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拄层析分离色素实验报告

柱层析分离色素

一、【实验目的】

1.了解柱层析的分类,掌握各种柱层析的原理。

2.熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。

二、【实验原理】

叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质,主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性,可用95%乙醇或无水乙醇提取。

分离色素的方法有多种,如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种,它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力,以及对洗脱剂(即移动相)的溶解度不同将各组分分离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。

吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面积很大,经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂(如氧化铝或硅胶),当混合物的溶液流经吸附柱时,就被吸附在柱的上端,然后从柱顶加入溶剂(洗脱剂)洗脱。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同,在同一溶剂中的溶解度也不同,因此各组分随溶剂以不同速度下移,形成色带。继续用溶剂洗脱,吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出,整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分,并逐个鉴定。

本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中(压成柱状)作为吸附剂,将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上,色素即被吸附。由于色素的种类不同,被吸附的强弱不同,就在吸附柱上排列成为不同的色层,再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力,用不同的溶剂进行洗脱,从而达到叶绿体主要的4种色素(叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素)的分离。

三、【实验材料】

原料:

新鲜的菠菜叶

试剂:

1.无水乙醇或95%乙醇 5.三氧化二铝

2.石英砂 6.饱和氯化钠溶液

3.丙酮7.水硫酸钠

4.石油醚(60-90℃) 8洗脱液:丙酮:石油醚=1:9 器材:

层析柱(1×30cm),研钵,蒸馏装置,

脱脂棉,天平,烧杯,过滤漏斗,

玻璃棒,锥形瓶,分液漏斗,试管,

铁架台

四、【实验操作】

1.色素的提取:

20克菠菜,加少许石英砂,再加20毫升无水乙醇研磨成浆,脱脂棉过滤,保存滤液,滤渣再用无水乙醇提取一次,合并滤液,滤渣再加入

30毫升石油醚提取一次,过滤,合并滤液,转移至分液漏斗中,再加入

40毫升饱和氯化钠溶液震荡,弃去下层溶液,再分别加入20毫升水震荡

洗涤几次,直至下层无色,保留上层溶液,转移至三角瓶中,加入无水

硫酸钠干燥5分钟,备用.

2.样品的浓缩:

将提取液放入蒸馏烧瓶中,蒸除多余的石油醚,至剩余液体5-8毫升左右,以备加样使用。

3.层析拄的制备:

15克碱性三氧化二铝加入30毫升石油醚搅拌,浸泡10min.。在层析拄内加入一团棉花在底部,再加入石英砂0.5cm以上,然后用石油醚半充满柱子,再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内,倒时应该缓慢,重复使用下面的石油醚,直到装完。用石油醚洗柱内壁,顶部加一小团棉花,然后

再填入石英砂0.5厘米高。

3.样品的分离层析:吸附层析分离色素

打开层析拄下部开关,向拄内加入2毫升浓缩液,至液体没入砂内,再加入石油醚冲洗拄壁,液体浸入砂内,加洗脱液开始层析,可以看到

不同色带如图片1,直至第一条色带洗脱完毕,在拄下面用试管接收第

一条色带的洗脱液,如图片2。

五、【实验结果】

实验结果如下图:

拄层析分离色素实验报告

拄层析分离色素实验报告

图一:层析柱中出现黄色带图二:提取出的黄色胡萝卜素

结果分析:

洗脱过程中,首先有一条黄色的色带圈沿着层析柱下移,色带圈的各个方向的移动速度并不是完全相同,原因在于层析柱的制作过程并不完全均一,使层析柱内部不均匀,以至于色带各方向的移动速度不同。最后收集得到亮黄色的胡萝卜素。

七、【注意事项】

1、萃取时不要剧烈振荡,以防止发生乳化现象。

2、为了保持柱子的均一性,使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的,否则

当柱中溶剂或溶液流干时,就会使柱身干裂,影响渗透和显色的均一性。因此要保证整个装样过程中溶剂要高于三氧化二铝的表面。

3、在吸附剂上端加入脱脂棉(或滤纸)是使加样品时不致把吸附剂冲起;在吸

附柱下端加脱脂棉(或沙子)可以防止吸附剂细粒流出。

4、层析柱填装紧密与否,对分离效果很有影响,若各部分松紧不匀,会影响渗

透速度和显色的均匀。

6、洗脱流速不宜过快,避免因此压紧凝胶,色素分离不开;也不要过慢,使柱

装得太松,导致层析过程中,凝胶床高度下降,色素洗脱很慢。因此应控制洗脱流速,以每分钟60~80滴为宜。

7、样品一定要足够浓缩,加样量不要过大,过大,分离条带过宽,如果层析拄

不够长,各组分不易分开,易同时洗脱下来;加样量过少,色带不是很清楚,不易观察,效果不好。

8、层析柱粗细必须均匀,柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说,细长的柱

分离效果较好。若样品量多,最好选用内径较粗的柱,但此时分离效果稍差。

柱管内径太小时,会发生“管壁效应”,即柱管中心部分的组份移动慢,而管壁周围的移动快。柱越长,分离效果越好,但柱过长,实验时间长,样品稀释度大,分离效果反而不好。

八、【实验小结】

在该柱层析分离色素实验中,我了解了柱层析技术的相应方法和原理,学会了层析柱的制作和准备,进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质、洗脱液的配比、层析柱的制作及洗脱液的流速是本实验成功与否的三大关键因素。

知识拓展:

1、溶剂的选择:

(1)吸附剂要求较纯,否则会影响样品的吸附和洗脱。

(2)溶剂和吸附剂不能起化学反应。

(3)溶剂的极性应比样品小,如果大了,样品不宜被吸附剂吸附。

(4)溶剂对样品的溶解度不能太大,否则影响吸附,但也不能太小,溶液的体积增加,易使色谱分散。

(5)可使用混合溶剂,如有的组分含有较多的极性基团,在极性小的溶剂中溶解度太小。也可选用极性大的溶剂溶解,然后加入一定量的非极性溶剂。

这样既降低了极性,又减少了溶液的体积。

2、洗脱剂的选择:

样品吸附在氧化铝柱上后,用合适的溶剂进行洗脱,这种溶剂称为洗脱剂。如果原来用于溶解样品的溶剂冲洗柱不能达到分离的目的,可以改用其他溶剂,一般极性较强的溶剂影响样品和氧化铝之间的吸附,容易将样品洗脱下来,达不到分离的目的。

因此常用一系列极性渐次增强的溶剂,既先使用极性最弱的溶剂,然后加入不同比例的极性溶剂配成洗脱溶剂。常用的洗脱溶剂的极性按如下次序递增。己烷和石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸。

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