肌酸激酶(CK)测试盒说明书
一、原理:
肌酸激酶CK催化三磷酸腺苷和肌酸,生成磷酸肌酸,后者很快全部水解为磷酸,此时三磷酸腺苷和二磷酸腺苷仍稳定,加入钼酸铵可生成磷钼酸,可进一步还原成钼蓝,根据生成无机磷的量可算出酶的活力。
二、试剂组成与配制:(50T)
1、试剂一:液体6ml×1瓶,冷冻或者4℃保存3个月。
2、试剂二:液体1.5ml×1瓶,冷冻或者4℃保存3个月。
3、试剂三:粉剂2支,临用时每支加双蒸水2 ml,4℃保存6个月。
4、试剂四:粉剂1支,临用前每支加双蒸水6ml, 4℃保存6个月。
5、试剂五:粉剂2支,冷冻保存6个月,临用时每支加双蒸水2ml。配好的试剂–20℃以下保
存5天。
6、试剂六:液体6ml×1瓶,室温或4℃保存6个月。
7、试剂七:粉剂1支,4℃保存6个月,加双蒸水60ml,可适当加热溶解,溶解后4℃保存。
8、试剂八:粉剂2支,4℃保存6个月,临用时每支加双蒸水20ml,溶解后4℃保存。
9、2.5mol/L硫酸50ml×1瓶,室温保存6个月。
10、附带双蒸水200 ml,供配制试剂时用。
定磷剂的配制:双蒸水︰2.5mol/L硫酸︰试剂七︰试剂八= 2︰1︰1︰1。配好的定磷剂应为浅黄色,若无色则失效,若呈蓝色则为磷污染,定磷剂需现用现配。配好后4℃
可保存48小时。
三、操作表:
注意:配制好的试剂,需37°C预温5分钟,再进行测定。
1、规范操作表:
测定管测定空白管
待测样本(μl)20
试剂一(μl)80 80
试剂二(μl)20 20
试剂三(μl)50 50
试剂四(μl)100 100
试剂五(μl)50 50
旋涡混匀,37°C水浴20分钟
试剂六(μl)100 100
待测样本(μl) 20
旋涡混匀,离心3500r/min×10min,取上清定磷
上清(μl)300 300
定磷剂(μl)2000 2000 旋涡混匀,45°C水浴15分钟,蒸馏水调零,660nm处1cm光径比色,测各管的吸光度OD值。
根据标准曲线计算CK的酶活力。
注意:预试详细参照《最佳取样浓度摸索》(本说明书第四点)。
2、如果您的样本很多,可采用简便操作法:
①混合试剂的配制:测试前,将试剂一、二、三、四、五每种试剂所用量乘以样本数(n )再乘以2(因每只测定管均需做测定空白),另再多放宽4只,混合试剂的具体配制见下表:
试剂名称 试剂一 试剂二 试剂三 试剂四 试剂 五
试剂用量(μl )(n ×2+4)×80(n ×2+4)×20(n ×2+4)×50(n ×2+4)×100 (n ×2+4)×50
将上面所有试剂加在一起混匀制成混合试剂。
注意:配制好的试剂,需37°C 预温5分钟,再进行测定。
②简便操作表:
测定管 测定空白管 待测样本(μl ) 20
混合试剂(μl )(已预温)300 300
旋涡混匀,37°C 水浴20分钟
试剂六(μl ) 100 100
待测样本(μl ) 20
旋涡混匀,离心3500r/min ×10min ,取上清定磷
上清(μl ) 300 300
定磷剂(μl ) 2000 2000
旋涡混匀,45°C 水浴15分钟,蒸馏水调零,660nm 处1cm 光径比色,测各管的吸光度。
根据标准曲线查找CK 酶活力。
注意:...
预试详细参照《最佳取样浓度摸索》(本说明书第四点)。
3、计算公式:
① 、血清计算公式:
CK U ml 7.4491OD OD CK =×=×?×根据标准曲线计算所得的酶活力活力(U/ml)样本测试前稀释倍数(/)
((测定测定空白)- 0.0716)样本测试前稀释倍数
② 、组织计算公式:
CK mgprot U ml mgprot/ml 7.4491OD OD CK =÷=×?÷根据标准曲线计算所得的酶活力待测样本蛋白浓度活力(U/)(/)()
((测定测定空白)- 0.0716)待测样本蛋白浓度
注;试剂盒中没有带CK 标准品,老师按照操作表测定,可以直接套用我们的公式,但一定要注意,测定所得
一定要符合说明书第四点的要求(绝对OD 值控制在0.05—0.5之间)
四﹑最佳取样浓度的摸索:
最佳取样浓度的摸索
注意:因样品种类不同,其最佳取样浓度不同。根据CK 标准曲线(见附录),在每测定一
种新的样品前,最好摸索一个最佳取样浓度,一般把绝对OD 值控制在0.05—0.5
之间。
1.血清(浆)最佳取样浓度的摸索:
由于正常情况下血清(浆)中的CK 活力比较低。但是如果老师的模型组的CK 活
力会明显增高,那最好在批量实验前取模型组做个预试,一旦CK 活力>3.5U/ml ,就需
要用生理盐水将该模型组血清稀释后检测。若含量太高(曲线的平坦部分),则看不出组
与组之间的显著性差异。
2.组织匀浆最佳取样浓度的摸索:
如果您使用本试剂盒测试某一种新的样品时,最好先做三支不同浓度的测试管。例
如测肌肉组织匀浆,取样浓度分别为1%、2%、5%,然后计算酶的浓度,选取酶的浓度
在0.01~0.1mg/ml (即:酶活力在0.35~3.5U/ml ,此段曲线基本呈直线关系)的样本浓度
为最佳取样浓度,进行批量实验。若浓度太高(曲线的平坦部分),则看不出组与组之间
的显著性差异,需将样品浓度稀释后再测试;若浓度太低,则实验误差对测定结果影响很
大,需将样品加大浓度后测试.
这样做对科研结果分析及t 检验有很大帮助。
五、注意点:
1、所有样品均要检测测定管及测定空白管。
2、组织匀浆4℃存放不可超过10小时,组织块冷冻可延长存放时间。
3、血清4℃存放不可超过10小时,冷冻可延长存放时间。
4、此法为微量,灵敏,快速法。所以对测定管子要求严格,要没有一点磷的管子,若放
过H 3PO 4或其缓冲盐的管子,一定要洗得非常干净,用洗涤剂加水煮,再用自来水冲,
最后用蒸馏水冲。最好用一次性塑料管或者用新的玻璃管.................
。这样可以避免磷污染。这一点很重要,常常是实验成败的关键因素。
5、定磷剂配好后,不可放置太久,一般4℃可保存48小时,最好现用现配。随时放冰箱。
6、最好采用简化操作法,这样快捷、准确。
7、所有配试剂的器皿要专用,或者使用新的(包括吸硫酸的吸管,及盛蒸馏水的器皿以
及吸各种试剂的吸嘴)。
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附录ⅠCK标准曲线的制备
(一)、试剂的配制:
取CK标准品(70U/支),用双蒸水溶解并稀释成0.175、0.350、0.700、1.050、1.400、1.750、
2.100、2.450、2.800、
3.150、3.500U/ml,其它试剂的配制,同前面的样本中CK测定试剂
的配制。
注意:配制好的试剂,需37°C预温5分钟,再进行测定。
(二)、简化测定操作表:
标准管标准空白管
CK标准(μl)20 混合试剂(μl)(已预温)300 300
旋涡混匀,37°C水浴20分钟
试剂六(μl)100 100
CK标准(μl) 20 旋涡混匀,离心3500r/min×10min,取上清定磷
上清(μl)300 300
定磷剂(μl)2000 2000 旋涡混匀,45°C水浴15分钟,蒸馏水调零,660nm处1cm光径比色,测各管吸光度。
(三)、测定结果:
CK酶活力(U/ml)0.1750.350 0.700 1.050 1.400 1.750 2.100 2.450 2.800 3.150 3.500 空白OD值0.2760.276 0.283 0.2880.2880.2890.290.290.274 0.276 0.294
标准OD值0.2870.330 0.403 0.4530.5120.5380.5800.6220.658 0.698 0.768
绝对OD值 0.0110.054
0.120 0.1650.2240.2490.2900.3320.384 0.422 0.474
以CK标准品浓度(U/ml)为纵坐标,以绝对OD值为横坐标,作CK标准曲线,绘图如下:
附录Ⅱ 血清中CK 测定
(一)、样本前处理:
根据《最佳取样浓度摸索》(本说明书第四点)得到的最佳取样浓度。
注意:配制好的试剂,需37°C 预温5分钟,再进行测定。
(二)、操作表:
测定管 测定空白管 待测样本(μl ) 20
试剂一(μl ) 80 80
试剂二(μl ) 20 20
试剂三(μl ) 50 50
试剂四(μl ) 100 100
试剂五(μl ) 50 50
旋涡混匀,37°C 水浴20分钟
试剂六(μl ) 100 100
待测样本(μl ) 20
旋涡混匀,离心3500r/min ×10min ,取上清定磷
上清(μl ) 300 300
定磷剂(μl ) 2000 2000
旋涡混匀,45°C 水浴15分钟,蒸馏水调零,660nm 处1cm 光径比色,测各管的吸光度OD 值。 根据标准曲线计算CK 的酶活力。
(三)、计算公式及举例:
①、计算公式:
CK U ml 7.4491OD OD CK =×=×?×根据标准曲线计算所得的酶活力活力(U/ml)样本测试前稀释倍数(/)
((测定测定空白)- 0.0716)样本测试前稀释倍数
注:试剂盒中没有带CK 标准品,老师按照操作表测定,可以直接套用我们的公式,但一定要注意,
测定所得一定要符合说明书第五点的要求(绝对OD 值控制在0.05—0.5之间)
②、计算举例:
取小鼠血清20μl 进行CK 检测,测得测定管吸光度为0.352,测定空白管吸光度为0.278,根据标准曲线拟合方程计算CK 含量为:
7.44910.3520.2780.480/(/)CK U ml U ml =×?=活力
()- 0.0716
附录Ⅲ 组织中CK 测定
(一)、样本前处理:准确称取样本重量,以生理盐水为匀浆介质制备成10%的组织匀浆(样本
重量克数︰生理盐水体积毫升数=1︰9),将匀浆2500转/分,离心10分钟取上清,再用生理盐水稀释成所需要的浓度,待测(最佳取样浓度见《最佳取样浓度摸索》,在本说明书第五点)。
注意:配制好的试剂,需37°C 预温5分钟,再进行测定。
(二)、操作表:
测定管 测定空白管 待测样本(μl ) 20
试剂一(μl ) 80 80
试剂二(μl ) 20 20
试剂三(μl ) 50 50
试剂四(μl ) 100 100
试剂五(μl ) 50 50
旋涡混匀,37°C 水浴20分钟
试剂六(μl ) 100 100
待测样本(μl ) 20
旋涡混匀,离心3500r/min ×10min ,取上清定磷
上清(μl ) 300 300
定磷剂(μl ) 2000 2000
旋涡混匀,45°C 水浴15分钟,蒸馏水调零,660nm 处1cm 光径比色,测各管的吸光度OD 值。 根据标准曲线计算CK 的酶活力。
(三)、计算公式及举例:
1、计算公式:
CK mgprot U ml mgprot/ml 7.4491OD OD CK =÷=×?÷根据标准曲线计算所得的酶活力待测样本蛋白浓度活力(U/)(/)()
((测定测定空白)- 0.0716)待测样本蛋白浓度
注:试剂盒中没有带CK 标准品,老师按照操作表测定,可以直接套用我们的公式,但一定要注意,
测定所得一定要符合说明书第五点的要求(绝对OD 值控制在0.05—0.5之间)
2、计算举例:
①、取2%大鼠肝匀浆上清液20μl 进行CK 检测,测定管吸光度为0.386,测定空白管吸光度为0.178,2%大鼠肝匀浆的蛋白浓度为2.268mgprot/ml 。则计算结果为:
7.44910.3860.178 2.2680.652/(/)
CK U mgprot U mgprot =×?÷=活力(()- 0.0716) ②、取5%中华鲟鳃匀浆上清液20μl 进行CK 检测,测定管吸光度为0.441,测定空白管吸光度为0.314,5%中华鲟鳃匀浆的蛋白浓度为0.6429mgprot/ml 。则计算结果为:
7.44910.4410.3140.6429 1.36/(/)
CK U mgprot U mgprot =×?÷=活力(()- 0.0716)