包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验

蛋白的纯化

第二部分：蛋白的纯化 如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？ 破碎细胞后离心分别收集上清和沉淀，表达的蛋白可能分布在上清中也有可能分布在沉淀中，还有可能是二者中都有分布。 根据我们实验室的经验，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本上是可溶的。但如果超声完之后，菌液是浑浊的，而且当离心之后，离下的沉淀比较多，而且沉淀的颜色也比较白，那基本上就是包涵体了。包涵体是基因重组蛋白在大肠杆菌中高水平表达时所形成的无活性的蛋白质聚集体，难溶于氺，可溶于变性剂如尿素，盐酸胍等，其实，包涵体也就是我们常说的不可溶蛋白。对于后者，可将上清和沉淀分别跑一个PAGE,看看上清中的量能达到多少，对于某些蛋白来说，一部分是以包涵体形式表达，一部分是以可溶的形式表达，而且量也不少，可以满足后续实验的需要，这个时候最好是纯可溶的，因为包涵体即使最后复性，活性也不太可信。 对于沉淀跑SDS-PAGE，如何处理，用什么使其溶解，还有在大肠杆菌中表达的蛋白，在提取过程中，使用什么蛋白提取缓冲液。 沉淀用Buffer B重悬，（组成：8M尿素+10mMTRIS base+100mM NaH2PO4，用NaOH调节pH到8.0),1克沉淀（湿重）加5ml Buffer B,使其充分溶解（可以放在微量震荡器上震荡20min），然后室温下12000转离心20min，留上清，弃沉淀。 取10ul上清加入10ul 2xSDS上样缓冲液，就可以跑PAGE了。 无论是纯可溶蛋白还是包涵体，在菌体裂解这一步我用的都是Lysis Buffer（组成：10mM 咪唑+300mM NaCl+50mM NaH2PO4,用NaOH调节pH到8.0)每克菌体（湿重）加2-5ml Lysis Buffer，充分悬起后，加入溶菌酶4度作用半小时就可以超声破碎了。 包涵体，简单的说就是翻译的蛋白没有正确折叠而聚集在一起形成的，主要的是疏水作用。实际上就是很多个蛋白分子，这些蛋白并不是交联在一起的，用高浓度的尿素和盐酸胍可以使他们变性，解聚。 电泳检测的话，可以用SDS-PAGE检测，在上样之前，需要用上样缓冲液处理样品，处理后，包涵体也就解聚了，每个蛋白分子与SDS结合，形成了可溶物。 包涵体是不容易破碎的，超声可以破碎菌体释放里面的包涵体，但是不能破碎包涵体；但如果用水煮的话，包涵体会变性，会有一部分可溶于水，所以你跑的上清中有可能有包涵体存在，也有可能没有包涵体； 建议： 还是先将菌体超声破碎，然后离心，取沉淀和上清再跑一次电泳，如果沉淀上清中都有你要的蛋白，说明表达的结果是部分可溶；如果仅上清有就是可溶性表达；如果仅沉淀中有，就是完全包涵体了。不过，一般情况下，应该是第一者的可能性大。

Protocol蛋白质纯化步骤

Protocol 蛋白质纯化方法（镍柱） 柱前操作 1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min; 2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质； 3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体； 4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？ 5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）； 6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱； 平衡柱子（柱体积：V） 7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）； 8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？ 9. 3V BB; 柱层析 10.上样； 11. 10V Washing Buffer（WB）； 12. 6V Elute Buffer（EB); 13.分管收集，每管1~2ml. 各种缓冲液配方 1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.9 1000ml NaCl: 58.44×4=233.76g Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g 2. 8×CB: 400mM NiSO4 1000ml NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g 3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g 4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g 5. 6M 尿素 1000ml 尿素：60.06×6=360.36g

包涵体的纯化和复性总结

板块一、大肠杆菌 （这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。） 一、关于菌体的量 大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。 二、关于是否包涵体表达 包涵体的定义我就不讲了。我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？ 说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。

甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。 我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。 三、关于表达量 我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。我要说都是文章的作者在忽悠。不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。如用：很低、较低、中等、较高、很高等来描述。 有一个指标与表达量密切相关，那就是单位体积的菌体量。两者的乘积才是单位体积发酵液的目标蛋白产率。 与表达量相关的指标还有纯化倍数、纯化收率等，这些指标我们也常常在发表的文章中看到。同样，我也认为都是不准确的。除非你用的是活性测定的方法，用蛋白活性收率来表征。 纯化工艺的难易有时候也与表达量相关，表达量高时往往纯化也方便的多。所以，尽量提高你的目标蛋白表达量不只是基因工程上游和产量的问题，还是纯化工艺开发的问题。 四、菌体破碎

包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验

包涵体的纯化和复性总结 二、包涵体的洗涤? 1、包涵体的洗涤问题? 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。? 包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。 此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。? 2、如何得到比较纯的包涵体? 对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。 包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3?mM。去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。? 对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。? 包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。? 8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实

包涵体纯化

包涵体： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 包涵体的组成与特性： 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF 和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。 包涵体表达的有利因素： 1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。 破菌： 1、机械破碎 2、超声破碎 3、化学方法破碎 分离： 1、离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 2、过滤或萃取方法： 洗涤： 由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。 溶解：

包涵体复性注意事项和常见问题解析

活性蛋白整体方案包涵体复性注意事项和常见问题解析 包涵体复性注意事项 1)最适pH值范围为8.0-9.0之间； 2)温度适宜选择4℃； 3)复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL； 4)复性时间一般为24-36小时； 5)低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在 非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解； 6)首先要获得较高纯度的包涵体； 7)包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施； 8)透析前后均要离心； 9)包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100； 10)包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性； 11)复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h； 12)复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定 13)TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。用Triton洗涤有些包涵体 效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。 14)复性时的蛋白浓度一般为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白 在低浓度时不稳定，很容易变性。 包涵体复性常见问题分析 包涵体复性原则 低浓度，平缓梯度，低温。n(O5~0q8D; 怎样洗涤包涵体？ 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。 对于尿素和盐酸胍该怎么选择 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度

(整理)包涵体的分离纯化.

包涵体的纯化和复性总结（二） 关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-1 00, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的load ing buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. "取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? " 而楼主的问题,虽然loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loading buffer是没有问题的.

包涵体纯化方案

包涵体纯化方案 缓冲液配方： 1.变性复性缓冲液 缓冲液A：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA①, 100mM NaCl②,1%Triton X-100③ 缓冲液B：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100，2M脲素④ 缓冲液C：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100 缓冲液D：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，1%Triton X-100，2M盐酸胍④ 溶解缓冲液E：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl，10mM β-巯基乙醇/DTT⑤，2mM脱氧胆酸钠⑥， 8M脲素 复性缓冲液：50mM Tris-HCl (pH8.5)，100mM NaCl ，6M/4M/2M脲素,1%甘氨酸⑦，5%甘油⑧，0.2%PEG⑨，1mM氧 化型谷胱甘肽，1mM还原型谷胱甘肽⑩ 2.纯化缓冲液 Binding buffer：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM 咪唑，pH8.5

Elution buffer：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 不同浓度梯度咪唑, pH8.5 具体实施步骤： 1.大量诱导表达的菌液7000rpm离心10min。弃上清，用1×PBS重悬，洗涤菌体细胞，7000rpm，离心10min。再用PBS重复洗一遍。离心后留菌体沉淀。 2.将菌体细胞用缓冲液A重悬，液氮中反复冻融后，超声破碎。13000rpm 离心10min，弃上清，收集包涵体沉淀。 2.分别用缓冲液B、C、D超声清洗包涵体沉淀。13000rpm离心10min 收集沉淀。 3.用缓冲液E溶解包涵体，缓慢摇动使其缓慢溶解，室温放置30min，然后13000rpm离心10min。取上清。 4.将上清稀释至0.1-1.0mg/ml，装入透析袋中，放置于梯度复性缓冲液中，4℃缓慢透析24-36h。最后在纯化binding buffer中透析，确保蛋白稳定可溶。 5.对溶解的包涵体蛋白进行亲和层析。 附注： ①EDTA防止蛋白降解 ②NaCl一定的盐离子可降低某些带电基团间的斥力 ③Triton X-100除去其他细菌成分，如膜外蛋白，质粒DNA和其他杂质 ④脲素，盐酸胍，洗掉包涵体表面的不溶性杂蛋白

蛋白质纯化与结晶的原理

蛋白质纯化与结晶的原理 获得蛋白质的晶体结构的第一个瓶颈，就是制备大量纯化的蛋白质(>10 mg)，其浓度通常在10 mg/ml 以上，并以此为基础进行结晶条件的筛选。运用重组基因的技术，将特定基因以选殖(clone)的方式嵌入表现载体(expression vector)内，此一载体通常具有易于调控的特性。之后再将带有特定基因的载体送入可快速生长的菌体中，如大肠杆菌(Escherichia coli)，在菌体快速生长的同时，也大量生产表现载体上的基因所解译出之蛋白质。一般而言纯度越高的蛋白质比较有机会形成晶体，因此纯化蛋白质的步骤就成为一个重要的决定因素。 在取得高纯度的蛋白质溶液后，接下来就是晶体的培养。蛋白质晶体与其他化合物晶体的形成类似，是在饱和溶液中慢慢产生的，每一种蛋白质养晶的条件皆有所差异，影响晶体形成的变量很多，包含化学上的变量，如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等；物理上的变数，如溶液达成过饱和状态的速率、温度等；及生化上的变数，如蛋白质所需的金属离子或抑制剂、蛋白质的聚合状态、等电点等，皆是养晶时的测试条件。截至目前为止，并无一套理论可以预

测结晶的条件，所以必须不断测试各种养晶溶液的组合后，才可能得到一颗完美的单一晶体(图一) 。 蛋白质晶体的培养，通常是利用气相扩散法(Vapor Diffusion Method) 的原理来达成；也就是将含有高浓度的蛋白质(10-50 mg/ml)溶液加入适当的溶剂，慢慢降低蛋白质的溶解度，使其接近自发性的沈淀状态时，蛋白质分子将在整齐的堆栈下形成晶体。举例来说，我们将蛋白质溶于低浓度(~1.0 M) 的硫酸铵溶液中，将它放置于一密闭含有高浓度(~2.0 M)硫酸铵溶液的容器中，由气相平衡，可以缓慢提高蛋白质溶液中硫酸铵的浓度，进而达成结晶的目的(图二)。 蛋白质晶体在外观上与其他晶体并无明显不同之处，但在晶体的内部，却有很大的差异。一般而言，蛋白质晶体除了蛋白质分子外，其他的空间则充满约40 %至60 %之间的水溶液，其液态的成分不仅使晶体易碎，也容易使蛋白质分子在晶格排列上有不规则的情形出现，造成晶体处理时的困难及绕射数据上的搜集不易等缺点。但也由于高含水量的特性，让蛋白质分子在晶体内与水溶液中的状态，极为相似。所以由晶体所解出的蛋白质结构，基本上可视为自然状态下的结构。

蛋白质、包涵体复性

目录 一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用 二、包涵体变复性 三、包涵体洗涤纯化——7~10 四、包涵体提出、纯化和复性

一、

二、包涵体变复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。 基本信息 中文名称 包涵体变复性 复性方法 稀释复性 原因 基因工程菌的表达产率过高 包涵体变性 破菌洗涤溶解 目录 1包涵体 2包涵体变性 3包涵体复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。 包涵体的形成原因 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

蛋白质提取、纯化、鉴定的方法(二)

蛋白质提取、纯化、鉴定的方法（二） 一、层析技术 1.离子交换层析的亲和洗脱这种技术结合了离子交换与亲和层析。如在某一pH时，目的蛋白质带正(负)电荷，用阳(阴)离子交换剂吸附，这一过程去除了很大一部分不吸附的杂蛋自。然后用该目的蛋白质的配体来洗脱，该配体特异性地结合目的蛋白质并使之洗脱，但不洗脱其他吸附的蛋白质，达到纯化的目的。注意，该配体需带有一定量的阴(阳)电荷，有效降低目的蛋白质与阳(阴)离子交换剂之间的电荷相互作用。 2.固相金属亲和层析重组蛋白质可在C-或N-端引入组氨酸标签，一般为6个组氨酸残基(His-tag)。这些组氨酸残基与过渡金属(transitionalmetals)Ni2+或Co2+形成配位键。用固相化的Ni2+或Co2+(如商品化的树脂，Ni-NTA)可吸附带有His-tag的重组蛋白质，用含有咪唑(imidazole)的缓冲液可洗脱重组蛋白质。注意，有些含有较多组氨酸的蛋白质也可与吸附剂结台，但较弱，因此可用低浓度的咪唑洗脱；在层析过程中不能引入金属螯合剂如EDTA；避免使用还原剂如DTT或DTE，但可用低浓度的巯基乙醇。 该技术也用于提取磷酸化的蛋白质。将螫合剂交联到树脂，螯合三价铁或三价镓，该亲和吸附剂可吸附混合物中的磷酸化的蛋白质。洗去不吸附的非磷酸化蛋白质后，用磷酸缓冲液即可将磷酸化蛋白质从该亲和吸附剂上洗脱。要注意的是酸性蛋白质也可被不同程度地吸附。 3.凝胶过滤该技术过去也被称为分子筛。构成凝胶的小珠(bead)中有大小不一的孔，分子量大的分子能进入较大的孔而不能进入小的孔，分子量小的则不仅能进入较大的孔也能进入小的孔，因此在层析过程中，小分子经过的路程较长而大分子经过的路程较短，如此就可分离分子量不同的蛋白质。然而，分子量相近的蛋白质非常多，因此，用这种技术得到的蛋白质是分子量相近的混合蛋白质。然而这种技术在某些研究中很有用，如丙酮酸激酶M2(PKM2)由四个相同的亚基组成，PKM2在细胞中以三种形式存在——单体、二聚体、四聚体，这三种形式的功能不同，若要鉴定细胞中PKM2的各种形式的量，先用凝胶过滤技术分离细胞裂解液中的PKM2的三种形式，之后用Western blot对每一种形式的PKM2做相对定量。 4.反相层析该技术是指用疏水固相的一种层析技术。“反相”是相对“正相”而言，正相是指亲水的固相如硅胶表面带有硅羟基(silanol group)，硅羟基可与被分离的化台物相互作用，被分离的化合物的亲水性越强，则滞留在正相

包涵体纯化全过程(3)

一、包涵体的纯化和复性总结（二） 二、[ 2008-2-25 14:25:00 | By: 飞鸿 ] 三、关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等

细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml 溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. "取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法

包涵体复性(课堂参照)

我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么 处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧! 我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么 处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧! 首先，可以再多加一点透析液看看能否将之溶掉，这样可以减少由于免疫共沉淀的原因而与杂质一起沉淀的蛋白。 再次如果你的蛋白已经复性，并且能很好的溶解的话，那么沉淀要么是杂质，要么是不能复性的蛋白，我认为可以离心去除。 出现絮状沉淀是很正常的现象，因为透析本身就是一个复性的过程，那些出现絮状的沉淀就是一些不能够复性成为天然结构的一些目的蛋白和一些杂蛋白，而这些都是我们所不需要的。所以说出现絮状沉淀是正常的也是我们希望看到的。 至于出现沉淀的原因不外乎条件变化太剧烈了，建议不要让透析的条件变化太剧烈了，主要是PH的浓度的变化和样品中一些其他东西如尿素的浓度变化。 如果楼主透析样品中出现太多的沉淀，甚至于跑胶中基本没有带了，那么建议楼主换一种透析液来用，如用TGE也就是传说中的万金油来试试，我一直用的是这种透析液，效果很不错。TGE配法如下： 50mM Tris 0.5mM EDTA 50mM Nacl 5%或10％甘油 如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。 沉淀可以拿来重溶，但是重溶的可行性不大，也就是重新溶解的可能性不大 谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题? 如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度? 046 wrote: 谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题? 先过柱後复性。 蛋白浓度较低可以浓缩一下，浓缩方法有很多，简单一点的可以用PEG包埋，就是将蛋白

包涵体纯化方案

包涵体纯化方案 缓冲液配方： 1.变性复性缓冲液 缓冲液A ：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA ①, 100mM NaCl ②,1%Triton X-100③ 缓冲液B ：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl ，1%Triton X-100，2M 脲素④ 缓冲液C ：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl ，1%Triton X-100 缓冲液D ：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl ，1%Triton X-100，2M 盐酸胍④ 溶解缓冲液E ：50mM Tris-HCl (pH8.5), 1mM EDTA, 100mM NaCl ，10mM β-巯基乙醇 /DTT ⑤，2mM 脱氧胆酸钠⑥，8M 脲素 复性缓冲液：50mM Tris-HCl (pH8.5)，100mM NaCl ，6M/4M/2M 脲素,1%甘氨酸⑦， 5%甘油⑧，0.2%PEG ⑨，1mM 氧化型谷胱甘肽，1mM 还原型谷胱甘肽⑩ 2.纯化缓冲液 Binding buffer ：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM 咪唑，pH8.5 Elution buffer ：50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 不同浓度梯度咪唑, pH8.5 具体实施步骤： 1.大量诱导表达的菌液7000rpm 离心10min 。弃上清，用1×PBS 重悬，洗涤菌体细胞，7000rpm ，离心10min 。再用PBS 重复洗一遍。离心后留菌体沉淀。 2.将菌体细胞用缓冲液A 重悬，液氮中反复冻融后，超声破碎。13000rpm 离心10min ，弃上清，收集包涵体沉淀。

蛋白质纯化方法

含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化 一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因 所需特殊试剂：1M IPTG 1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的 表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培养 过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。 2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB 培养液中，37℃通气培养过夜。 3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各 10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A550 ＝0.1-1.0）。 4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物 中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5， 5.0mM相同的温度继续通气培养。 5.在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。 细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱 导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加 重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大 肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑 制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过 试验确定最佳的培养条件是很必要的。 6.将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升 1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1 分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE 观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。 二.大量表达靶蛋白 1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的 LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37℃通气过夜培养。

什么是包涵体

包涵体即表达外源基因的宿主细胞，可以是原核细胞，如大肠杆菌；也可以是真核细胞，如酵母细胞、哺乳动物细胞等。包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。 包涵体（inclusion body） 基因工程定义：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体），有的位于细胞核中（如疱疹病毒），或细胞质、细胞核中都有（如麻疹病毒）。有的还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Negri）小体。 特性 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 形成 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。 在基因重组技术得到迅速发展之前，研究者就已经发现，细胞内人工引入反常的蛋白质（这些蛋白质可以看作是细胞的外源蛋白质），这些蛋白质会堆积起来形成不溶的形式。这些蛋白质聚集的形态是明显的球形，这些球形的物质全部是蛋白质，并且通过非共价键的作用力形成，必须使用变性剂如十二烷基硫酸钠（SDS）或者盐酸胍才能溶解。自从基因工程的蛋白质在大肠杆菌表达以后，人们逐渐发现这些外源蛋白质基因在细胞中的过量表达同样形成不溶性的状态。

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。3. 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，

蛋白质纯化方法总结

分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。 1.前处理：分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态（如果做不到呢？比如蛋白以包涵体形式存在），不丢失生物活性。为此，动物材料应先提出结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免手单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点（为什么呢）的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。 如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。 2. 粗分级分离：当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。有些蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。 3.细分级分离：样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。 结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的，但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白，因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 蛋白质分离纯化的方法： 一、根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 2、密度梯度离心 3、凝胶过滤 二、利用溶解度差别的纯化方法 1、等电点沉淀和pH控制 2、蛋白质的盐析和盐溶 3、有机溶剂分级分离法 4、温度对蛋白质浓度的影响 三、根据电荷不同的纯化方法