图像采集系统。常见有三种：复式显微镜，相差显微镜以及荧光显微镜。 复式显微镜分为单筒显微镜，双筒显微镜。复式光学显微镜较为简单，照明系统为可见光，光学系统为玻璃透镜（目镜，物镜以及聚光镜），另外还有机械与支架系统。普通复式显微镜的缺点：由于光的干涉，衍射现象，光线通过样品时，两个相邻焦点的图像可能发生重叠，进而无法分辨，导致存在分辨极限。 相差显微镜是指利用光线的干涉，衍射特征，时相位差转变为振幅差，增强样品的明暗对比，从而观察无色透明样品的装置。相差显微镜的特殊构件为相差板，环状光阑。相差显微镜的特点：样品无需染色，可观察活细胞及细胞器动态。 荧光原理：荧光分子吸收入射光能量以后，电子由基态跃迁到激发态。激发态电子不稳定，会自发跃迁回基态，并辐射荧光。荧光显微镜原理：利用短波长电磁波为光源，激发样品辐射荧光，之后利用样品产生的自发荧光或诱发荧光，对细胞内特异性蛋白质进行定性与定位研究的装置。荧光显微镜的优点：荧光显微镜主要用于定性，定位研究细胞内特异性蛋白质，可以观察活细胞。缺点：无法排除来自样品焦平面以外的荧光，使得图像的反差与分辨率降低。 光学显微镜样品的制备：固定，包埋，切片，染色 固定：目的是杀死细胞，稳定细胞成分，以便进一步处理和切片是不受破坏。

细胞周期同步化

细胞周期同步化 在细胞培养过程中，细胞多处于不同的细胞周期时相中，其中有少数细胞在进行有丝分裂 活动，其余细胞分别处于G1、S和G2各期。不同时相的细胞对药物干预存在不同反应，会影响实验的重复性，因此，需要获得周期一致性的细胞。利用细胞同步化技术可使细胞大 量的处于同一细胞时期，并可获得该时期大量的物质，如细胞中期时的染色体。细胞周 期同步化(synchronization)是指为了研究某一时相细胞的代谢、增殖、基因表达或凋亡，借助某种自然或人为的实验手段,使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相( 除了G0期的细胞)的现象。细胞同步化本质上包括用一定的方法获得一定数量的同步 化细胞群和使细胞进入同步化生长的两层含义。 DNA 合成抑制法是通过抑制DNA合成将细胞同步于同一时期的方法。高浓度TdR(胸腺 嘧啶核苷)双阻断法是目前常用的抑制DNA 合成的同步化方法。它可逆地抑制DNA 合成， 而不影响其他时期细胞的转运，最终可将细胞群阻断在S 期或G1 /S 交界处。其原理是: TdＲ是细胞DNA 合成不可缺少的前体，但向培养基中加入过量TdＲ，可形成过量的三磷酸腺苷，后者能反馈抑制其他核苷酸的磷酸化，从而抑制DNA 合成。它将细胞同步于G1 /S 期交界处，同步化程度高，适用于任何培养体系，可将几乎所有的细胞同步化，但是容易 产生非均衡生长，个别细胞体积增大。TdＲ双阻断法因为简单易行且可逆，在肿瘤药理方面对细胞周期同步化的实验中得到了广泛的应用。羟基脲、5-氟脱氧尿嘧啶、阿糖胞苷、 氨甲蝶呤和高浓度ADR、GDR也属于DNA合成抑制剂，它们与TdR作用相似，均可通过抑制DNA合成达到同步化的目的。 中期阻断法是利用破坏微管的药物将细胞阻断在M期从而得到同一时期细胞的方法，常 用的药物有秋水仙素等。秋水仙素通过抑制微管的聚合，进而抑制有丝分裂装置的形成， 将细胞阻断于有丝分裂中期然后再释放使细胞达到同步化。中期阻断法非平衡生长问题不 明显，但可逆性比较差，当阻断时间过长时，许多细胞产生异常分裂。过去研究中也发现，同步后的细胞的生长能力明显不如撤去阻断剂后得到的S期细胞旺盛。秋水仙胺、Nocodazole也是目前常用的中期阻断剂。 经过同步化之后的细胞可以通过流式细胞术对其周期进行分析。将细胞用PI（碘化丙啶）染液进行染色，使用流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时 相的百分比。由于细胞的DNA含量在不同时期有显著的差异，因此可以将细胞分成G1/G0 期（1倍），S期（1-2倍）和G2/M期（2倍）。流式细胞仪可以根据DNA含量在不同时间内的变化,从而确定细胞周期的长短,也可以直接标记DNA复制（放射性同位素标记）,统计细胞数量与标记细胞的百分比,对细胞周期进行综合分析. 连续分裂的细胞从上一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的整个过程为细胞周 期(cell cyc1e)。细胞周期包含四个阶段：①G1期(first gap),又称合成前期，指前一次 有丝分裂完成到DNA复制前的一段时期；②S期(synthesis phase),即DNA合成期，为真 核细胞分裂(cell pision)间期中进行DNA合成的阶段；③G2期(second gap),为DNA合成 后期，指DNA合成结束至有丝分裂开始之间的一个阶段；④M期 (mitosis or pision) , 又称D期，是染色体真正开始分离时期。细胞周期又可分为有丝分裂期（M期）和分裂间 期(即G1→S→G2)两个时期。尽管细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异，但相 对而言M期最短，S期较长。流式细胞仪（flow cytometer；FCM）的工作原理是在样品管 中放入待测细胞，在气体的压力下使待测细胞进入充满鞘液的流动室。在细胞流动室里单 细胞悬液被鞘流液包绕通过流动室内一定孔径的孔，形成细胞柱。然后通过对流动液体中 单列的细胞进行逐一检测，得到单个细胞的光散射和荧光指标，在功能水平上定量分析出 其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等的物理、化学特征等多个参数。流式细胞 仪不仅可以根据不同时间内DNA含量的变化来确定细胞周期的长短，还可以直接用放射性

工作细胞和自律细胞

1.普肯耶细胞的跨膜电位及其形成机制 普肯耶细胞动作电位波形、分期和形成原理与心室肌细胞基本相同，其不同点在于4期膜电位并不稳定，出现自动地缓慢去极化，当去极化达阈电位水平时即引发下一个动作电位。 普肯耶细胞4期自动除极的机制：目前认为4期有一种随着时间而逐渐增强的内向电流（If），主要是Na+内流，从而导致自动除极。另外，4期内导致膜复极化的外向K+电流（Ik）逐渐减弱，亦有助于膜去极化。 2.窦房结细胞的跨膜电位及其形成机制 窦房结含有丰富的自律细胞，动作电位复极后出现明显的4期自动除极，但它是一种慢反应自律细胞，其动作电位具有许多不同于心室肌（快反应细胞）和普肯耶快反应自律细胞的特征： （1）窦房结细胞的最大复极电位（-60～-65mV）和阈电位（-40mV）的绝对值均小于普肯耶细胞； （2）0期是由于细胞膜上慢钙通道被激活，Ca2+内流而形成。0期除极结束时，动作电位幅值约70mV，超射小； （3）其除极幅度（70mV）小于普肯耶细胞（为120mV），而0期除极时程（7ms 左右）却比后者（1-2ms）长得多。因此，动作电位升支远不如后者那么陡峭； （4）没有明显的复极1期和平台期； （5）4期自动除极速度（约0.lV/s）比普肯耶细胞（约0.02V/s）快。 窦房结细胞4期自动除极机制： （1）进行性衰减的K+外流是窦房结细胞4期除极的重要离子基础之一； （2）进行性增强的内向离子流If（主要是Na+内流。但它不同于心室肌0期除极的Na+内流。此钠流可被铯所阻断）； （3）T型钙通道被激活，Ca2+内流。在自动除极过程的后半期，窦房结细胞上的T型钙通道被激活，Ca2+内流使膜电位进一步减小，当除极达-40mV时，激活L型钙通道，引起下一个自律性动作电位。 因此，根据0期去极的速度可将心肌细胞分为快反应细胞与慢反应细胞；根据4期有无自动去极化可分为自律细胞与非自律细胞。如心室肌细胞为快反应非自律细胞，窦房结细胞为慢反应自律细胞。

细胞研究论文

细胞研究论文 骨缺损的治疗，由局部伤情复杂和缺乏理想的修复材料，一直是困扰临床医生和基础医学工作者的一大难题，而寻找一种尽可能达到或接近自体骨移植效果的理想的骨替代材料更是无数学者热切探索、孜孜以求的目标。近年来日趋活跃的骨组织工程技术为这一课题的研究带来了新的亮点和希望。目前动物实验已能从骨膜、骨髓等定向性骨祖细胞密集处分离培养出成骨细胞，经体外扩增并与载体结合，回植体内骨缺损处取得骨缺损修复的成功［1］。与此同时，基于对患者易接受性、可操作性和更简单易行性等方面的考虑，研究者又开始把目光投向诱导性骨祖细胞。其中，在体内分布广泛、数量巨大、部位表浅、取材方便、培养传代易行、分裂增殖迅速的成纤维细胞首先成为了研究的焦点。由于目前许多相关研究尚处于实验阶段，为此，本文着重就成纤维细胞的生物学特性及其成骨作用等作一综述。 1 成纤维细胞的及其生物学特性 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。 不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔

组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位［2，3］。 成纤维细胞形态多样，常见的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测，这两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生化结构上完全相同［4,5］。 处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。 2 成纤维细胞在一般创伤修复中的表现

细胞爬片免疫组化

固定液配方（细胞免疫组化，用的是4%多聚甲醛固定的）： 我们用的4%多聚甲醛是先配制成12.5%的，然后再用0.1m PB稀释的。 0.1m PB配方（PH值7.4）1000ml 磷酸氢二钠48.693g 磷酸二氢钠 5.023g 三蒸水1000ml 12.5%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml 多聚甲醛125g 三蒸水1000ml 磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下，如仍不溶，加NaOH （三蒸水先放800ml，10小时左右，再补加200ml） 4%多聚甲醛（PH值7.4）1000ml 12.5%多聚甲醛320ml 0.1m PB 680ml 步骤： 1 将已消毒的20mm盖玻片置于90mm培养皿中，按2*104/ml的细胞密度将细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色鉴定。 2 PBS清洗标本3次各1 min。 3 冰丙酮固定15 min。 4 空气干燥5min。 5 PBS清洗标本3次各2 min。

6 0.5%Triton X-100( DPBS配) 孵育1次20 min。 7 PBS清洗标本3次各2 min。 8 3%H2O2孵育15 min。 9 DPBS清洗标本3次各2 min。 10 封闭血清孵育（5%正常二抗血清DPBS液）20min。 11一抗孵育（PBS配，滴度1：200，湿盒）4OC 过夜或37OC 60 min。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液 12 PBS清洗标本3次各5 min。 13 二抗工作液孵育（湿盒）37OC 30 min。 14 PBS清洗标本3次各5 min。 15 C液（湿盒）37O C30 min。 16PBS清洗标本3次各5 min。 17DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。 18蒸馏水洗2次1 min。 19苏木素复染0.5~1min。 20自来水洗30min。 21树胶封片。 注意事项： 1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下： （1）对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5天以上，这样细胞爬片才较牢固，冲洗时不易脱片； （2）接种的细胞密度适中，以2*104/ml为宜，若细胞密度太高，5天后细胞连接成片冲洗时易脱片； 2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4O C冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。 3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片） 4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜 5、Triton X-100（屈立通）表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。

分子克隆及细胞培养基本实验方法

分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）

①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应

干细胞研究发展历程.

1950：将骨髓细胞移植到遭受致死剂量辐射的动物，发现能够挽救生命，重建骨髓造血免疫系统 1960：真正认识和了解人和哺乳动物干细胞始于20世纪60年代 1961：Till 和Mc Culloch 提出多能干细胞概念 1967：多纳尔–托马斯完成第一例骨髓移植，后于1990年获得诺贝尔医学和生理学奖 1980：造血干细胞移植成为治疗多种疾病的重要手段 1981：Evans等首次成功建立小鼠胚胎干细胞系 1981：胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）的分离和培养首先在小鼠中获得成功 1988：美国科学家James Thomson分离出人类胚胎干细胞 1998：美国两个科研小组分别报告从胚胎和生殖脊成功建立人类胚胎干细胞系，使人类胚胎干细胞能在体外生长和增殖 同年，美国科学家在《美国科学院院刊》上报告：小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化为血液细胞”。此后，世界各国科学家相继证实，包括人类的成体干细胞具有可塑性，从而掀起了全球成体干细胞研究高潮。干细胞研究进展被《科学》杂志评选为该年度世界十大科学成就之首。人类ES (hES)细胞建系获得成功，由此推动了干细胞研究的兴起。 2000： 日本把以干细胞工程为核心技术的再生医疗列为“千年世纪工程”之一，当年投资108亿日元；同年，全世界有10622例造血干细胞移植。 成体干细胞移植使糖尿病大鼠恢复正常 神经干细胞能够进入脑组织并修复脑损伤 角膜干细胞有助于恢复视力 发现成人骨髓干细胞形成肝细胞 成人骨髓干细胞可以在合适的条件下转化为神经细胞 成人骨髓干细胞可以在体外大规模培养 证实成人骨髓干细胞可以形成多种类型组织

细胞免疫组化常用试剂配制

免疫细胞化学常用试剂 一、固定剂 大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。 目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。 1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3） 试剂：多聚甲醛40g 0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml 配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。 2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠 试剂：A液：多聚甲醛40g 蒸馏水400ml B液：Na2HPO4·2H2O16.88g 蒸馏水300ml C液：NaOH 3.86g 蒸馏水200m

配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。 该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。该固定剂较温和，适于组织的长期保存。组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。 3．Bouin’s液及改良Bouin’s液 试剂：饱和苦味酸 40%甲醛250ml 冰醋酸50ml 配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。改良Bouin’s液即不加冰醋酸。 该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。 4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液 试剂：多聚甲醛20g 饱和苦味酸 150ml Karasson-Schwlt’s PB至1000ml 配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。 该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。固定时间为6～18h。 5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液 （Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）

第九章 细胞信号转导知识点总结

第九章细胞信号转导 细胞通讯：一个信号产生细胞发出的信息通过介质（又称配体）传递到另一个靶细胞并与其相应的受体相互作用，然后通过信号转导产生靶细胞内一系列的生理生化变化，最终表现为靶细胞整体的生物学效应。 信号传导：是指信号分子从合成的细胞中释放出来，然后进行传递。信号传导强调信号的产生、分泌与传送。 信号转导：是指信号的识别、转移与转换，包括配体与受体的结合、第二信使的产生及其后的级联反应等。信号转导强调信号的接收与接收后信号转换的方式与结果。 受体：是一类能够结合细胞外特异性信号分子并启动细胞反应的蛋白质。 第二信使：细胞外信号分子不能进入细胞，它作用于细胞表面受体，经信号转导，在细胞内产生非蛋白类小分子，这种细胞内信号分子称为第二信使。 分子开关：细胞信号传递级联中，具有关闭和开启信号传递功能的分子。 信号通路：细胞接受外界信号，通过一整套特定机制，将胞外信号转化为胞内信号，最终调节特定基因表达，引起细胞的应答反应，这种反应系列称为细胞信号通路。 G蛋白偶联受体：指配体-受体复合物与靶细胞的作用是要通过与G蛋白的偶联，在细胞内产生第二信使，从而将细胞外信号跨膜传递到胞内影响细胞行为的受体。 cAMP信号通路：细胞外信号与细胞相应受体结合，导致细胞内第二信使cAMP 水平的变化而引起细胞反应的信号通路。 （磷脂酰肌醇信号通路）双信使系统：胞外信号分子与细胞表面G蛋白偶联受体结合，激活膜上的磷脂激酶C，使质膜上的PIP2分解成IP3和DAG两个第二信使，将胞外信号转导为胞内信号，两个第二信使分别激活两种不同的信号通路，即IP3-Ca2+和DAG-PKC途径，实现对胞外信号的应答，因此将这种信号通路称为“双信使系统”。 钙调蛋白：真核细胞中普遍存在的Ca2+应答蛋白。 Ras蛋白：Ras基因的产物，分布于质膜胞质侧，结合GTP时为活化状态，结合GDP时失活状态，因此Ras蛋白属于GTP结合蛋白，具有GTP酶活性，具有分子开关的作用。

小鼠胚胎干细胞培养体系的建立

第19卷第2期 江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997 α 小鼠胚胎干细胞培养体系的建立 汪河海1　刘红林2　范必勤1　钟　卉3　丁家桐4 (1　江苏农科院牧医所,南京　210014;2　南京农业大学动物科技学院,南京　210059;3　南京铁道医学院,南京　210009;4　扬州大学农学院动物科学系　225009) 摘 要 通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。 关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系 中图分类号:S865.1 胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。 1　材料和方法 111　动物准备 选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。 112　溶液的配制 按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。 113　胎儿成纤维细胞饲养层的制备 α

光镜下细胞大小的测量与计数

光镜下细胞大小的测量与计数 一、实验目的 1.学会观察某些细胞形态，掌握显微镜使用方法。 2.掌握测量和计算细胞大小的方法。 3.掌握台尺，目尺的使用方法，知道细胞度量单位。 4.掌握血球计数板的使用方法 二、实验原理 （一）显微测微尺 显微测微尺分物镜测微尺和目镜测微尺，目镜测微尺为一块可以放入目镜内的圆形玻片，玻片中央有一长5-10mm的刻度尺，分成50-100格。每格的实际长度随不同的物镜放大倍数而变化。物镜测微尺为一载玻片中封固一圆形测微尺组成，测微尺的长度为1-2mm，分成100或200格，每格实际长度0.01mm。当测量细胞大小时，须在显微镜下用物镜测微尺核实目镜测微尺的每一格长度，然后再用目镜测微尺去测定标本。 换算公式：目尺每格长度（mm）= 物尺的格数/目尺的格数×10? （二）血球记数板 现在使用的记数板为改良Neubauer记数板，由一优质厚玻璃制成，每块记数板分为两个记数室。在记数室两侧各有一条支柱，与记数室高度差是0.1mm，当一块平整的记数用盖玻片放到两条支柱上时，盖玻片底面与记数室间形成0.1m的缝隙。每个记数室的边长各为3 mm，并被精密地划分为9个大方格，每个大方格长宽各为1.0mm，面积为1mm2，加盖玻片后的容积为1mm2?0.1mm=0.1mm3（相当于0.1?），所以一个大方格的细胞数×104 =细胞数/ml。记数细胞时，记数四个大方格中的细胞数，按下公式计算：

细胞悬液的细胞数/ml=(四个大方格中的细胞总数/4) ×104 三、实验器材、药品 普通光学显微镜，微分尺（目尺和台尺），血球计数板，洋葱内表皮细胞,小鼠脾细胞等。 四、实验步骤 （一）在光学显微镜下测量细胞大小： 1.卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度一面向下装在目镜镜面上，再旋上目镜的上透镜。 2.将镜台测微尺有刻度一面朝上放在载物台上夹好，用低倍镜观察，调焦至看清镜台测微尺的刻度。 3.小心移动镜台测微尺，同时转动目镜(如目镜测微尺刻度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦)，使目镜测微尺与镜台测微尺平行靠近，两尺左边的\"0\"点一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重复的直线。 4.记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按公式计算目镜测微尺每格的长度等于多少mm。 5.拿开台尺，放上细胞标本片，开始测量，按上述公式计算。 （二）细胞计数 （1）准备计数板：用去离子水浸泡并冲洗计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干或晾干。 （2）制备细胞悬液：用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。本法要求细胞密度不低于104细胞/ml,若细胞数很少，应将悬液离心（1000rpm，2 min），重悬浮于少量培养液中。