人脐带间充质干细胞外泌体免疫调节功能的研究
人脐带间充质干细胞外泌体免疫调节功能的研究
作者：刘明， 汪劲松， 刘沐芸， 胡祥， 徐军， Liu Ming， Wang Jinsong， Liu Muyun， Hu Xiang， Xu Jun
作者单位：刘明,徐军,Liu Ming,Xu Jun(510120 广州,呼吸疾病国家重点实验室,广州呼吸疾病研究所,广州医科大学附属第一医院)， 汪劲松,刘沐芸,胡祥,Wang Jinsong,Liu Muyun,Hu Xiang(深圳市北科生物科技有限公司
)
刊名：
中华医学杂志
英文刊名：National Medical Journal of China
年，卷(期)：2015,95(32)
引用本文格式：刘明.汪劲松.刘沐芸.胡祥.徐军.Liu Ming.Wang Jinsong.Liu Muyun.Hu Xiang.Xu Jun人脐带间充质干细胞外泌体免疫调节功能的研究[期刊论文]-中华医学杂志 2015(32)
脐带间充质干细胞综述(转)
脐带间充质干细胞概述 医学实验班70080103 王雪彤 脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构,其外被羊膜,内含2条脐动脉、1条脐静脉,在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织———华尔通氏胶(Whartonps Jelly) ,从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 。 1人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的形貌分析: 倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长, 为形态相对均一的梭形细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长,低密度时较扁平, 密度增加趋于融合时细胞变细长。扫描电镜下观察呈长条状纤维样, 细胞膜表面不光滑, 有小结节状物, 细胞无明显突起,细胞间无网络状连接。透射电镜观察核大, 不规则, 核仁明显, 常染色质多, 异染色质少, 胞浆少。胞质内细胞器较少, 以粗面内质网和线粒体为主, 内有大量游离核糖体, 部分细胞可见内质网肿胀。 ——植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(×200) 例如三代细胞的形态学特征——人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1，2；并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3；细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。 图1图
2图3 图4 2人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的生物学特性： HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞,是别于两者之间的一类新的多能间充质细胞,它们之间既有联系又有差异。根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会( the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the Internation2 al Society for Cellular Therapy)制定的最低标准, 脐带间充质干细胞（MSCs）需满足以下条件: 1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长; 2 )MSCs表达CD105, CD73和CD90,不表达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA2DR; 3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。和其他来源的 MSCs一样HUMSCs呈长条梭形贴壁生长,表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44 及HLA2ABC ,不表达CD34、CD45、CD31等造血干细胞标记或CD33、CD14、CD56及HLA2DR、2DA、2DP、2DQ ,体外诱导培养能向多种成体细胞分化。比照这些条件,表明华尔通氏胶来源的间质细胞具有MSCs特性。HUMSCs还表达原始干细胞标记,如白血病抑制因子受体通路、胚胎干细胞特异基因Ⅰ及端粒逆转录酶及Nanog、STAT3、AP、Oct24、BMP4、PAX6、ADAM12、Nestin、HLA2Ⅰ。另外, HUMSCs低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40 和CD40 l等。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制,并抑制T细胞的增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性,表明其为一类免疫缺陷细胞,异基因移植不会发生免疫排斥反应。 3脐带间充质干细胞(UMSCs)的移植治疗作用: 骨髓MSCs用于改善心、脑功能的机制主要在于其分泌SDF一1和VEGF 等局部细胞因子, 诱导微血管的生成, 改善缺血组织微环境。UMSCs表达SDF 一1和VEGF, 提示了UMSCs治疗心脑梗塞、脊髓损伤的可能。 1)UMSCs对脑损伤的治疗作用 外源性UMSCs对脑组织的修复机理可能涉及到诱导内源性VEGF表达, 局部微血管增生, 抑制细胞凋亡等。利用液压冲击脑损伤模型, 证明
人脐血间充质干细胞来源的外泌体_分离鉴定及生物学特性_张娟
中国组织工程研究 第18卷 第37期 2014–09–03出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5955www.CRTER .org 张娟，女，1988年生，河北省玉田县人，汉族，内蒙古医科大学免疫学在读硕士，医师，主要从事干细胞的基础与临床应用研究。 通讯作者：王彩生，硕士，主任医师，内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031 并列通讯作者：魏来，博士，教授，北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.37.009 [https://www.wendangku.net/doc/883570107.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)37-05955-06 稿件接受：2014-07-31 Zhang Juan, Studying for master’s degree, Physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wang Cai-sheng, Master, Chief physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wei Lai, M.D., Professor, Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China Accepted: 2014-07-31 人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性 张 娟1，刘 峰2，张 薇2，丛 旭2，王彩生1， 3，魏 来2(1内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；2北京大 学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044；3呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031) 文章亮点： 1 研究发现间充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细胞间进行信息传递，进而通过某种机制发挥组织损伤修复作用。外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，含有来源细胞的膜蛋白成分，可以选择性地将含有的蛋白质、RNA 等递送至受体细胞，调节细胞间的信号传导。故可将间充质干细胞来源的外泌体开发成为一种既具有间充质干细胞的作用特点，又能规避其不良分化和肿瘤形成缺陷的新型治疗手段。因此，通过间充质干细胞来源的外泌体促进组织损伤修复是今后具有重要探讨价值的研究方向。 2 分离提取及鉴定外泌体是进行深入研究的基础，实验主要通过超滤及差速离心法分离出外泌体，通过透射电镜及流式鉴定相结合来鉴定，为后续的外泌体功能研究奠定基础。 3偏倚或不足：人脐血间充质干细胞源性外泌体生物学功能及相关机制还需要进一步分析；人脐血间充质干细胞的外泌体最终要移入体内研究，所以尚需建立动物模型。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；外泌体；人脐血间充质干细胞；分离鉴定；活性 主题词： 胎血；间质干细胞；外泌体；膜蛋白质类 摘要 背景：外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，越来越多的研究表明，间充质干细胞可能通过旁分泌外泌体而发挥对组织损伤的修复作用，目前人脐血间充质干细胞来源的外泌体分离鉴定尚未见报道。 目的：分离纯化人脐血间充质干细胞来源的外泌体，并鉴定其生物学特性。 方法：收集人脐血间充质干细胞培养上清，采用超滤及梯度离心法分离并纯化外泌体，通过透射电镜观察其形态，流式细胞术检测其表面标志 CD63、CD81、CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。 结果与结论：人脐血来源的间充质干细胞能够分泌外泌体，电镜下呈椭圆或碟状的囊泡结构，直径40-100 nm 。外泌体表达其共性表达标志CD63、CD81及间充质干细胞表面黏附分子CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。结果表明采用超滤及梯度离心法可以成功从间充质干细胞培养上清中分离纯化外泌体，间充质干细胞分泌的外泌体具有外泌体的胞膜蛋白组分。 张娟，刘峰，张薇，丛旭，王彩生，魏来. 人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性[J].中国组织工程研究，2014，18(37):5955-5960. Exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells: isolation, identification and biological characteristics Zhang Juan 1, Liu Feng 2, Zhang Wei 2, Cong Xu 2, Wang Cai-sheng 1, 3, Wei Lai 2 (1Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2 Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China; 3the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China) Abstract BACKGROUND: Exosomes are membrane vesicles secreted by mesenchymal stem cells. Increasing studies have shown that mesenchymal stem cells can secrete exosomes via paracrine function to play a role in tissue injury. However, reports on how to isolate and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells are few. OBJECTIVE: To extract, purify and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells. METHODS: The cell culture supernatant of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells was collected. Exosome was extracted and purified with ultrafiltration and gradient centrifugation methods. The morphology of exosome was observed by transmission electronic microscope, and the expressions of CD63, CD81, CD90, CD73, CD105, CD29, and CD166 in exosome of mesenchymal stem cells were analyzed by fluorescent activated cell sorting. RESULTS AND CONCLUSION: Mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood secreted exosome
人脐带间充质干细胞操作规范
人脐带间充质干细胞操作规范 一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2， 有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min; 2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1# 培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带 转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min; 5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿); 6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿; 7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液，将胶 体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有 血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中 须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动); 11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25% 胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min; 13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即 得到P0代脐带间充质干细胞;
脐带间充质干细胞(MSCS)抗衰老的临床实验
脐带间充质干细胞（MSCS）抗衰老的临床实验 作者：Simon Sun Isa Li 【摘要】目的：观察脐带间充质干细胞对人体衰老的影响和安全性，对比观察脐带间充质干细胞对衰老的逆转现象。方法：抽取20名健康人作为志愿者，进行脐带间充质干细胞静脉回输（其中男性6人，女性14人，年龄为50-80岁），实验组10名志愿者进行静脉滴注3个疗程脐带间充质干细胞，对照组滴注生理盐水。实验组和对照组志愿者均为双盲实验，疗程结束后3个月、6个月、12个月的对比观察。结论：治疗组有效率为90%，从外表、内分泌、精神状态、体能、睡眠均表现出有效性。 Abstract: Objective: To observe the effect and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) on human aging. Methods: a total of 20 healthy volunteers, of umbilical cord mesenchymal stem cells reinfusion (6 males, 14 females, aged 50-80 years old), the experimental group of 10 volunteers were intravenous infusion of 3 cycles of umbilical cord mesenchymal stem cells, the control group of normal saline drip. The experimental group and the control group were double blind experiment, 3 months after the end of treatment, and the observation of 6 months and 12 months. Conclusion: the effective rate of the treatment group was 90%, which was effective from the appearance, endocrine, mental state, physical fitness and sleep. 对抗衰老延长寿命是人类的梦想，但以往的方法以失败见终，究其原因均是不能针对衰老的根本原因所致。而人类衰老的原因一是衰老的细胞不能被代替，正常的新陈代谢因为干细胞的补充不足所致。随着干细胞和研究的发展，以及进行临床治疗中所带来的抗衰老表现，提示脐带间充质干细胞会对衰老的过程产生正影响，具有良好的市场应用价值。本实验就是采取双盲实验的方法来进行对证，验证MSCS对衰老的逆转影响。 脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应
人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进_李艳琪
中国组织工程研究 第18卷 第10期 2014–03–05出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 5, 2014 Vol.18, No.10 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1609www.CRTER .org 李艳琪，女，1988年生，山东省淄博市人，汉族，天津大学在读硕士，主要从事脐带间充质干细胞分离培养等方面的研究。 通讯作者：靳继德，博士，副研究员，军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 并列通讯作者：吴祖泽，研究员，中国科学院院士，天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市300072；军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.10.021 [https://www.wendangku.net/doc/883570107.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)10-01609-06 稿件接受：2014-01-18 Li Yan-qi, Studying for master’s degree, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China Corresponding author: Jin Ji-de, M.D., Associate investigator, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Corresponding author: Wu Chu-tse, Academician, Investigator, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Accepted: 2014-01-18 人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进 李艳琪1，王洪一2，姚 尧2，刘晶晶3，徐 潇2，张 宇2，刘 洋3，吴祖泽1， 4，靳继德4(1天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市 300072；2解放军沈阳军区总医院，辽宁省沈阳市 110016；3北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京市 100022；4军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039) 文章亮点： 在脐带干细胞的培养过程中，实验特色性的对传统的组织块贴壁法进行了改进，将传统组织贴壁法中本应丢 弃的组织转移到新的培养瓶中，进行二次贴壁培养，在较短时间内获得更多数量的间充质干细胞。通过二次 贴壁法得到的细胞经流式细胞仪检测符合间充质干细胞的特性，且增殖能力旺盛，具有体外多向分化潜能， 可成为临床研究和应用的细胞来源。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；脐带；间充质干细胞；分离培养；二次贴壁 主题词： 干细胞；脐带；间质干细胞；细胞培养技术 摘要 背景：脐带来源的间充质干细胞因其具有高度的自我更新和多向分化潜能，以及取材方便等优点而日益受到 关注。 目的：建立一种改进的人脐带间充质干细胞分离、培养方法，并对其生物学特性进行分析。 方法：无菌条件下获取足月妊娠分娩胎儿脐带，利用改良的组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞，即将 传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中进行二次贴壁培养，取第3代脐带间充质干细胞进行 生物学特性分析。 结果与结论：组织贴壁后第5-7天可见有梭形细胞从组织块边缘爬出，第10天左右可形成明显的细胞克隆。 将组织块转移到新培养瓶中继续培养，2 d 后即可见有细胞爬出，细胞生长速度较快，5 d 即可形成细胞克隆。 传代后的细胞形态均一，呈成纤维细胞样的长梭形。流式细胞仪检测细胞高表达CD90、CD105，不表达CD34、 CD45、HLA-DR 。细胞增殖能力旺盛，平均倍增时间为50 h 左右，41.24%的细胞处于G 2/S 期。体外可诱导 分化为成骨细胞和脂肪细胞。上述实验结果证明二次贴壁培养出的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性， 而且通过这种培养方法获得的原代间充质干细胞数是传统方式培养的2倍。 李艳琪，王洪一，姚尧，刘晶晶，徐潇，张宇，刘洋，吴祖泽，靳继德. 人脐带源间充质干细胞分离培养方法 的改进[J].中国组织工程研究，2014，18(10):1609-1614. An improved method for isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells Li Yan-qi 1, Wang Hong-yi 2, Yao Yao 2, Liu Jing-jing 3, Xu Xiao 2, Zhang Yu 2, Liu Yang 3, Wu Chu-tse 1, 4, Jin Ji-de 4 (1Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 2the General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; 3College of Life Sciences and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China; 4Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China) Abstract BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells with capabilities for self-renewal and multi-differentiation have attracted widespread attention. OBJECTIVE: To develop an efficient method for isolation and culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells, and to analyze the cell biological features. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from human umbilical cord by improved tissue cultivation. Immunophenotype and cell cycle were analyzed by flow cytometry. Growth curve was determined by MTT assay, and differentiation ability was evaluated by in vitro osteogenic and adipogenic induction as well. RESULTS AND CONCLUSION: Some fusiform cells crawled out from human umbilical cord tissues after cultivation for 5 days and formed colonies about 10 days later. When the removed tissues were further cultured, more cells appeared again within 2 days and formed colonies after 5 days. The isolated cells exhibited similar morphology of fibroblast-like shape after passage. Furthermore, the cells expressed CD90, CD105, but were negative for the markers of CD34, CD45, HLA-DR. Population doubling time of the cells calculated from the result of MTT was about 50 hours and cell cycle analysis showed that 41.24% cells were in the G 2/S phrase. Therefore, the isolated cells had a high prolification ability. In addition, the isolated cells could be induced into osteoblasts
脐带间充质干细胞培养方法
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.wendangku.net/doc/883570107.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.wendangku.net/doc/883570107.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化
【CN110050780A】冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910216830.0 (22)申请日 2019.03.21 (71)申请人 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公 司 地址 510000 广东省广州市开发区广州国 际生物岛螺旋四路一号生产区第五层 502单元 (72)发明人 陈海佳 葛啸虎 王小燕 杨祖婷 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 温可睿 赵青朵 (51)Int.Cl. A01N 1/02(2006.01) A61K 35/28(2015.01) A61P 19/02(2006.01) A61P 19/08(2006.01) (54)发明名称 冻存液及其在脐带间充质干细胞冻存中的 应用 (57)摘要 本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及冻存 液及其在脐带间充质干细胞冻存中的应用。 本发明提供的组合物，能够显著性的提高脐带间充质 干细胞在冻存条件下的活性，而以其制得的干细 胞制剂，具有良好的成骨分化、成软骨分化的潜 能，从而能够具有良好的修复软骨损伤的作用， 从而起到治疗骨关节炎的效果。权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 110050780 A 2019.07.26 C N 110050780 A
1.一种冻存液， 其由如下体积份的液体组成： 2.根据权利要求1所述的冻存液，其特征在于， 由如下体积份的液体组成； 3.根据权利要求1或2所述的冻存液，其特征在于， 所述人血白蛋白注射液中人血白蛋白的质量分数为20％； 所述葡萄糖注射液中葡萄糖的质量分数为5％； 所述羟乙基淀粉注射液中羟乙基淀粉的质量分数为6％。 4.权利要求1～3任一项所述的冻存液在脐带间充质干细胞冻存中的应用。 5.一种脐带间充质干细胞冻存方法，其特征在于，以权利要求1～3任一项所述的冻存液重悬脐带间充质干细胞。 6.根据权利要求5所述的冻存方法，其特征在于，所述重悬至细胞密度为5×107cells/mL。 7.权利要求1～3任一项所述的冻存液在制备干细胞制剂中的应用。 8.一种干细胞制剂，其包括：脐带间充质干细胞和权利要求1～3任一项所述的冻存液。 9.根据权利要求8所述的干细胞制剂，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的密度为5×107cells/mL。 10.权利要求7～9任一项所述的干细胞制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。 权 利 要 求 书1/1页2CN 110050780 A
脐带间充质干细胞的前世今生
脐带间充质干细胞的前世今生 概念：脐带间充质干细胞是以人脐带血血清为主体的培养体系的脐带间充质干细胞培养扩增的方法：流式细胞仪检测结果显示，贴壁细胞均表达CD44、CD29，低表达CD106，不表达造血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31，也不表达HLA-DR：细胞倍增时间为30h，细胞周期分析表明，G0～G1期和+G2+M期所占比例分别为78.84%和11.16%。结论：应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞，培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性，为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据。 分离培养方法：取新鲜健康脐带，用PBS冲洗干净后，用剪刀镊子剔去血管，剥出里面的华氏胶组织，将所得组织充分剪碎至 1 mm3大小，加入α-MEM培养液置于37℃，5%的CO2培养箱培养，培养液中含10% FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。脐带组织培养5-7天后，可见有部分细胞从组织块周围爬出，形态呈细小的梭形，一周后，细胞开始迅速增殖，形成大小不等的细胞集落，待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶消化传代。 优势：脐带间充质干细胞（MSCs）具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。有报道从人脐带中分离出MSCs，且细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低[2] ，并且具有取材方便，无伦理学争议等优点，因此越来越受到研究工作者们的关注。干细胞的培养体系主要应用含动物血清（如胎牛血清）的培养基，在此种环境下生长的干细胞，其内部结构会发生何种变化尚未可知，为避免含动物血清培养中病毒等病原体污染和异种血清所致的过敏反应，课题组进行了以人脐带血血清为主体的培养体系体外培养扩增脐带间充质干细胞的实验研究。以探讨人脐带血血清替代动物血清用于培养临床组织工程用干细胞的可行性。同时研究脐带间充质干细胞形态学、生长特性、细胞周期、免疫表型等特性，旨在建立脐带间充质干细胞的富集方法，为建立脐带间充质干细胞库和临床应用提供有力的理论依据。
脐带间充质干细胞研究进展
的表达及NAC的干预作用［J］.黑龙江医药科学，2005，28（6）：30-31. ［23］路浩，达剑森，梅莉，等.母鼠妊娠期铅镐联合暴露对仔鼠脑组织的氧化损伤及乙酰半胱氨酸的保护效应［J］.中国兽医 科学，2008，38（1）：42-45.［24］FLORA G J，SETH P K.Beneficial effects of S-adenosyl-Lme?thionine on aminolevulinic acid hydratase，glutathione and lipid peroxidation during acute lead-ethanol administration in mice ［J］.Alcohol，1999，18（2/3）：103-108. （收稿日期：2010-02-08 编辑：张素文） 脐带间充质干细胞研究进展 蒋洁1，张雪梅1，张建湘2 1怀化医学高等专科学校组织学与胚胎学教研室（湖南怀化418000）；2中南大学湘雅基础医学院组织学与胚胎学系（长沙410013） 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是来源于发育早期中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件控制下分化为神经细胞、成骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞等［1］，在细胞替代治疗及组织工程方面有极大的应用价值。目前，MSCs主要来源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代骨髓并可弥补其缺陷的间充质干细胞来源，已越来越受到各国学者的关注。脐带间充质干细胞作为一种多潜能干细胞，成功避开了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥、道德伦理等诸多限制，成为干细胞领域的研究热点。本文就近年来国内外在脐带间充质干细胞方面的相关研究进行总结和分析，对脐带间充质干细胞的分离培养、生物学特性以及分化能力等问题作简要综述。 1 脐带MSCs的来源与分离 1.1 脐带MSCs的来源 脐带中富含造血、间充质、神经及内皮等多种干/祖细胞［2］，其中间充质干细胞来源分4种：（1）来源于Wharton’s jelly（WJ）［3-4］；（2）来源于脐血管周围；（3）来源于脐血；（4）来源于脐静脉血管内皮下［5-6］。 KAVIANI等［7］研究发现脐带血可能含有与骨髓类似的MSCs。ERICES等［2］首次报道了从脐带血中分离培养出间充质样细胞，虽然其免疫表型和功能特点与骨髓来源的MSCs极为类似，但在处理的29份标本中只有7份表现为间充质样细胞（mesenchymal-like cell，MLC）。WEXLER等［8］研究发现脐血标本仅产生少量、非融合、异质的贴壁细胞层，这提示脐血中MSCs较稀少，脐血标本并不是MSC的丰富来源。GOODWIN等［9］认为可以从脐带血中分离出间充质样干细胞，但是培养时间较长，需要保持酸性培养环境。随着对脐带血间充质干细胞研究的深入，大家的结论也越来越趋于一致，脐血中的确存在着MSCs，但其所占比例较骨髓低的多，脐带血和外周血并非间充质干细胞的最佳来源。 另一方面，SARUGASER等［5］发现培养后的人脐带血管外周（HUCPV）细胞呈现较高水平的成纤维样集落形成（CFU-F），进行骨诱导后，细胞快速增殖并分化形成骨结节。COVAS等［10］从人脐带血管内皮和内皮下分离出形态学和免疫表型类似于BMSC的细胞，并表现出向脂肪和骨原分化的潜能。覆盖于WJ组织表面的脐带上皮（UCE）细胞被认为是来源于羊膜上皮组织。MIZOGUCHI等［11］对UCE 细胞进行分离培养时发现干细胞特征的细胞，该细胞不仅表达单层和黏液上皮角蛋白，而且还表达复层上皮角蛋白，能够转化和表达表皮细胞的表型。 1.2 脐带MSCs的分离 脐带间充质干细胞的培养并非易事，特别是如何快速、高效地从脐带中获得MSCs以满足基础和未来临床研究的需要是一个亟待解决的问题。 目前，间充质干细胞的体外分离方法主要有：（1）贴壁培养筛选法；（2）密度梯度离心法；（3）流式细胞仪或免疫磁珠分选法。贴壁培养筛选法主要是利用MSCs对培养瓶具有较强的黏附能力，而造血系细胞、内皮细胞等不贴壁，在以后的换液中逐渐被弃去，达到分离纯化干细胞的目的。密度梯度离心法是根据MSCs与其他细胞的密度不同来进行分离，如广泛采用的Percoll密度梯度离心法。随着对MSCs表面抗原认识的深入，也有人利用免疫方法如流式细胞仪分选法、免疫磁珠法等分离MSCs，此方法是根据细胞大小不同或细胞表面的一些特殊标志进行分离。在贴壁培养筛选法方面，酶消化法的使用较为广泛。如WANG等［4］将去除脐血管的脐带组织，用刀片刮除WJ组织，胶原酶消化16h，培养3d后可观察到成纤维样细胞生长。SARUGASE等［5］将包裹WJ基质的脐血管两端用缝线结扎呈环状，于胶原酶消化获得的细胞进行培养，倒置相差显微镜下可以观察到星形的成纤维样细胞。ROMANOV等［12］通过对脐带血管系统行酶消化，获得血管内皮和内皮下混合细胞群体，培养7d后可观察到成纤维样细胞。 2 脐带MSCs的生物学特性 2.1 细胞形态与增殖特性 取脐带间质组织剪碎后经酶消化，细胞贴壁后观察细胞形态呈长的扁平的梭形，类似成纤维细胞，传代后的细胞形态无明显变化［4］。MA等［13］将人脐带WJ行组织块培养，原代培养时间为10~14d，传代后增殖速度较快，但细胞传至9代后增殖速度减慢。而MITCHELL等［14］对猪脐带WJ中的MSCs进行了研究，细胞传至80代时仍未呈现衰老趋势，也未表现出生长加速。相关研究表明，脐带血管内皮经过消化获得的细胞呈贴壁生长，细胞培养24h后，可观察到2种形态的贴壁细胞：数量较多的鹅卵石样形态细胞，与血管内皮细胞相似；数量较少的纺锤状成纤维瘤样细胞，证实为MSCs的前体细胞。脐带MSCs在体外培养体系中能快速增殖，传代后3~5d能增殖